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Coordenadoria de Biotecnologia Curso de Bioquímica Prática: Cinética enzimática Alunos: Bruna Vitor, Guilherme Melo, Layz Nunes, Victor de Mello Turma: BM151 Professores: Ana Carolina Cassano e Michelle Castro Data da realização da prática: 17/11/2011 e 24/11/2011 Data da entrega do relatório: 1/11/2011 Avaliação: Critério: Nota: Apresentação Introdução Objetivos Métodos Resultados Discussão Bibliografia Total: Sumário 1) Introdução 3 2) Material e Métodos 4 3) Objetivos 9 4) Resultados 9 5) Discussão 21 6) Conclusão 24 7)Bibliografia 25 Introdução Enzimas são substâncias normalmente de natureza proteica que agem como catalisadoras em reações que normalmente levariam muito tempo para ocorrer, ou até não ocorreriam. Esta função de catálise ocorre pois a enzima consegue reduzir a energia de ativação necessária para que uma reação ocorra. A maior parte das enzimas conhecidas está presente no organismo dos seres vivos, participando de seu metabolismo, no entanto a capacidade catalítica de certas enzimas torna-as adequadas para a utilização em processos industriais. As enzimas são extremamente específicas em relação à reação na qual elas atuam devido à sua estrutura especial, que contém um centro ativo onde o substrato interage com a enzima. A habilidade da enzima de se ligar a um substrato é denominada “atividade biológica” e depende principalmente da estrutura tridimensional da enzima e da natureza do substrato. Devido à essa dependência da estrutura tridimensional, as enzimas possuem uma sensibilidade à grandes variações de temperatura ou pH, que podem causar sua desnaturação e a inativação de suas funções biológicas. A velocidade com que a reação catalisada por uma enzima irá ocorrer depende de diversos fatores: a concentração do substrato assim como a da enzima, o pH e a temperatura do meio. Geralmente um aumento nas concentrações tanto do substrato como da enzima geram um aumento na velocidade da reação. No entanto, caso a concentração de substrato seja muito elevada em relação à de enzima, é possível que as enzimas fiquem saturadas, tendo todos os seus sítios ativos ocupados em determinado instante. A partir deste ponto um aumento na concentração de substrato, sem aumento na concentração de enzima, não irá aumentar a velocidade da reação. Além disso, a atividade enzimática normalmente restringe-se a uma pequena faixa de pH. Isto se deve ao fato de que as mudanças no pH geram variações no estado de ionização dos componentes da enzima. Geralmente as enzimas possuem muitos grupos ionizáveis, e fora do seu pH ótimo de atuação a ionização destes grupos inativa os sítios de ligação com o substrato. A temperatura influencia as reações enzimáticas de duas maneiras: primeiramente ocorre um aumento de velocidade proporcional ao aumento de temperatura, porém isso também gera um aumento na instabilidade da proteína, levando à desnaturação e à consequente perda da atividade enzimática. Toda enzima possui uma temperatura ótima na qual atinge a atividade máxima, em temperaturas maiores a velocidade da reação começa a cair devido ao processo de desnaturação. Também existem substâncias denominadas inibidores que tem como função reduzir a velocidade de determinada reação. No caso de reações catalisadas por enzimas, os inibidores geralmente atuam de alguma forma na enzima, reduzindo sua atividade. Os inibidores podem ser de dois tipos principais, reversíveis ou irreversíveis. Dentre os inibidores reversíveis, existem quatro tipos: inibidores competitivos, não competitivos, acompetitivos e mistos. Os inibidores competitivos possuem estrutura semelhante a do substrato e reduzem a velocidade da reação ao ligarem-se nos sítios ativos das enzimas, impedindo assim com que ela se ligue ao substrato. Já os não competitivos ligam-se a radicais que não pertencem ao grupo ativo da enzima, essa ligação gera uma mudança estrutural que inviabiliza a catálise. Os inibidores