glicolise pratica apostila DBQ

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Cursos Práticos em Bioquímica 244
 
TEORIA DA PRÁTICA 
 
FERMENTAÇÃO 
I- PRODUÇÃO DE ETANOL POR CÉLULAS 
DE Saccharomyces cerevisiae A PARTIR DE 
MOSTO CONTENDO GLICOSE 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Conceito: 
 
O termo fermentação, no sentido mais amplo possível, pode ser definido como todo o processo no qual microorganismos catalisam a conversão de uma dada substância em um determinado produto, ainda passível de sofrer oxidação. Se tal transformação leva à 
formação de um excreta útil e economicamente vantajoso poderá ser utilizada 
industrialmente. A fermentação industrial é então a exploração racional da atividade metabólica 
do microorganismo. 
 
Considerações gerais sobre os processos fermentativos 
 
A fabricação de vinhos, cervejas, pão e queijo é utilizada pelo homem desde antes da era cristã. 
O conhecimento sobre os microorganismos, sua nutrição e reprodução é, entretanto, 
relativamente recente. A utilização desses conhecimentos científicos permite então uma escolha 
mais adequada de nutrientes, condições e até de microorganismos mais aptos a produzir uma 
dada substância de interesse industrial de forma econômica. 
Certas substâncias molecularmente complexas como por exemplo: enzimas, antibióticos e 
vitaminas, cuja obtenção por síntese química é bastante onerosa, e às vezes até impossível, são 
obtidas de forma economicamente viável, através de processos fermentativos. 
A indústria de fermentação encontra-se hoje em dia em expansão e os processos fermentativos 
apresentam-se, algumas vezes, com possibilidade de desenvolvimento, tanto do ponto de vista do 
microorganismo (agente de fermentação) - objeto de estudo da microbiologia e bioquímica - 
como também do ponto de vista do processo em si - objeto de estudo da engenharia bioquímica. 
 
Considerações gerais sobre o metabolismo 
 
Praticamente todas as células conhecidas metabolizam glicose e várias outras hexoses através da 
via glicolítica. Esta via metabólica é composta de uma sequência de 10 reações catalisadas por 
diferentes enzimas e, resumidamente, é via de conversão de glicose em piruvato. Seus produtos 
são, além do piruvato, duas moléculas de ATP e duas de NADH. O ATP produzido será 
rapidamente utilizado em processos celulares que demandem energia, isto é, serão reconvertidas 
em ADP+Pi, que são substratos necessários para a via glicolítica tenha continuidade. O NADH 
deve ser re-oxidado a NAD+, para que a via glicolítica possa continuar operando. O esquema a 
seguir mostra os possíveis destinos do piruvato. 
 
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Metabolismo 245
 
Glicólise
Glicose
Frutose-1,6-bisfosfato
2 Piruvato
2 ATP
2 ADP
4 ADP
4 ATP
2 NAD+
2 NADH
Fermentação
Alcoólica
(anaeróbica)
Oxidação
(aeróbica)
Fermentação
Homolática
(anaeróbica)
Ciclo de
Krebs
6 O22 NADH
Fosforilação Oxidativa
2 NAD+ 6 H2O
6 CO22 Lactato 2 CO2 + 2 Etanol
2 NAD+
2 NADH
2 NAD+
2 NADH
O
CH2OH
Glicólise
Glicose
Frutose-1,6-bisfosfato
2 Piruvato
2 ATP
2 ADP
4 ADP
4 ATP
2 NAD+
2 NADH
Fermentação
Alcoólica
(anaeróbica)
Oxidação
(aeróbica)
Fermentação
Homolática
(anaeróbica)
Ciclo de
Krebs
Ciclo de
Krebs
6 O22 NADH
Fosforilação Oxidativa
2 NAD+ 6 H2O
6 CO22 Lactato 2 CO2 + 2 Etanol
2 NAD+
2 NADH
2 NAD+
2 NADH
2 NAD+
2 NADH
2 NAD+
2 NADH
O
CH2OH
 
 
x� Em presença de oxigênio e de uma cadeia de transporte de elétrons operante (a cadeia ocorre 
nas mitocôndrias de organismos eucarióticos e na membrana plasmática de procarióticos), o 
piruvato será oxidado no ciclo de Krebs e o NADH será re-oxidado na cadeia de transporte de 
elétrons, sendo o O2 o aceptor final destes elétrons. Os produtos finais são CO2 e H2O . 
x� Para que a via glicolítica possa prosseguir na ausência de O2 ou da cadeia de transporte de 
elétrons operante é necessário que o NADH seja re-oxidado de outras formas. Dependendo do 
tipo de célula, o mais comum é que esta molécula seja oxidada em reações catalisadas por 
enzimas do tipo desidrogenase, produzindo lactato ou etanol. 
 
