Biologia Molecular

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Biologia Molecular
PCR – SMART – MICRONÚCLEO
PROF. ANTONIO CARLOS M. DE MOURA
- Professor da rede particular de ensino 
- Mestrando em Biotecnologia
- Biomédico
Biologia Molecular – Prof. Antonio Carlos
Blaise Pascal, disse o seguinte:
“É melhor conhecer alguma coisa de tudo, que conhecer tudo de uma só coisa.
Se pudéssemos fazer ambas seria excelente, mas como é necessário escolher, cumpre optar por aquela”
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Físico, matemático, filósofo e teólogo.
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Em busca da BioMol perdida...
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Introdução
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Introdução: Definição
É o estudo da biologia em nível molecular
Compreensão das interações entre os vários sistemas da célula, incluindo as inter-relações entre as sínteses de DNA, RNA e proteínas e de como estas interações são reguladas
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É o estudo da biologia em nível molecular
-> sobrepõe-se a outras áreas da Biologia, particularmente a genética e a Bioquímica
A Biologia Molecular preocupa-se com a compreensão...
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Introdução: Célula
Todos os seres vivos são formados por células.
A célula é a unidade fisiológica de todos os seres vivos
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Introdução: Célula
Toda célula tem sua origem a partir de outra preexistente, que se divide fornecendo às células filhas seu material genético.
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Introdução: Célula
Toda célula tem sua origem a partir de outra célula preexistente, que se divide fornecendo às células filhas seu material genético.
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Introdução: Material genético
O conjunto de características, que identifica a célula ou o indivíduo, depende do controle interno exercido pelo seu material genético (DNA).
Núcleo
Pode sofrer alterações (gênicas / cromossômicas)
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Nos organismos classificados como eucariontes, é o núcleo o depositário deste material genético. O núcleo das células é delimitado pelo envoltório nuclear ou carioteca, cuja composição e estrutura são semelhantes às da membrana plasmática. Geralmente esférico e central, nem sempre o núcleo é único.
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Introdução: Material genético
Antes de iniciar o processo de divisão, a célula se prepara, produzindo algumas substâncias e degradando outras.
Intérfase: G1, S e G2
 REPLICAÇÃO DO DNA
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Antes de iniciar o processo de divisão, a célula se prepara, fabricando algumas substâncias e degradando outras. A esse período intermediário ou de preparação dá-se o nome de intérfase.
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Introdução: Material genético - replicação
DNA-polimerase:
Sintetiza DNA a partir de seus precursores.
dATP, dCTP, dTTP e dGTP
Trifosfatos x monofosfatos: energia
Pode remover nucleotídeos:
Atividade exonuclease (5'  3') = replicação, reparo de mutações
Atividade exonuclease (3'  5') = revisão
Necessita de iniciadores
Os dois filamentos de DNA: numerosas pontes de hidrogênio – helicase
A telomerase faz a replicação das extremidades do DNA.
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DNA-polimerase: sintetiza DNA a partir de seus precursores: Desoxirribonucleotídeos trifosfato. Os quatro desoxirribonucleotídeos trifosfato necessários para a síntese de DNA são dATP, dTTP e dGTP, contento as bases, adenina, citosina, timina e guanina. Além de fornecerem os desoxirribonucleotídeos, os mencionados precursores proporcionam energia para a síntese de novos filamentos de DNA, porque são trifosfatos, enquanto os desoxirribonucleotídeos incorporados no DNA são monofosfatos. A ruptura das ligações fosfato libera energia que é usada na síntese de DNA.