acompetitivos também ligam-se a radicais que não pertencem ao grupo ativo da enzima, no entanto, enquanto que os não competitivos podem ligar-se tanto à enzima ou ao complexo enzima-substrato, os inibidores acompetitivos só ligam-se ao complexo enzima-substrato. A inibição mista assemelha-se à inibição não competitiva, porém neste caso o complexo enzima-inibidor-substrato possui atividade enzimática residual. Os inibidores irreversíveis ligam-se ao centro ativo da enzima e formam ligações covalentes ou peptídicas com ele, inativando permanentemente a enzima. Material Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5 Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM tampão Tris-HCl pH 9,5 Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5 Solução de Na2HPO4 0,4 mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampão Tris-Pi-HCl) Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5 Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5 Solução de NaOH 2 M Solução de enzima: fosfatase alcalina 2 g/mL (Sigma Fine Chemicals - EC 3.1.3.1) Pipetador automático 20 - 200 L (Gilson) 2 Pipetas de 1 mL 2 Pipetas de 2 mL Pipeta de 5 mL 2 Pipetas de 10 mL 2 Pró-pipetes 22 Tubos de ensaio Vortex (QL-901) Banho de gelo (0 oC) Banho-maria (37 oC) – (Biomatic) Banho-maria (68 oC) – (Tisatom) 16 Cubetas Espectrofotômetro (Biospectro –Espectrofotômetro SP -220) Métodos Construção da curva padrão de PNP: Utilizando-se a pipeta de 2 mL com o auxílio do pró-pipete foi feita a transferência de alíquotas da solução de PNP para tubos de ensaio numerados de 1 a 6 nesta sequência: 0,3 mL; 0,6 mL; 0,9 mL; 1,2 mL; 1,5 mL e 1,8 mL. Em seguida, utilizando-se uma pipeta de 5 mL, adicionou-se uma alíquota de 3,2 mL de tampão Tris-HCl ao tubo identificado como B (branco) e as seguintes alíquotas do mesmo tampão aos tubos numerados de 1 a 6: 2,9 mL; 2,6 mL; 2,3 mL; 2,0 mL; 1,7 mL e 1,4 mL. Então utilizando-se a pipeta de 1 mL adicionou-se uma alíquota de 1,0 mL da solução de NaOH a cada um dos tubos. Utilizou-se o vórtex para a homogeneização das soluções e em seguida foi feita a leitura da absorbância utilizando-se o espectrofotômetro. Curso temporal: Transferiu-se, com o auxílio de uma pipeta de 10,0 mL e um pró-pipete, as seguintes alíquotas para um Erlenmeyer de 100,0 mL: - 20,0 mL de tampão Tris-HCl - 10,0 mL de PNPP Em seguida incubou-se o Erlenmeyer contendo a solução resultante em um banho-maria a 37 oC por 5 minutos e após este tempo adicionou-se 2,0 mL de enzima fosfatase alcalina. Retirou-se uma alíquota de 3,2 mL da solução que foi colocada no tubo marcado como B (branco) e novamente incubou-se o Erlenmeyer no banho-maria a 37 oC. Iniciou-se a contagem do tempo e retiraram-se alíquotas de 3,2 mL da solução para ser colocada nos tubos de 1 a 8 nos seguintes tempos: 3 minutos, 6 minutos, 9 minutos, 12 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos e 45 minutos. Após a retirada de cada alíquota adicionou-se 1,0 mL da solução de NaOH no tubo. Assim que foi retirada a última alíquota e foi adicionado NaOH a ela foi feita a leitura dos valores de absorbância no espectrofotômetro, utilizando o tubo branco para a calibração do aparelho. Influência do pH: Transferiu-se, com o auxílio da pipeta e do pró-pipete, alíquotasdas soluções indicadas para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo: Tubo no Solução tampão Citratato-HCl (mL) Solução tampão Tris-HCl (mL) Solução tampão Borato-NaOH (mL) PNPP 1mM (mL) pH 5,5 pH 6,5 pH 7,5 pH 7,5 pH 8,5 pH 9,5 PH 9,5 pH 10,5 pH 11,5 B 1 2,0 1,0 B 2 2,0 1,0 B 3 2,0 1,0 1 2,0 1,0 2 2,0 1,0 3 2,0 1,0 4 2,0 1,0 5 2,0 1,0 6 2,0 1,0 7 2,0 1,0 8 2,0 1,0 9 2,0 1,0 Incubou-se os tubos em banho-maria a 37 oC durante 5 minutos e, após este tempo, utilizando-se um pipetador automático, adicionou-se 0,2 mL de enzima a cada um dos tubos marcados de 1 a 9, com intervalo de 30 segundos. Em seguida utilizou-se o vórtex para homogeneizar os tubos e foram incubados em banho-maria a 37 