 
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Em nosso organismo há células que fermentam glicose produzindo lactato. Por exemplo, quando 
submetido a exercício extenuante, o músculo esquelético (músculos de movimento voluntário, que 
recobrem o esqueleto) não recebem suprimento de O2 suficiente para re-oxidar o NADH em suas 
mitocôndrias. Desta forma, fermentam e produzem lactato, que é excretado para a corrente 
sanguínea. Os eritrócitos, células que transportam O2 em nosso sangue, não possuem mitocôndrias. 
Fermentam a glicose produzindo 100g de lactato por dia 
 
Classificação da fermentação: 
 
Os processos fermentativos são classificados de diversas maneiras: 
 
Ÿ�Quanto ao tipo de processo 
Ÿ�Quanto à cinética. 
 
Entretanto, do ponto de vista estritamente bioquímico pode-se classificá-los apenas como: 
 
Anaeróbicos: onde o aceptor de H+ e elétrons liberados nas reações de oxi-redução que ocorrem 
intracelularmente é um metabólito (substâncias orgânica) 
 Exemplos: fermentação alcoólica, fermentação láctica. 
 
Aeróbicos: onde o aceptor de H+ e elétrons é o O2 molecular. 
 Exemplos: fermentação acética, fermentação cítrica. 
 
 
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA 
 
Importância 
 
A fermentação alcoólica é importante não só na fabricação de bebidas como vinho, cerveja, 
cachaça, e outros mas também para fabricação do álcool industrial. O etanol tornou-se, com a 
crise do petróleo da década de 70, uma opção como combustível. Além disso, é possível antever 
sua utilização para formação de etileno e butadieno, matérias primas para a indústria de plástico. 
Compreende-se, então, o enorme interesse que desperta a melhoria do processo, dos agentes de 
fermentação utilizados e das condições de retificação do álcool obtido. 
 
Matéria prima 
 
As matérias primas utilizadas na indústria de fermentação alcoólica são originadas direta ou 
indiretamente da agricultura - ou seja - a partir dos chamados recursos renováveis. A escolha da 
matéria prima e outros aditivos para compor o mosto (meio de cultura que se destina à operação 
industrial de transformação de uma substância em excreta útil) é ponto de fundamental 
importância para a indústria da fermentação. A matéria prima deve conter um substrato utilizável 
pelo microorganismo, ser de fácil obtenção e estocagem. 
As matérias primas para a produção de álcool podem ser: 
 
Sacaríneas: possuem como substrato açúcares solúveis (mono e dissacarídeos). Ex: 
Melaço - resíduo da cristalização do açúcar; principal substrato: sacarose 
Caldo de cana - principal substrato: sacarose 
O caldo de cana é hoje utilizado devido à importância econômica do Etanol 
Sucos de frutas - substratos: sacarose, glicose e frutose 
 
 
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Metabolismo 247
As matérias primas sacaríneas podem ser diretamente consumidas pelo agente de fermentação 
(geralmente leveduras do gênero Saccharomyces); as leveduras são capazes de assimilar tanto 
glicose como frutose e outros monossacarídeos; a sacarose é assimilada sofrendo uma prévia 
hidrólise pela enzima invertase, existente nesses microorganismos. 
Amiláceas: substrato fermentável é o amido. Altos teores de amido são encontrados em raízes 
(batata e mandioca) e grãos (trigo, milho, cevada e centeio) 
 
As leveduras utilizadas no processo de fabricação do álcool não possuem enzimas capazes de 
hidrolisar o amido. Uma das perspectivas, ainda em fase de pesquisa, é a introdução de genes 
que codificam essas enzimas no genoma de leveduras (objeto de estudo da Engenharia 
Genética). 
O tratamento prévio que sofrem as matérias primas amiláceas é denominado de Sacarificação do 
Amido e consiste na transformação do amido em matéria primafermentável. A sacarificação do 
amido pode ser feita de várias formas: 
 
Ÿ�por via química - consiste na hidrólise em presença de H2SO4 5% sob pressão de 2 atm., por 2 
horas. Há conversão do amido em glicose, mas apresenta como inconvenientes o alto custo e a 
corrosão que promove nos equipamentos; além disso, exige neutralização para que possa ser 
utilizada e o sal resultante leva a um baixo rendimento na fermentação. 
 