Pode remover nucleotídeos:
Atividade exonuclease (5' -> 3') = replicação, reparo de mutações
Atividade exonuclease (3' -> 5') = revisão
A DNA-polimerase não consegue iniciar a síntese de DNA sem o auxílio de um iniciador ou primer de RNA, porque ela só é capaz de adicionar nucleotídeos a um polinucleotídeo preexistente. Esses iniciadores são produzidos pela ação de uma enzima RNA-polimerase. A DNA-polimerase então estende essa molécula iniciadora, formando um filamento de DNA que contém um segmento mínimo de RNA. Posteriormente os primers de RNA são removidos das moléculas mistas que constituem as cadeias novas
Os dois filamentos de DNA do cromossoma original estão firmemente ligados graças à numerosas pontes de hidrogênio entre suas bases, torna-se necessária a ação de uma enzima, a helicase, para separar os filamentos da dupla hélice que vai ser copiada. Nesse processo de ruptura de pontes de hidrogênio há consumo de energia que é fornecida por ATP.
A telomerase faz a replicação das extremidades do DNA.
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Introdução: Material genético - replicação
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Introdução: Material genético - replicação
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IMPORTANTE PARA A PCR!
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Introdução: Célula
Toda célula tem sua origem a partir de outra célula preexistente, que se divide fornecendo às células filhas seu material genético.
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Introdução: Célula
Toda célula tem sua origem a partir de outra célula preexistente, que se divide fornecendo às células filhas seu material genético.
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Introdução: Divisão celular
Ocorre basicamente de duas formas: meiose e mitose
Meiose: reprodução (recombinação)
Mitose: crescimento, reparação
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Introdução: Divisão celular
Mitose, em resumo:
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Prófase: cromossomos começam a se condensar, o centríolo se duplica migram para os pólos das células formando o áster e o fuso mitótico. A carioteca e o nucléolo desaparecem
Metáfase: A cromatina termina de se condensar tornando visíveis os cromossomos, eles se organizam no fuso mitótico
Anáfase: ocorre a separação e a migração das cromátides irmãs
Telófase: Os cromossomos chegam aos polos, sofrem descondensação, reaparece a carioteca e o nucléolo. Ocorre a citocinese (divisão do citoplasma)
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-HAHA então nos encontramos novamente!
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PCR
Polymerase chain reaction
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Contextualização histórica
 O aumento gradual do conhecimento da complexidade da molécula de DNA
Constante exigência de meios de diagnóstico rápidos, confiáveis e específicos
Desenvolvimento diversas técnicas de quantificação do DNA ao longo dos últimos 50 anos
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Contextualização histórica
As primeiras técnicas basearam-se em ensaios de hibridização (Problema: sondas radioativamente marcadas)
Segunda geração: colorimétrica, químico-luminescente e químico-fluorescente (Problema: <Sensibilidade)
A rápida evolução no domínio da saúde e das ciências forenses exigiu o desenvolvimento de novas técnicas que permitissem a detecção rápida e fiável de quantidades ínfimas de moléculas
Desenvolvimento da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)!
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 As primeiras técnicas basearam-se em ensaios de hibridização.
Apesar de este procedimento permitir a detecção de quantidades de material na ordem dos picogramas e de ser um teste sensível, fiável e relativamente rápido, apresentava como maior limitação o recurso a sondas radioativamente marcadas, o que trazia implicações para a saúde, requeria autorizações legais e dispositivos eficientes e era na globalidade um processo dispendioso. Por tal, foi desenvolvido uma segunda geração de métodos de detecção de hibridização (colorimétrica, químico-luminescente e químico-fluorescente) baseados em materiais não radioactivos, de forma a substituir os materiais radioactivos. Contudo estas técnicas não apresentavam sensibilidade tão elevada como nos primeiros sistemas. Até aos dias de hoje, uma variedade de
técnicas baseadas no princípio básico da hibridização foram desenvolvidas (por exemplo: hibridização Southern- e Northern-blot) sendo frequentemente aplicadas na investigação fundamental e em diagnósticos clínicos. Contudo a rápida evolução no domínio da saúde e das ciências forenses exigiu o desenvolvimento de novas técnicas que permitissem a detecção rápida e fiável de quantidades ínfimas de moléculas, como os ácidos nucleicos. De forma a ultrapassar as limitações da sensibilidade que eram inerentes aos protocolos de detecção e hibridação do ácido nucleico, uma nova técnica foi desenvolvida: a técnica da PCR ou técnica da Reacção em Cadeia da Polimerase
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Contextualização histórica
Kary Mullis (Químico Americano) em 1983
DNA multiplicado artificialmente através de ciclos de duplicação - DNA polimerase. 