oC por 15 minutos. Após o término destes 15 minutos, utilizando-se uma pipeta e um pró-pipete, adicionou-se uma alíquota de 1,0 mL de NaOH a cada um dos tubos marcados de 1 a 9, com intervalo de 30 segundos entre cada tubo. Então adicionou-se a mesma alíquota de NaOH aos tubos brancos, desta vez sem intervalo entre cada tubo, seguido pela adição de 0,2 mL da enzima utilizando-se o pipetador automático. Em seguida homogeneizou-se todos os tubos e procedeu-se a leitura espectrofotométrica, utilizando os tubos brancos de cada tampão como referência para calibração do aparelho. Influência da temperatura: Transferiu-se, com auxílio da pipeta e do pró-pipete, alíquotas de 2,0 mL da solução de tampão Tris-HCl e 1,0 mL da solução de PNPP para tubos de ensaio rotulados de 1 a 4 e de B1 (primeiro tubo branco) a B4. Os tubos foram colocados em incubação durante 5 minutos em diferentes temperaturas para cada tubo: 1 e B1 – 0 oC 2 e B2 – temperatura ambiente 3 e B3 – 37 oC 4 e B4 – 68 oC Após a incubação, utilizando-se o pipetador automático adicionou-se 0,2 mL de enzima a cada um dos tubos de 1 a 4, em intervalos de 30 segundos. Foi feita a homogeneização dos tubos com o vórtex em seguida e colocou-se novamente os tubos em suas respectivas temperaturas por 15 minutos. Ao término destes 15 minutos adicionou-se uma alíquota de 1,0 mL de NaOH a cada um dos tubos utilizando-se a pipeta e um pró-pipete. Nos tubos brancos também foi adicionado 0,2 mL de enzima após a adição do NaOH. Realizou-se a homogeneização dos tubos no vórtex novamente e foi feita a leitura no espectrofotômetro. Curva de Substrato Transferiram-se, com o auxílio da pipeta e do pró-pipete, alíquotas das soluções de tampão Tris-HCl e PNPP para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo: Tubo n0 Tampão Tris-HCl pH 9,5 PNPP 1 mM (mL) B 2,9 0,1 1 2,9 0,1 2 2,8 0,2 3 2,7 0,3 4 2,6 0,4 5 2,4 0,6 6 2,2 0,8 7 2,0 1,0 8 1,8 1,2 9 1,5 1,5 10 1,2 1,8 11 0,9 2,1 12 0,6 2,4 13 0,3 2,7 Em seguida os tubos foram incubados a 37 oC durante 5 minutos. Após este tempo utilizou-se um pipetador automático para adicionar 0,2 mL de enzima aos tubos numerados de 1 a 9 com intervalos de 30 segundos entre cada tubo. Ao adicionar a enzima ao último tubo eles foram homogeneizados com o vórtex e novamente colocados no banho-maria a 37 oC por 15 minutos. Ao término destes 15 minutos, adicionou-se 1,0 mL de NaOH a cada um dos tubos com intervalos de 30 segundos e também adicionou-se 0,2 mL da enzima ao tubo branco após ter sido adicionado o NaOH. Em seguida foi realizada a homogeneização dos tubos novamente e a leitura dos dados espectrofotométricos. Influência do inibidor: Com o auxílio de uma pipeta e um pró-pipete retiraram-se alíquotas das soluções de tampão Tris-PI-HCl e PNPP que foram colocadas em tubos de ensaio rotulados segundo a tabela abaixo: Tubo n0 Tampão Tris-PI-HCl pH 9,5 PNPP 1 mM (mL) B 2,9 0,1 1 2,9 0,1 2 2,8 0,2 3 2,7 0,3 4 2,6 0,4 5 2,4 0,6 6 2,2 0,8 7 2,0 1,0 8 1,8 1,2 9 1,5 1,5 10 1,2 1,8 11 0,9 2,1 12 0,6 2,4 13 0,3 2,7 Em seguida os tubos foram incubados em banho-maria a 37 oC durante 5 minutos. Após este tempo utilizou-se um pipetador automático para adicionar 0,2 mL de enzima aos tubos numerados de 1 a 9 com intervalos de 30 segundos entre cada tubo. Ao adicionar a enzima ao último tubo eles foram homogeneizados com o vórtex e novamente colocados no banho-maria a 37 oC por 15 minutos. Ao término destes 15 minutos, adicionou-se 1,0 mL de NaOH a cada um dos tubos com intervalos de 30 segundos e também adicionou-se 0,2 mL da enzima ao tubo branco após ter sido adicionado o NaOH. Em seguida foi realizada a homogeneização dos tubos novamente e a leitura dos dados espectrofotométricos. Objetivos Observar o efeito de fatores físicos (pH e temperatura) e químicos (concentração e presença de inibidor) sobre uma reação catalisada pela enzima fosfatase alcalina. Resultados Os resultados obtidos na prática, foram organizados nas seguintes tabelas: Construção