Ÿ�por via enzimática - usam-se as preparações amilolíticas presentes nos grãos (malte) ou 
enzimas extraídas de fungos e bactérias (amiloglicosidase e amilases, respectivamente). 
(Vide hidrólise ácida e enzimática do amido - Cap. Glicídeos) 
 
Celulósicas: substrato - celulose. Assim como para o amido, é necessária uma hidrólise prévia 
da celulose para que os monossacarídeos e/ou oligossacarídeos liberados possam ser assimilados 
pelo microorganismo. Esta hidrólise pode ser feita: 
 
Ÿ�por via química - através de tratamento com H2SO4 à quente sob pressão. Este tipo de 
tratamento é feito na Alemanha e na Rússia; no Brasil, está sendo aplicado em escala piloto 
(em Lorena - SP). É um tratamento drástico que envolve a hidrólise ácida da madeira e a 
utilização da lignina como coque metalúrgico. Estão sendo feitos, nos EUA, estudos sobre a 
utilização deste tratamento para obtenção de glicose e etanol a partir da celulose do papel e 
papelão existentes no lixo urbano. 
 
Ÿ�por via enzimática - este procedimento requer um pré-tratamento da matéria prima para 
aumentar a digestibilidade do substrato à enzima e, em que pesem os esforços realizados, 
ainda não foi possível utilizá-lo industrialmente. 
É importante ressaltar que a diversidade de bebidas alcoólicas existentes no mercado decorre, 
inicialmente, do tipo da matéria prima utilizada (sacarínea ou amilácea) e, posteriormente, do 
tratamento a que é submetida a bebida (destilação, tempo de maturação, dentre outros). 
 
Agentes de Fermentação 
 
Só no final do século passado identificou-se o microorganismo responsável pela transformação 
do açúcar em Etanol. Em todos os casos as leveduras do gênero Saccharomyces são as mais 
utilizadas, especificamente as da espécie S.carlsbergensis (para cerveja) e S.ellipsoideus (para 
vinho). Embora na fabricação, por exemplo, de vinho caseiro se utilize a flora mista presente na 
própria uva, procura-se a nível industrialusar linhagens puras e selecionadas. Os organismos 
normalmente utilizados como agentes de fermentação são anaeróbicos facultativos. 
 
 
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Cursos Práticos em Bioquímica 248
 
Características do processo 
 
T = 25-30 oC 
Como o processo é exotérmico, as dornas (equipamento onde ocorre a 
fermentação) exigem sistema de refrigeração 
 
pH - 4,5-5,0 
Como durante o processo, há produção de CO2, com conseqüente queda 
do pH, são necessárias correções. 
 
Tensão de Oxigênio Anaerobiose ou baixa aeração 
 
 
 
Fundamento Bioquímico 
 
O procedimento de fermentação ocorre em anaerobiose e do ponto de vista bioquímico, a 
produção de etanol ocorre unicamente para que haja a reoxidação do NADH produzido na via 
glicolítica. 
Se à levedura é dado como nutriente um glicídeo como por exemplo a sacarose, vamos ter 
primeiro a hidrólise desta à glicose e frutose e posteriormente a absorção dos monossacarídeos. 
Se o glicídeo for glicose, como é o caso da prática, ocorre logo a absorção. Os glicídeos 
transportados entram na via glicolítica. Assim: 
 
 
Esta é a equação de Gay-Lussac, que permite o cálculo do rendimento da fermentação. O 
rendimento de um processo fermentativo pode ser definido como sendo a quantidade de produto 
obtido em relação à quantidade de matéria prima introduzida na dorna, ou àquela consumida no 
processo ('P/'S ou 'P/'So). Para o etanol: 
 