Amplificação exponencial seletiva - quantidade reduzida de DNA de um conjunto de células
Sequências genômicas ou DNA complementar
“Síntese artificial de DNA num processo em cadeia que imita a replicação do DNA”
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A PCR foi concebida pelo Químico Americano Kary Mullis em 1983. 
Mullis desenvolveu um processo através do qual o DNA poderia ser multiplicado artificialmente através de ciclos repetidos de duplicação cuja reação seria catalisada pela DNA polimerase. 
Esta técnica baseia-se na amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de um conjunto de células, correspondendo a um mecanismo de síntese artificial de DNA num processo em cadeia que imita a replicação do DNA. 
Trata-se de um método rápido e eficiente para amplificação de sequências específicas a partir de uma mistura complexa de sequências genômicas ou DNA complementar. 
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Em outras palavras...
É como uma máquina de XEROX molecular
*Créditos da ilustração - Prof.Dr. Robson Francisco Carvalho
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Contextualização histórica
A “precursora da PCR” vinha sendo descrita
Mullis inovou:
Introduziu o conceito de primer
Utilizou uma DNA polimerase termoestável.
1989 - primeiro termociclador automático.
Maioria dos termocicladores automáticos - aquecimento por resistências elétricas e refrigeração com ventoinhas e tubulações em serpentina preenchidas por etileno glicol.
Sistemas de contagem de tempo
Em meados dos anos 90: padrão Peltier - bloco de aquecimento é composto por liga metálica que aquece ou resfria de acordo com o sentido da corrente elétrica aplicada.
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Na verdade a “precursora da PCR” técnica vinha sendo descrita (a precursora da PCR demandava grandes quantidades de enzima, adicionadas a cada ciclo de amplificação).
Problema: realização manual dos ciclos de temperatura
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Contextualização histórica
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Contextualização histórica
Pequenas quantidades de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes e em poucas horas!!!
Pode ser utilizada, dentre outros, para...
	A) Detecção dos marcadores genéticos de doenças infecciosas, câncer ou doenças genéticas; 
	B) Mapeamento genético;
	C) Clonagem de genes
	D) Testes de paternidade
	E) Construção de árvores filogenéticas... 
1989 a revista Science elegeu a PCR como “maior desenvolvimento científico”.
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A PCR Revolucionou a Biologia Molecular, a Patologia, a Farmácia, a Botânica e a Medicina Forense. Antes da descoberta da PCR, para a síntese de DNA, a clonagem prévia e a respectiva replicação na célula do hospedeiro eram requisitos fundamentais.
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Objetivo da técnica
“Multiplicar um trecho específico do DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis e etc.) utilizando desoxinucleotídeos trifosfatados como monômeros, até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substâncias. A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio”
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Princípios da Técnica
A reação sempre parte de um DNA molde, extraído convenientemente da amostra, ou de uma amostra de RNA, convertida para cDNA (DNA complementar);
O ideal é que o ácido nucléico esteja livre de impurezas;
Concentração (preferível, não menos) de 5µg/mL, apesar de quantidades bem menores poderem ser utilizadas.
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Princípios da Técnica
A reação da envolve três fases: desnaturação, annealing e extensão
 Na primeira fase ocorre a separação da dupla hélice de DNA por aquecimento a uma temperatura elevada (94ºC-96ºC)
Annealing: hibridação dos primers (oligonucleótidos iniciadores) ocorre entre 50ºC e 54ºC.
Extensão do DNA: temperatura elevada até ao intervalo 72ºC a 76ºC
No fim de um ciclo de PCR obtém-se dois novos segmentos de DNA para cada alvo da dupla cadeia.
 Ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que havia no início do ciclo
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Princípios da Ténica
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Princípios da Técnica
Primers
Responsáveis por iniciar a reação
Localizam a sequencia alvo
Tamanho - de 10 a 30 pb
Concentração – Baixa induz má polimerização
		 – Excessiva induz o aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers
Composição de bases: conteúdo GC de aproximadamente 50%, visando maximizar a especificidade da reação
Não deve ter complementaridade dentro de uma mesma sequência nem entre as seq. dos iniciadores
Cálculo da Tm e da Temperatura de annealing
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TAMANHO suficiente para que a probabilidade de hibridar com outras regiões que não a desejada, seja reduzida.
CONCETRAÇÃO
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Princípios da Técnica
Temperatura
Quebra as ligações entre os nucleotídeos do primer e da cadeia de DNA
Temperatura melting: temperatura na qual 50% das moléculas do conjunto primer/DNA estão desemparelhadas e as outras 50% estão hibridizadas denomina-se temperatura de melting (Tm).
Primer menor que 25 nucleótidos. Regra de Wallace: Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ºC
Temperatura de annealing (anelamento): Tm diminuído 1 a 5ºC
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TAMANHO suficiente para que a probabilidade de hibridar com outras regiões que não a desejada, seja reduzida.
CONCETRAÇÃO
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Princípios da Técnica
Polimerase
Existe no mercado uma larga variedade de enzimas, que diferem em termos de estabilidade térmica, fidelidade e direção de processamento da polimerização (Pfu DNA polimerase - Pyrococcus furiousus, Vent DNA polimerase - Thermoccocus litoralis...)
Taq polimerase - bactéria Thermus aquaticus - vive em águas a 75ºC.
Atividade de polimerização 5’ 3’
Eficiência - 70ºC a 80ºC
Meia vida de aproximadamente 35-40 minutos a 95ºC.
Adicionada no início da reação e permanecendo ativa durante todos os ciclos de amplificação
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Princípios da Técnica
dNTPs
Adicionados à cadeia por ligações fosfodiéster
Devem conter a mesma concentração, para que não ocorram erros de incorporação
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As elevadas concentrações de dNTP´s normalmente vão aumentar este tipo de erros, mas por sua vez, concentrações demasiado baixas fazem diminuir o 
rendimento da reação.
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Princípios da Técnica
Tampão
O tampão é utilizado para manter o pH estável durante a reação.
Tris-HCl – pH 8,3 - 8,8
MgCl2
Atividade das DNA polimerases termoestáveis depende da existência na solução de cations bivalentes livres
Desempenha ainda um papel de auxílio na ligação do primer ao DNA molde 
1.5 a 4.0 mM
Baixas concentrações quantidade de produto final reduzida
Concentração excessiva: PCR pouco específica
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A concentração do íon magnésio deve exceder a concentração de dNTP’s, atendendo ao fato da ligação entre
ambos os reagentes ocorrer na proporção de 1:1 e devido ao íon atuar como co-factor enzimático na PCR, ao tornar-se substrato da DNA polimerase.
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Princípios da Técnica
Parâmetros de amplificação
Etapa 1 – desnaturação: 92 a 95ºC por 15 s – 1 min
Etapa 2 – anelamento: Tm -5ºC a Tm por 30 s – 2 min
Etapa 3 – extensão: 72 a 75ºC por 30 s – 2 min (depende do tamanho de DNA a ser amplificado
Etapa 4 – repetição das etapas 1 a 3 por cerca de 25-40 vezes
Etapa 5 – extensão final: temperatura da etapa 3 por cerca de 5-10 min, garante que toda a população de DNA amplificada encontre-se como fita dupla e de tamanho completo
Etapa 6 – incubação a 4ºC por um tempo indefinido
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Relembrando...