de uma curva padrão de PNP Calculo de n° nmoles de PNP: [PNP] = 0,1mM = 1,0 x105 nM 1,0 x 105 nmoles PNP ----- 1000mL X ----- VPNP mL X = VPNP x 102 Tubo n° Solução padrão de PNP (mL) Tampão Tris-HCl, pH 9,5 (mL) Solução de NaOH 2M (mL) ABS. 405 nm nmoles de PNP B - 3,2 1,0 1 0,3 2,9 1,0 0,142 30,00 2 0,6 2,6 1,0 0,287 60,00 3 0,9 2,3 1,0 0,408 90,00 4 1,2 2,0 1,0 0,495 120,00 5 1,5 1,7 1,0 0,646 150,00 6 1,8 1,4 1,0 0,745 180,00 Influencia do pH Tu bo n° Solução tampão Citrato-HCl (mL) Solução tampão Tis-HCl (mL) Solução tampão Borato-NaOH (mL) PNPP 1mM (mL) Enzima (mL) NaOH (mL) ABS. 405 nm nmoles de PNP Vo (nmoles/min) pH 5,5 PH 6,5 pH 7,5 PH 7,5 pH 8,5 PH 9,5 pH 9,5 pH 10,5 PH 11,5 B1 2,0 1,0 0,2 1,0 B2 2,0 1,0 0,2 1,0 B3 2,0 1,0 0,2 1,0 1 2,0 1,0 0,2 1,0 0,056 12,64 7,90x10-1 2 2,0 1,0 0,2 1,0 0,070 15,80 9,88 x10-1 3 2,0 1,0 0,2 1,0 0,061 13,77 8,61 x10-1 4 2,0 1,0 0,2 1,0 0,147 33,18 20,7 x10-1 5 2,0 1,0 0,2 1,0 0,254 57,33 35,8 x10-1 6 2,0 1,0 0,2 1,0 0,452 102,03 63,7 x10-1 7 2,0 1,0 0,2 1,0 0,061 13,77 8,61 x10-1 8 2,0 1,0 0,2 1,0 0,059 13,32 8,33x10-1 9 2,0 1,0 0,2 1,0 0,031 7,00 4,38 x10-1 Como y = a x , onde “y” é a absorbância, “a” é 4,43 x 10-3 e “x” o n° de nmoles de PNP, pode ser calculado o n° de nmoles de PNP presente em cada tubo após a paralisação da reação enzimática: Tubo 1 : ABS = 0,056 0,056 = 4,43 x10-3 . x1 x1 = 12,64 Tubo 2: ABS = 0,070 0,070 = 4,43 x10-3 . x2 x2 = 15,80 Tubo 3 : ABS = 0,061 0,061 = 4,43 x10-3 . x3 x3 = 13,77 Tubo 4 : ABS = 0,147 0,147 = 4,43 x10-3 . X4 x4 = 33,18 Tubo 5 : ABS = 0,254 0,254 = 4,43 x10-3 . x5 x5 = 57,33 Tubo 6 : ABS = 0,452 0,452 = 4,43 x10-3 . x6 x6 = 102,03 Tubo 7 : ABS = 0,061 0,061 = 4,43 x10-3 . x7 x7 = 13,77 Tubo 8 : ABS = 0,059 0,059 = 4,43 x10-3 . x8 x8 = 13,32 Tubo 9 : ABS = 0,031 0,031 = 4,43 x10-3 . x9 x9 =7,00 Sabendo o número de nmoles de PNP pode ser calculada a velocidade da reação, dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no cálculo foi de 16 minutos.Foi acrescentado 1 minuto a mais além do tempo de reação teórico para contar o tempo que foi usado para o transporte dos tubos até o banho maria e qualquer eventual atraso que ocorreu na prática: Tubo 1 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 12,64 / 16 Vo = 12,64 Tubo 2 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 15,80 / 16 Vo = 9,88 x10-1 Tubo 3 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 13,77 / 16 Vo = 8,61 x10-1 Tubo 4 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 33,18 / 16 Vo = 20,7 x10-1 Tubo 5 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 57,33 / 16 Vo = 35,8 x10-1 Tubo 6 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 102,06 / 16 Vo = 63,7 x10-1 Tubo 7 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 13,77 / 16 Vo = 8,61 x10-1 Tubo 8 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 13,32 / 16 Vo = 8,33x10-1 Tubo 9 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 7,00 / 16 Vo = 4,38 x10-1 Influencia da temperatura Tubo n° Tampão Tis-HCl pH 9,5 PNPP 1Mm (mL) Temperatura (°C) Enzima (mL) Solução de NaOH (mL) ABS. 405 nm nmoles de PNPP Vo (nmoles/min) 1B 0,2 1,0 4 0,2 1,0 1 0,2 1,0 4 0,2 1,0 0,112 25,28 15,80 x10-1 2B 0,2 1,0 Ambiente 0,2 1,0 2 0,2 1,0 Ambiente 0,2 1,0 0,285 64,33 40,21x10-1 3B 0,2 1,0 37 0,2 1,0 3 0,2 1,0 37 0,2 1,0 0,400 90,29 56,43 x10-1 4B 2,0 1,0 68 0,2 1,0 4 2,0 1,0 68 0,2 1,0 0,158 35,67 22,30 x10-1 Como y = a x , onde “y” é a absorbância, “a” é 4,43 x 10-3 e “x” o n° de nmoles de PNPP, pode ser calculado o n° de nmoles de PNPP presente em cada tubo após a paralisação da reação enzimática: Tubo 1 : ABS = 0,112 0,112 = 4,43 x10-3 . x1 x1 = 25,28 Tubo 2: ABS = 0,285 0,285 = 4,43 x10-3 . x2 x2 = 64,33 Tubo 3 : ABS = 0,400 0,400 = 4,43 x10-3 . x3 x3 = 90,29 Tubo 4 : ABS = 0,158 0,158 = 4,43 x10-3 . X4 x4 = 35,67 Sabendo o número de nmoles de PNP pode ser calculada a velocidade da reação, dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no cálculo foi de 16 minutos.Foi