Glicose o 2 Etanol + 2 CO2 
1 mol de Glicose o 2 mol de Etanol + 2 mol de CO2 (1)
180g o 92g + 88g 
 
 
 
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Metabolismo 249
 
O rendimento teórico (correspondente à relação estequiométrica entre glicose e etanol) seria 
92/180 = 0,511 (Rendimento Gay-Lussac) 
Como parte do açúcar consumido resulta em produtos secundários, não é possível atingir o 
rendimento Gay-Lussac ('P/'S de 0,511). Pasteur, no laboratório em condições ideais, 
conseguiu atingir o máximo de 95-96% do rendimento teórico ('P/'S = 0,485), definindo 
o chamado Rendimento Pasteur, valor muitas vezes tomado como referência para os cálculos 
de rendimentos industriais. As operações industriais não são realizadas com os cuidados 
adotados por Pasteur; portanto, o Rendimento Pasteur de 100% também não é atingido. 
De qualquer forma, o cálculo do rendimento é largamente utilizado pelas indústrias de 
fermentações alcoólica, láctica, acética, acetonobutílica, cítrica, por exemplo. Não é aplicável, 
entretanto, aos produtos das fermentações resultantes de biossínteses, como antibióticos e 
vitaminas, onde não se conhece com exatidão a proporção e os substratos utilizados diretamente 
para a síntese. 
 
Outros parâmetros importantes são: 
 
Ÿ�Eficiência do processo fermentativo - relação percentual entre o peso do produto realmente 
obtido no processo fermentativo e o peso do produto previsto estequiometricamente (peso 
teórico). 
Em relação ao Etanol, de acordo com a equação (1) o peso do produto estequiométrico pode 
ser calculado por: 
180 g de glicose fornecerão 92 g de etanol (relação estequiométrica), isto é, 
180g o 92 g ou ainda: 
'S o P sendo 'S a quantidade de glicose consumida e P a quantidade de produto esperado 
da transformação de toda a glicose em etanol e gás carbônico. 
A eficiência do processo seria P real obtido /P teórico x 100 onde P é a quantidade de etanol 
formado. 
Ÿ�Eficiência da instalação industrial - relação percentual entre o peso do produto obtido após 
as fases de fermentação, recuperação e purificação e o peso teórico do produto previsto 
estequiometricamente. 
Ÿ�Produtividade - quantidade de produto formado por unidade de tempo e de volume de meio 
(g de produto/ l.h). 
 
Industrialmente, a concentração de glicídeos presentes é avaliada utilizando-se o Densímetro de 
Brix, em cuja escala 0o corresponde à água pura e 100o corresponde a uma solução de sacarose 
100 g/100 mL. Os valores obtidos são dados em peso de sólidos em suspensão por 100 mL de 
volume. Já o álcool formado é avaliado por meio do Alcoômetro de Gay-Lussac em que 0o 
corresponde à água pura e 100o corresponde ao etanol anidro. Os valores obtidos são dados em 
volume de álcool por volume de meio. 
Após a fermentação as células são separadas do mosto por decantação, centrifugação, e outros e 
reutilizadas por um dado número de vezes em um novo processo fermentativo. 
 
Destilação 
 
A destilação é uma operação industrial que permite a separação de componentes de uma mistura 
por uma sucessão de vaporizações e condensações; o composto mais volátil se concentra no 
vapor. 
Tratando-se de indústria de bebida alcoólica, esta operação poderá existir ou não, dependendo do 
tipo de bebida que se deseja fabricar. Bebidas como vinho e cerveja são chamadas bebidas 
fermentadas e não sofrem destilação, apresentando um teor alcoólico mais baixo que as 
chamadas bebidas destiladas (entre 3 e 5 % para cerveja e cerca de 9-12 % para vinhos). As 
 