“Multiplicar um trecho específico do DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis e etc.) utilizando desoxinucleotídeos trifosfatados como monômeros, até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substâncias. A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio”
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Detecção do produto da PCR
Eletroforese
Separação de moléculas com carga eléctrica não nula
Diferença de potencial - originam um conjunto de bandas em gel
Revelação, radiação ultra-violeta
Agarose x Poliacrilamida
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Detecção do produto da PCR
Eletroforese
Agarose
Forma matriz porosa
Migração: carga eléctrica, massa, conformação das moléculas, concentração da matriz de agarose utilizada
Regra geral: moléculas com menor massa migram mais rapidamente do que as de maior massa
Migração sentido do polo positivo - moléculas de DNA carregadas negativamente
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Detecção do produto da PCR
Eletroforese
Poliacrilamida:
Mistura - acrilamida (C3H5NO) e a bis-acrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida)
Diferentes relações entre as concentrações – interfere na separação.
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Aplicações da PCR
DNA fingerprint
Testes de parentesco
Mutações pontuais
Doenças infecciosas
Diagnóstico pré-natal
Diagnóstico e prognóstico de doenças genéticas
Análise de DNA antigo
Clonagem de genes
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DNA fingerprint: técnica forense, na qual pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime são amplificadas para serem analisadas. 
Testes de parentesco: podem ser determinadas relações genéticas através da comparação de dois ou mais DNA fingerprints. 
Mutações pontuais: frequentemente geradoras de polimorfismos genéticos, podem ser detectadas por ação das enzimas de restrição
Doenças infecciosas por agentes patogénicos diversos: a amplificação do DNA do agente possibilita um diagnóstico precoce mesmo antes da ocorrência de infecções. 
Diagnóstico pré-natal ou pré-implantacional (particularmente para doenças herdadas 
Diagnóstico e prognóstico de doenças genéticas: o estudo dos genes relacionados com essas doenças permite quer o diagnóstico, quer a evolução das mesmas.
Análise de DNA antigo: diversas investigações amplificaram com sucesso material genético de insetos extintos há mais de 20 milhões de anos fossilizados em âmbar. 
Clonagem de genes
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Variantes da PCR
 Colony PCR  Multiplex PCR  Nested PCR  AFLP PCR 
 Hot Start PCR  RAPD-PCR  In Situ PCR  PCR-RFLP 
Inverse PCR  Asymmetric PCR  PCR competitiva Long PCR  Long Accurate PCR  Reverse Transcriptase PCR 
 Allele Specific PCR  Realtime PCR 
 Semiquantitative PCR  REP-PCR  ERIC-PCR 
BOX-PCR  RACE-PCR  PCR screening  
Ligation mediated PCR  DOP PCR  Aconred PCR 
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Variantes da PCR
Multiplex PCR: 
Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. 
Exemplo de uso: investigação de paternidade
Nested PCR:
Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente.
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Variantes da PCR
PCR competitiva:
Além do DNA molde, é adicionado à reação um outro trecho de DNA, de sequência, tamanho e concentração conhecidos (controle), cujas extremidades são complementares também aos primers que irão amplificar a sequência-alvo. O resultado é a amplificação de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle. Esta última, levando-se em conta a quantidade inicial e dados sobre a eficácia da reação serve de padrão para a quantificação do DNA-alvo. Em resumo, se conhecemos a quantidade final do fragmento controle e as condições da reação, podemos dizer o quanto de DNA-alvo foi amplificado. 
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Variantes da PCR
RAPD PCR
Baseia-se na análise do polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA amplificado aleatoriamente
RT PCR (reverse transcriptase):
Reação composta de 2 partes: a transcrição reversa e a amplificação propriamente dita. A amostra fornece RNA, que é convertido em cDNA (DNA complementar). 
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Variantes da PCR
PCR RFLP:
Utiliza enzimas de restrição
Se existirem dois amplicons com uma variação da sequência de nucleotideos nos sítios de reconhecimento das enzimas de restrição, geram diferentes padrões de fragmentos
Real time PCR:
Possibilidade de quantificação em tempo real do DNA amplificado, em cada ciclo de amplificação. Neste método, as fases de amplificação, detecção e quantificação são totalmente automatizadas
Metodologia de PCR + Sistema de detecção de sinais fluorescentes
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SMART E MICRONUCLEO
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Contextualização
Testes de Genotoxicidade
Agentes genotóxicos: interagem com o DNA produzindo alterações em sua estrutura ou função
Podem causar doenças tanto nos indivíduos como nos seus descedentes, dependendo da quantidade, do tipo e local onde ocorrem e alterar o balanço dos ecossistemas.