acrescentado 1 minuto a mais além do tempo de reação teórico para contar o tempo que foi usado para o transporte dos tubos até o banho maria e qualquer eventual atraso que ocorreu na prática: Tubo 1 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 25,28 / 16 Vo = 15,80 x10-1 Tubo 2 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 64,33 / 16 Vo = 40,21x10-1 Tubo 3 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 90,29 / 16 Vo = 56,43 x10-1 Tubo 4 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 35,67 / 16 Vo = 22,30 x10-1 Curso temporal Tubo n° NaOH 2M (mL) Tempo de incubação (min) Alíquota do meio de reação (mL) ABS. 405 nm nmoles de PNP B 1,0 0 3,2 1 1,0 3 3,2 0,056 12,64 2 1,0 6 3,2 0,138 31,15 3 1,0 9 3,2 0,205 46,95 4 1,0 12 3,2 0,235 53,05 5 1,0 15 3,2 0,294 66,37 6 1,0 20 3,2 0,380 85,78 7 1,0 30 3,2 0,557 125,73 8 1,0 45 3,2 0,782 176,52 Como y = a x , onde “y” é a absorbância, “a” é 4,43 x 10-3 e “x” o n° de nmoles de PNPP, pode ser calculado o n° de nmoles de PNPP presente em cada tubo após a paralisação da reação enzimática: Tubo 1 : ABS = 0,056 0,056 = 4,43 x10-3 . x1 x1 = 12,64 Tubo 2: ABS = 0,138 0,138 = 4,43 x10-3 . x2 x2 = 31,15 Tubo 3 : ABS = 0,205 0,205 = 4,43 x10-3 . x3 x3 = 46,95 Tubo 4 : ABS = 0,235 0,235 = 4,43 x10-3 . X4 x4 = 53,05 Tubo 5 : ABS = 0,294 0,294 = 4,43 x10-3 . X4 x5 =66,37 Tubo 6 : ABS = 0,380 0,380 = 4,43 x10-3 . X4 x6 = 85,78 Tubo 7 : ABS = 0,557 0,557 = 4,43 x10-3 . X4 x7 = 125,73 Tubo 8 : ABS = 0,782 0,782 = 4,43 x10-3 . X4 x8 = 176,52 Curva de substrato Tubo n° Tampão Tris-HCl pH 9,5 PNPP 1mM (mL) Enzima (mL) Soluçao de NaOH (mL) ABS. 405 nm nmoles de PNPP Vo (nmoles/min) B 2,9 0,1 0,2 1,0 1 2,9 0,1 0,2 1,0 0,147 33,18 2,074 2 2,8 0,2 0,2 1,0 0,284 64,11 4,007 3 2,7 0,3 0,2 1,0 0,354 79,91 4,994 4 2,6 0,4 0,2 1,0 0,376 84,88 5,305 5 2,5 0,6 0,2 1,0 0,450 101,58 6,349 6 2,2 0,8 0,2 1,0 0,536 120,99 7,562 7 2,0 1,0 0,2 1,0 0,553 124,83 7,802 8 1,8 1,2 0,2 1,0 0,591 133,41 8,338 9 1,5 1,5 0,2 1,0 0,636 143,57 8,973 10 1,2 1,8 0,2 1,0 0,663 149,66 9,354 11 0,9 2,1 0,2 1,0 0,646 145,82 9,114 12 0,6 2,4 0,2 1,0 0,695 156,88 9,805 13 0,3 2,7 0,2 1,0 0,676 152,60 9,538 Como y = a x , onde “y” é a absorbância, “a” é 4,43 x 10-3 e “x” o n° de nmoles de PNPP, pode ser calculado o n° de nmoles de PNPP presente em cada tubo após a paralisação da reação enzimática: Tubo 1 : ABS = 0,147 0,147 = 4,43 x10-3 . x1 x1 = 33,18 Tubo 2: ABS = 0,284 0,284 = 4,43 x10-3 . x2 x2 = 64,11 Tubo 3 : ABS = 0,354 0,354 = 4,43 x10-3 . x3 x3 = 79,91 Tubo 4 : ABS = 0,376 0,376 = 4,43 x10-3 . X4 x4 = 84,88 Tubo 5 : ABS = 0,450 0,450 = 4,43 x10-3 . X4 x5 =101,58 Tubo 6 : ABS = 0,536 0,536 = 4,43 x10-3 . X4 x6 = 120,99 Tubo 7 : ABS = 0,553 0,553 = 4,43 x10-3 . X4 x7 = 124,83 Tubo 8 : ABS = 0,591 0,591 = 4,43 x10-3 . X4 x8 = 133,41 Tubo 9 : ABS = 0,636 0,636 = 4,43 x10-3 . X4 x9 = 143,57 Tubo 10 : ABS = 0,663 0,663 = 4,43 x10-3 . X4 x10 = 149,66 Tubo 11 : ABS = 0,646 0,646 = 4,43 x10-3 . X4 x11 = 145,82 Tubo 12 : ABS = 0,695 0,695 = 4,43 x10-3 . X4 x12 = 156,88 Tubo 13 : ABS = 0,676 0,676 = 4,43 x10-3 . X4 x13 = 152,60 Sabendo o número de nmoles de PNP pode ser calculada a velocidade da reação, dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no cálculo foi de 16 minutos.Foi acrescentado 1 minuto a mais além do tempo de reação teórico para contar o tempo que foi usado para o transporte dos tubos até o banho maria e qualquer eventual atraso que ocorreu na prática: Tubo 1 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 33,18 / 16 Vo = 20,74 x10-1 Tubo 2 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 64,11 / 16 Vo = 40,07 x10-1 Tubo 3 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 79,91 / 16 Vo = 49,94 x10-1 Tubo 4 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 84,88 / 16 Vo = 53,05 x10-1 Tubo 5 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 101,58 / 16 Vo = 63,49 x10-1 Tubo 6 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 120,99 / 16 