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Cursos Práticos em Bioquímica 250
bebidas destiladas como por exemplo: cachaça, rum, whisky, gim, são obtidas por destilação do 
mosto após a fermentação. A destilação é diferente para cada caso mas, em geral, é lenta para 
evitar que haja arraste de produtos secundários que alterem o sabor e cheiro da bebida. A 
concentração de etanol nestas bebidas é mais elevada e está situada para cachaça entre 45 e 50%. 
No caso de fabricação do álcool industrial, esta operação de destilação é importante e muito 
complexa. 
A separaçãoda mistura Et-OH : H2O é realizada em colunas, com refluxo, e a operação recebe 
então o nome de retificação. A coluna é alimentada com o "vinho" (nome genérico do mosto já 
fermentado) a ser fracionado e o fracionamento vai depender de uma série de fatores; entre eles, 
a altura da coluna - o aumento do tamanho facilita a separação. No entanto, o etanol e a água 
formam um azeótropo de mínimo (uma mistura que apresenta uma composição de 95% de etanol 
e 5% de água com um ponto de ebulição próprio) e, caso se disponha de uma boa coluna de 
retificação, esta será a composição do destilado obtido. O enriquecimento em álcool desta 
mistura requer outro tipo de tratamento em etapa posterior. O resíduo obtido após a destilação é 
denominado vinhoto (ou vinhaça). 
 
 
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Metabolismo 251
 
ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
FERMENTAÇÃO 
I- PRODUÇÃO DE ETANOL POR CÉLULAS DE 
Saccharomyces cerevisiae 
A PARTIR DE MOSTO CONTENDO GLICOSE 
 
 
MATERIAL 
Ÿ� Mosto utilizado: meio YED (1,4 % extrato de levedo - 14 % glicose) 
Ÿ� Agente fermentativo: Fermento Fleischmann - suspensão 67% (peso úmido/volume) 
Ÿ� Solução de glicose padrão - 10 Pmol/mL 
Ÿ� Ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) em solução alcalina 
Ÿ� Fluoreto de sódio (NaF) 
Ÿ� Banho termostatado 
Ÿ� Espectrofotômetro 
Ÿ� Balança 
Ÿ� Destilador 
Ÿ� Centrífuga 
Ÿ� Banho de gelo 
 
OBJETIVO 
 
Ÿ� Calcular a eficiência de uma fermentação de glicose por células de S.cerevisiae através da 
medida da produção de etanol e de CO2 e do consumo de glicose. 
Ÿ� Verificar o poder de inibição do NaF (inibidor da enolase) no processo fermentativo. 
 
PROCEDIMENTO 
 
Produção de CO2 e consumo de glicose 
 
Ÿ� Transferir para erlenmeyer de 250 mL, 35 mL de meio YED e 15mL da suspensão celular a 
67%. Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar uma alíquota de 3,0 mL para tubo de 
centrífuga que deverá conter ..... mL de água gelada. Pesar rapidamente o frasco. 
Ÿ� Centrifugar a alíquota previamente retirada, transferir o sobrenadante para outro tubo e 
conservá-lo em banho de gelo. O erlenmeyer inoculado é colocado em agitador rotatório à 
temperatura ambiente. 
Ÿ� Em intervalos de .... min, pesar o frasco para calcular a quantidade de CO2 desprendido. 
Ÿ� Ao final de ..... min, retirar uma alíquota de ..... mL do meio para novo tubo de centrífuga, 
que deverá conter ..... mL de água destilada gelada. O sobrenadante será usado para 
quantificar a glicose presente no final do processo de fermentação. 
Ÿ� Neste mesmo tempo, centrifugar, pelo menos, 20 mL do meio. O sobrenadante deverá ser 
destilado para a determinação do etanol. 
 
 
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Cursos Práticos em Bioquímica 252
 
Inibição da fermentação por NaF 0,05 M 
 
Ÿ� Em um erlenmeyer de 250 mL preparar 35 mL de meio YED 14% contendo 15 mL de 
suspensão celular a 67% e 0,105 g de NaF. Agitar, anotar o tempo e imediatamente retirar 
uma alíquota de 3,0 mL para tubo de centrífuga. Pesar rapidamente o frasco. 
Ÿ� Seguir o mesmo procedimento adotado anteriormente. 
Ÿ� Calcular o grau de inibição provocada pelo NaF 0,05 M após 1 hora de fermentação 
 
Destilação do etanol 
 
Ÿ� Do sobrenadante tomar 10 mL e colocar no compartimento para amostra do destilador, 
adicionar em seguida 10 mL de H2O e 0,5 mL de NaOH 0,1 N (o hidróxido de sódio é 
colocado para evitar a destilação de álcoois superiores). Fechar o sistema e recolher os 8 mL 
iniciais do destilado que conterão todo o etanol presente na amostra. Completar este volume a 
10 mL com exatidão. Determinar o teor de etanol pelo método do dicromato. 
Ÿ� Diluir ___ vezes uma alíquota dos sobrenadantes (tempos 0 e _____ minutos) e determinar a 
quantidade de glicose consumida pelo método do DNS. 
 