Os compostos mutagênicos encontram‐se distribuídos nos ecossistemas (água, solo, ar); são transferidos e acumulados através das cadeias tróficas, podendo causar danos genéticos ou efeitos genotóxicos nos indivíduos ou população.
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SMART
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SMART, também conhecido como teste da mancha das asas de Drosophila melanogaster. O SMART detecta diferentes tipos de manchas mutantes que podem ser resultantes de eventos como mutação, deleção ou recombinação mitótica, além do fato de ser um teste rápido, sensível e de baixo custo.
Drosophila: ideal para estudos de genotoxicidade e antigenotoxicidade in vivo
Possui pequeno número de cromossomos
Sistema enzimático semelhante ao dos mamíferos
Tempo curto de geração
Grande número de mutantes
Linhagens bem caracterizadas
Baixo custo, rapidez e confiabilidade;
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SMART: sensível e eficiente
Monitoramento de poluição ambiental
Possibilita a detecção de genotoxicidade de contaminantes que estão presentes em extratos na fase gasosa e de partículas materiais de vários tipos de amostras de ar e água.
Atividade genotóxica de compostos puros simples e misturas complexas de várias origens 
Promutágenos e procarcinógenos
Detecta atividade genotóxica de mutágenos de várias classes químicas
Pode-se avaliar compostos estáveis e instáveis, componentes químicos dissolvidos e substâncias químicas gasosas.
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Carlos
Princípios da Técnica
“Alterações genéticas provocadas em células que estão se dividindo por mitose induzem o aparecimento de manchas mutantes, que originam a perda de heterozigose em células heterozigotas para genes marcadores recessivos. A análise dos possíveis danos induzidos é realizada através da observação de grupos de células na superfície das asas de moscas adultas, que expressam fenotipicamente os genes marcados mwh ou flr³ responsáveis por alterações na forma dos pelos”
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São utilizadas três linhagens:
Linhagem multiple wing hairs (mwh/mwh) os indivíduos dessa linhagem possuem o gene marcador mwh no cromossomo 3 em uma porção distal. Na presença desse alelo mutante as células da asa de D. melanogaster que normalmente caracterizam-se por apresentar um único pelo, apresentação dois ou mais pelos por célula. Por ser uma mutação viável, a linhagem de estoque é mantida em homozigose recessiva.
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MWH
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São utilizadas três linhagens:
Linhagem flare 3 (flr³): os indivíduos dessa linhagem possuem o gene marcador flr³ localizado no cromossomo 3. O fenótipo provocado por esse alelo mutante é um pelo mal formado que se assemelha a uma chama. O gene marcador flr³ é letal em homozigose, não se desenvolvendo até a fase adulta. Devido à letalidade, esse alelo é mantido na linhagem estoque na presença de um balanceador cromossômico (TM3, Bds), que se caracteriza por múltiplas inversões.
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São utilizadas três linhagens:
Linhagem ORR (Oregon R, flare³): possuem a mesma constituição genética dos que pertencem a linhagem flare³, porém, diferem por apresentar cromossomos 1 e 2 provenientes da linhagem Oregon R resistente ao DDT, com alta expressividade das enzimas do citocromo P450
Aumenta o desempenho do SMART
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Dois cruzamentos:
1) Cruzamento padrão (ST - Standard Cross): fêmeas virgens flr³/TM3 e Bds cruzadas com machos mwh 
2) Cruzamento de alta bioativação (HB - High Bioactivation Cross: fêmeas virgens são coletadas da linhagem ORR/ORR; flr3/TM3, BdS e cruzadas com machos mwh
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Destes cruzamentos nascem dois tipos de descendentes: transheterozigotos marcados (MH) e heterozigotos balanceados (BH).