Vo = 75,62 x10-1 Tubo 7 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 124,83 / 16 Vo = 78,02 x10-1 Tubo 8 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 133,41 / 16 Vo = 83,38 x10-1 Tubo 9 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 143,57 / 16 Vo = 89,73 x10-1 Tubo 10 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 149,66 / 16 Vo = 93,54 x10-1 Tubo 11 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 145,82 / 16 Vo = 91,14 x10-1 Tubo 12 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 156,88 / 16 Vo = 98,05 x10-1 Tubo 13 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 152,60 / 16 Vo = 95,37 x10-1 A concentração do substrato presente, foi calculada da seguinte forma para todos os volumes adicionados: Volume total é de 4,2 mL Tubo 1 : 1 mmol –- 1000mL 1x10-4 mmol – 4,2 mL X –- 0,1 mL Y --- 1000 mL X = 1x10-4mmol de substrato Y= 2,38 x10-2 mmol = 2,38 x 104 nmol /L Tubo n° PNPP 1mM (mL) [Substrato] (nmol/L) 1/ [Substrato] (nmol/L) 1 0,1 2,38 x104 4,20 x 10-5 2 0,2 4,76 x104 2,10 x 10-5 3 0,3 7,14 x104 1,40 x 10-5 4 0,4 9,52 x104 1,05 x 10-5 5 0,6 14,29 x104 0,70 x 10-5 6 0,8 19,05 x104 0,52 x 10-57 1,0 23,81 x104 0,42 x 10-5 8 1,2 28,57 x104 0,35 x 10-5 9 1,5 35,71 x104 0,28 x 10-5 10 1,8 42,86 x104 0,23 x 10-5 11 2,1 50,00 x104 0,20 x 10-5 12 2,4 57,14 x104 0,18 x 10-5 13 2,7 64,29 x104 0,16 x 10-5 Influencia do inibidor Tubo n° Tampão Tris-PI-HCl pH 9,5 PNPP 1mM (mL) Enzima (mL) Soluçao de NaOH (mL) ABS. 405 nm nmoles de PNPP Vo (nmoles/min) B 2,9 0,1 0,2 1,0 1 2,9 0,1 0,2 1,0 0,039 8,80 0,550 2 2,8 0,2 0,2 1,0 0,057 12,87 0,804 3 2,7 0,3 0,2 1,0 0,076 17,16 1,072 4 2,6 0,4 0,2 1,0 0,116 26,18 1,636 5 2,4 0,6 0,2 1,0 0,140 31,60 1,975 6 2,2 0,8 0,2 1,0 0,182 41,08 2,568 7 2,0 1,0 0,2 1,0 0,230 51,92 3,245 8 1,8 1,2 0,2 1,0 0,260 58,70 3,669 9 1,5 1,5 0,2 1,0 0,332 74,94 4,684 10 1,2 1,8 0,2 1,0 0,411 92,78 5,799 11 0,9 2,1 0,2 1,0 0,448 101,13 6,320 12 0,6 2,4 0,2 1,0 0,519 117,16 7,322 13 0,3 2,7 0,2 1,0 0,563 127,09 7,943 Como y = a x , onde “y” é a absorbância, “a” é 4,43 e “x” o n° de nmoles de PNPP, pode ser calculado o n° de nmoles de PNPP presente em cada tubo após a paralisação da reação enzimática: Tubo 1 : ABS = 0,039 0,039 = 4,43 x10-3 . x1 x1 = 8,80 Tubo 2: ABS = 0,057 0,057 = 4,43 x10-3 . x2 x2 = 12,87 Tubo 3 : ABS = 0,076 0,076 = 4,43 x10-3 . x3 x3 = 17,16 Tubo 4 : ABS = 0,116 0,116 = 4,43 x10-3 . X4 x4 = 26,18 Tubo 5 : ABS = 0,140 0,140= 4,43 x10-3 . X4 x5 =31,60 Tubo 6 : ABS = 0,182 0,182= 4,43 x10-3 . X4 x6 = 41,08 Tubo 7 : ABS = 0,230 0,230= 4,43 x10-3 . X4 x7 = 51,92 Tubo 8 : ABS = 0,260 0,260= 4,43 x10-3 . X4 x8 = 58,70 Tubo 9 : ABS = 0,332 0,332= 4,43 x10-3 . X4 x9 = 74,94 Tubo 10 : ABS = 0,411 0,411= 4,43 x10-3 . X4 x10 = 92,78 Tubo 11 : ABS = 0,448 0,448= 4,43 x10-3 . X4 x11 = 101,13 Tubo 12 : ABS = 0,519 0,519= 4,43 x10-3 . X4 x12 = 117,16 Tubo 13 : ABS = 0,563 0,563= 4,43 x10-3 . X4 x13 = 127,09 Sabendo o número de nmoles de PNP pode ser calculada a velocidade da reação, dividindo o numero de nmoles pelo tempo. O tempo usado no cálculo foi de 16 minutos.Foi acrescentado 1 minuto a mais além do tempo de reação teórico para contar o tempo que foi usado para o transporte dos tubos até o banho maria e qualquer eventual atraso que ocorreu na prática: Tubo 1 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 8,80/ 16 Vo = 5,50 x10-1 Tubo 2 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 12,87/ 16 Vo = 8,04 x10-1 Tubo 3 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 17,16/ 16 Vo = 10,72 x10-1 Tubo 4 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 26,18/ 16 Vo = 16,36 x 10-1 Tubo 5 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 31,60 / 16 Vo = 1,975 Tubo 6 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 41,08/ 16 Vo = 2,56 Tubo 7 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 51,92/ 16 Vo = 3,24 Tubo 8 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 58,70 / 16 Vo = 3,67 Tubo 9 