Preencher as tabelas abaixo com os resultados obtidos. 
 
CO2 produzido: 
 
Erlenmeyer 
tempo (min) 
Peso de A 
(g) 
Peso de B 
(g) 
CO2 
(g) 
0 
 
 
 
 
 Erlenmeyer A – controle; Erlenmeyer B em presença de NaF 
 
Glicose Consumida: 
 
A B [Gli] em A [Gli] em B Erlenmeyer 
tempo 
(min) 
Dil 
(x) 
Alíq 
(ml) 
Abs 
Dil 
(x) 
Alíq 
(ml) 
Abs (mM) (%) (mM) (%) 
 
 
 
 
 
 
Ÿ� Calcular o rendimento e a eficiência da fermentação a partir da quantidade de CO2 produzido 
em relação à quantidade de glicose consumida. 
 
 
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Metabolismo 253
 
ROTEIRO DE PRÁTICA 
 
FERMENTAÇÃO 
DETERMINAÇÃO DO ÁLCOOL 
PELO MÉTODO DO DICROMATO 
 
 
REAGENTES 
Ÿ�Solução padrão de dicromato de potássio: 33,816 g K2Cr2O7 dissolvidos em litro 
de água. 
Ÿ�H2SO4 concentrada 
Ÿ�H3PO4 85 % 
Ÿ�Indicador: 0,5 g de sal de bário do ácido 4-difenilamina-sulfônico dissolvido em 
100 mL H2O. O líquido sobrenadante é usado. 
Ÿ�Solução de sulfato ferroso amoniacal: 135,1 g de FeSO4(NH4)2SO4.6H2O, 20 mL 
de H2SO4 concentrado são dissolvidos em H2O e completados à 1 litro. 
 
 
PROCEDIMENTO 
 
Ÿ�10 mL da solução de dicromato são colocados em 3 frascos cônicos, adicionando-se, em 
seguida, 5 mL de H2SO4 concentrado, resfriando-se em água de bica corrente 
Ÿ�Colocar em cada frasco 5,0; 2,5 e 1,0 mL do destilado e completar o volume à 5,0 mL de 
água, quando for o caso. PARA O DESTILADO DO FRASCO CONTENDO FLUORETO 
DE SÓDIO, BASTA FAZER A ALÍQUOTA DE 5 mL. 
Obs: São usadas alíquotas por não se conhecer previamente a concentração de etanol na 
amostra. 
Ÿ�Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 minutos para o etanol ser quantitativamente levado 
à ácido acético. 
Ÿ�Após os 15 minutos, adicionar 165 mL de água destilada, 18 mL de ácido fosfórico e 0,5 mL 
da solução do Indicador. 
Ÿ�Titular com sulfato ferroso amoniacal até a cor da solução mudar de púrpura para verde e 
anotar o volume consumido (n) 
Ÿ�Para o ensaio em Branco adicionar 5,0 mL de água destilada em lugar da amostra e repetir o 
procedimento. Anotar o volume consumido (N). 
 
 
REAÇÃO 
 
2Cr2O7
-2 + 12Fe2+ + 14H+ o 4Cr3+ + 12Fe3+ + 14H2O 
 
2Cr2O7
-2 + 3C2H5OH + 16H
+ o 4Cr3+ + 3C2H4O2 + 11H2O 
 
 
 
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Cursos Práticos em Bioquímica 254
 
Expressões para o cálculo do conteúdo de etanol 
 
 
¹¸
·
©¨
§ � 
N
n
A 12 quando se usa 5,0 mL do destilado 
 
¹¸
·
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§ � 
N
n
A 14 quando se usa 2,5 mL do destilado 
 
¹¸
·
©¨
§ � 
N
n
A 110 quando se usa 1,0 mL do destilado 
 
onde A = concentração de etanol na amostra original (%) 
 
 
 
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