Aula 3 Farmácia 2012.2

Prévia do material em texto

O “SEGREDO DO GENOMA” 
QUAIS GENES SÃO EXPRESSOS? 
 
QUANDO SÃO EXPRESSOS? 
CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA 
Controle da expressão gênica pode ser exercido em diferentes etapas 
Transcrição: fita codante x fita molde 
mRNA é complementar à fita molde, e “igual à fita codante” 
Transcrição envolve o desenovelamento de pequenas regiões do DNA 
Estrutura do RNA mensageiro: procariotos 
Procariotos: transcrição e tradução são acopladas 
Estrutura do RNA mensageiro: eucariotos 
mRNA sofre modificações pós transcricionais: estabilidade 
CAP poliA 
Sharp e Roberts 1977, descoberta do Splicing 
Splicing Alternativo gera proteínas diferentes a partir do 
mesmo gene 
Proteínas geradas por splicing alternativo tem funções variadas 
Genes podem ser constitutivos ou podem ser regulados 
Genes constitutivos estão sendo transcritos o tempo todo 
Genes regulados são ligados e desligados: 
- durante o desenvolvimento (espacial e/ou temporal) 
- em resposta a estímulos externos 
 
Estrutura do gene em eucariotos 
Eucariotos: RNA Pol II precisa de fatores auxiliares para se ligar ao DNA 
e iniciar a transcrição 
Expressão basal 
RNA Pol II precisa de fatores de transcrição que regulam sua atividade 
To enhance – aumentar, melhorar, realçar 
Enhancer - indutor 
Expressão 
basal 
N
ív
e
l 
d
e
 e
x
p
re
s
s
ã
o
 
Idade, localização, estresse... 
Indução 
Repressão 
Regulação da expressão gênica: transcrição 
Controle da Expressão do gene de B-Globina humano: vários 
fatores de transcrição, regulação tanto na região 5’ como 3’ 
A expressão gênica diferencial é responsável pela morfologia das 
diferentes células 
Célula A 
Célula C Célula B 
B 
A 
B+ C 
A + B + C 
A + B 
A + C 
C 
Expressão gênica 
Padrões de expressão 
Identificação de elementos regulatórios em promotores de 
genes vegetais 
Identificação de elementos regulatórios de fatores de 
transcrição em vegetais 
Identificação de elementos regulatórios: gene AIP1 
Gene reporter: uma ferramenta fundamental para o 
estudo da expressão gênica 
Promotor dirige a expressão do gene, ele determina, quando, 
como, onde e com que força o gene é expresso 
Promotor + gene reporter 
Promotor Gene 
produto 
? Como estudar a regulação do gene? 
Produto facilmente 
visível 
-Enzimas oxidativas usadas na bioluminescência 
 
luciferin + ATP → luciferyl adenylate + PPi 
luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + AMP + LUZ 
 
-Exemplo mais conhecido: 
luciferase do vagalume Photinus pyralis 
Tipos de gene reporter usados em vegetais: 
 luciferase 
1986: luciferase de vaga-lumes são 
enxertados em folhas de tabaco. As 
folhas começam a brilhar. 
Tipos de gene reporter usados : 
beta-glucuronidase (GUS) 
 
Enzima da bactéria Escherichia coli, que quando incubada com alguns 
substratos específicos - sem cor ou não fluorecentes - podem transformá-los 
em coloridos ou fluorescentes. 
 
 
Substratos: 
-5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc): 
ensaio histoquímico, gerando produto azul 
 
-p-nitrophenyl β-D-glucuronide : 
para ensaio espectrofotométrico 
 
- 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide (MUG) : 
para ensaio fluorimétrico 
Expressão em resposta ao estímulo ambiental 
Regulação espacial e temporal 
Ensaio histoquímico de beta-glucuronidase (GUS) 
Localização tecidual 
Tipos de gene reporter : 
 green fluorescent protein (GFP) 
 
-Primeira GFP isolada da água viva Aequorea victoria. 
 
- A GFP de A. victoria tem o pico maior de excitação em 395 nm e o pico de 
emissão em 509 nm, que é a região verde menor no espectro de luz visível. 
Color Frequency Wavelength 
violet 668–789 THz 380–450 nm 
blue 631–668 THz 450–475 nm 
cyan 606–630 THz 476–495 nm 
green 526–606 THz 495–570 nm 
yellow 508–526 THz 570–590 nm 
orange 484–508 THz 590–620 nm 
red 400–484 THz 620–750 nm 
Espectros de excitação e fluorescência da GFP 
A GFP de A. victoria tem o pico maior de excitação em 395 nm e o pico de emissão em 509 nm 
Variações da green fluorescent protein (GFP) 
Promotor constitutivo + gene reporter (GFP) 
 - GFP +GFP