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 74,94/ 16 Vo = 4,68 Tubo 10 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 92,78/ 16 Vo = 5,80 Tubo 11 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 101,13/ 16 Vo = 6,32 Tubo 12 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 117,16/ 16 Vo = 7,32 Tubo 13 : Vo = n° nmoles de PNP / tempo Vo = 127,09/ 16 Vo = 7,94 A concentração de substrato nos tubos da prática de curva de substrato com inibidor é a mesma concentração nos tubos da prática de curva de substrato sem inibidor já que o volume de reagentes adicionados ao tubo é obrigatoriamente o mesmo. Discussão: Os gráficos construídos à partir dos dados obtidos na prática estão anexados no final do relatório. Influencia do pH Com base nos resultados obtidos e com a construção do gráfico, pode-se concluir que o tampão de pH ideal para a reação da enzima usada é o tampão Tris-HCl de pH 9,5 já que foi onde houve a maior medida de absorbância, por ter sido onde a maior quantidade de produtos foi gerada comparado aos outros tampões de pH diferentes.Pode-se discutir também quem o íon do tampão utilizado também influencia na reação já que a solução com o tampão Borato-NaOH de pH 9,5 apresentou uma absorbância baixa, logo uma baixa formação de produto. Vemos então que tanto a faixa de pH do tampão quanto o íon primário do tampão influenciam diretamente na formação de produto da reação. Influencia da temperatura A temperatura ideal da enzima usada ( fosfatase alcalina ) é de 37°C por ter sido onde houve a maior medida de absorbância, indicando que foi quando a maior quantidade do produto PNP foi gerada na reação.Pode-se refletir então que esta reação catalisada pela enzima atinge sua maior velocidade na temperatura corpórea, demonstrando como a enzima fosfatase alcalina é importante para as reações de remoção de fosfato no corpo. Curso temporal Baseado na absorbância medida, percebeu-se que quanto maior o tempo de reação entre PNPP com a enzima fosfatase alcalina, maior é a quantidade de produto PNP formado.Sabe-se que após determinado tempo de reação, esta não possui nenhum aumento em sua velocidade, isto é, sua velocidade torna-se praticamente constante.Não foi observado tal zona de estagnação, então podemos concluir que a a velocidade máxima da reação é atingida após 45 minutos. Curva de substrato Baseando-se nos resultados obtidos pode-se concluir que a velocidade da reação é proporcional à concentração de substrato até certo ponto, no qual toda a enzima presente na solução está saturada e a velocidade permanecerá a mesma a não ser que seja adicionada mais enzima.No gráfico construído à partir dos dados obtidos na prática não foi possível visualizar o momento de velocidade máxima da reação de forma clara porém estima-se que este momento tem o seu princípio à partir do ponto onde a concentração do substrato é 42,86 x 10-5 mol/L e a velocidade da reação é 9,538 (mais precisamente na solução do tubo 13).A partir desse ponto é possível ver uma área onde o valor da velocidade cai e sobe para depois cair novamente. Influencia do inibidor Com base nos resultados, percebeu-se que quanto menor era a quantidade de inibidor presente no meio, maior era a medida da absorbância, ou seja, maior era a quantidade de produto PNP formada a partir da reação de PNPP com a enzima fosfatase alcalina. É notório também que à partir de um determinado ponto a diferença entre as medidas de absorbância da curva de substrato sem inibidor em comparação com as medida da curva de substrato com inibidor diminuiam, isto é, as velocidades ficavam cada vez mais próximas.Esse detalhe mostra que o momento de velocidade máxima da reação se aproxima, de forma que, em certo ponto, independente da presença de inibidor ou não, a reação vai atingir sua velocidade máxima graças à alta concentração de substrato na solução. Gráfico do método Duplo Recíproco , Velocidade máxima e o Km Foi construído o gráfico do método Duplo Recíproco usando os valores de 1/V0 e 1/[Substrato]. O gráfico foi construído de tal forma que o eixo y apresentava os valores de 1/V0 e o eixo x os valores de 1/[Substrato].Os valores foram os seguintes Curva de substrato sem inibidor 1/V0 (nmoles / min) 1/[Substrato] (nMol/L) 0,4822 4,20 x 10-5 0,2496 2,10 x 10-5 0,2002 1,40 x 10-5 0,1885 1,05 x 10-5 0,1575 0,70 x 10-5 0,1322 0,52 x 10-5 0,1282 0,42 x 10-5 0,1199 0,35 x 10-5 0,1114 0,28 x 10-5 0,1069 0,23 x 10-5 0,1097 0,20 x 10-5 0,1019 0,18 x 10-5 0,1045 0,16 x 10-5 Curva de substrato com inibidor 1/V0 (nmoles / min) 1/[Substrato] (nMol/L) 1,82 4,20 x 10-5 1,24 2,10 x 10-5 0,93 1,40 x 10-5 0,61 1,05 x 10-5 0,51 0,70 x 10-5 0,39 0,52 x 10-5 0,30 0,42 x 10-5 0,27 0,35 x 10-5 0,21 0,28 x 10-5 0,17 0,23x 10-5 0,16 0,20 x 10-5 0,14 0,18 x 10-5 0,13 0,16 x 10-5 Após confeccionado o gráfico pode-se montar uma função linear para cada uma das curvas, no intuito de descobrir a velocidade máxima e o Km de cada curva. A função de cada curva foi obtida utilizando o programa de computador Microsoft Excel 2011.As funções foram : Função da curva de substrato s/inibidor Função da curva de substrato c/inibidor Y = 9,01 x 103 * X + 0,0861 Y = 4,40 x 104 * X + 0,1309 Sabe-se que o inverso da velocidade máxima pode ser calculado achando o valor de Y onde o valor de x = 0 (quando a reta corta o eixo Y).Dessa forma, tendo como modelo a função Y = AX + B , Y = B, logo: Para a curva de substrato sem inibidor: 1 / Vmax = B = 0,0861 Vmax = 1 / 0,0861 Vmax = 11,61 nmoles/min Para curva de substrato com inibidor: 1 / Vmax = B = 0,1309 Vmax = 1 / 0,1309 Vmax = 7,64 nmoles/min Já para calcularmos o valor de Km, ou seja, a concentração necessária para se chegar à metade da velocidade máxima, é necessário achar o módulo do inverso do valor de X onde o valor de Y = 0 (quando a reta corta o eixo x).Temos então que : Para a curva de substrato sem inibidor: |1/Km| = X = -0,0861 / 9,01 x 103 = - 9,56 x 10-6 Km = 1/9,56 x 10-6 Km = 10,46 x 105 nMol/L Para curva de substrato com inibidor: |1/Km| = X = -0,1309 / 4,40 x 104 = - 2,98 x 10-6 Km = 1/2,98 x 10-6 Km = 3,36 x 105 nMol/L Vemos então que tanto a velocidade máxima quanto o Km diminuem com a adição do inibidor na reação. Conclusão: Nesta prática analisou-se a influência de agentes químicos (concentração de substrato e presença do inibidor), físicos(pH e temperatura) e do tempo de reação em uma reação enzimática. No caso do pH, observou-se que quanto maior o pH do tampão ácido ,maior a velocidade da reação, logo mais produto foi formado.No entanto, nem sempre um tampão de pH alto irá beneficiar a formação de produto.O tampão de pH alto Borato-NaOH não contribui para a reação. A temperatura também é um fator fundamental, pois a velocidade da reação aumenta de acordo com a temperatura até alcançar a sua temperatura ideal, pois ao passar dela, a velocidade regride, logo, menos formação de produto.Vale notar que a temperatura ideal da enzima é a temperatura corporal, fato que demonstra a importante eficiência da enzima na catalização das reações no nosso corpo. O tempo de reação também influencia na reação pois quanto maior o tempo de reação, maior a quantidade de produto formado.No entanto, em um certo ponto, não haverá mais formação de produto.Vimos que esse ponto se encontra após os 45 minutos de reação porque até os 45 ainda há produção de PNP. É possível observar também que o inibidor exerce uma forte interação na velocidade da reação.Este diminui a velocidade da reaçao por concentração de substrato usado na mesma e também diminuia a velocidade máxima e o Km da reação.Pode-se concluir então que ele é um inibidor acompetitivo. Bibliografia http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/cinetica_enzimatica.pdf http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/inibidores.htm NELSON, D.L.; COX, M.M.;Princípios da Bioquímica de Lehninger. 5ª edição. Editora Sarvier/ Artmed. São Paulo. 2010.
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