Distintos fenotipicamente, baseados no marcador TM3, Bds
MH (mwh +/+ flr3) pelos mutantes nas asas originados de alterações mutagênicas e recombinogenicas ocorridas no lócus gênico mwh e flr³. Asa normal, com borda lisa.
BH possuem um cromossomo balanceador TM3/Bds que devido suas múltiplas inversões, não encontramos eventos recombinogênicos. Asa mal formada (“serrate”)
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MH
BH
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Ovos dos cruzamentos ST e HB são coletados por um período de 8 horas
Frascos de cultura (vidro de 250 mL) contendo uma base sólida de 3% ágar cobertas com uma camada do fermento biológico (Sacharomyces cerevisiae) enriquecido com açúcar.
Para os tratamentos -> larvas são removidas dos frascos, lavadas em água, com auxílio de coador de malha fina de aço, e transferidas para frascos contendo 1,5 g de purê de batatas, acrescido com 5 mL do componente teste. Todo o experimento é realizado a temperatura de (25 ± 1) ºC e 65% de umidade.
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 Após o período de metamorfose, as moscas adultas são acondicionadas em etanol 70 %.
Inicialmente todas as moscas independente de sexo são classificadas de acordo com a presença/ausência do fenótipo de Bds.
A seguir, cada tipo de descendente é classificado quanto ao sexo.
Usando um microscópio estereoscópico standard e pinças entomológicas, as asas são removidas e montadas em lâminas em solução de Faure.
Superfícies dorsais e ventrais são analisadas em microscópio óptico de luz. 
Durante as análises das lâminas, as manchas são anotadas de acordo com o tipo e tamanho, de acordo com as seções da asa.
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Pelos mutantes são classificados em manchas: simples quando expressam apenas um dos marcadores mwh ou flr3 originadas por mutação, aberração cromossômica (deleção) ou recombinação distal; e gêmeas quando expressam os dois marcadores mwh e flr3 na mesma mancha.
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Gêmea
Simples
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 A análise permite a determinação quantitativa da atividade recombinogênica.
Indíviduos com cromossomos estruturalmente normais: eventos mutacionais e recombinacionais, levam à formação de manchas únicas ou gêmeas.
Indíviduos balanceadores heterozigotos: todos eventos recombinacionais são eliminados devido a inversões múltiplas, e só eventos mutacionais podem dar origem a manchas simples.
Para avaliação dos efeitos genotóxicos recorre-se a frequência de manchas por asa de séries tratadas e estas são comparadas com o controle negativo (solvente)
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MICRONÚCLEO
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Princípios da Técnica
Micronúcleo: origina-se da cromatina que, por razões diferentes, é retardada na anáfase.
Telófase: material incluído em uma ou a outra célula filha
Micronúcleos são consideravelmente menores que o núcleo principal
O retardamento tem duas causas principais, a quebra de cromossomo e o mau funcionamento das fibras do fuso
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, podendo permanecer fundido ao núcleo principal, ou ainda, formar um ou vários núcleos secundários.
No primeiro caso, os elementos retardatários são fragmentos cromossômicos acêntricos e, no segundo caso, eles consistem em cromossomos inteiros. Portanto, os micronúcleos são formados no final da divisão celular, ao lado do núcleo principal.
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Princípios da Técnica
Empregado originalmente em mamíferos de pequeno porte
Avalia a genotoxicidade por meio de eritrócitos da medula óssea
Várias adaptações metodológicas: 
Moluscos, mamíferos ungulados domésticos; linfócitos humanos; cordão umbilical humano; células epiteliais; bucais humanas; células de brânquias de peixes; eritrócitos periféricos de salamandra aquática; meristemas de raiz de Vicia faba; células de Allium cepa e Vicia faba; células vermelhas do sangue de peixes. 
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Teste rápido e confiável
Detecta os danos provocados  pelo efeito mutagênico e carcinogênico de agentes genotóxicos
Possibilidade de detectar e identificar efeitos genotóxicos através de aberrações cromossômicas  em  células de organismos  expostos  a  substâncias com potencial de mutagenicidade
MNs atuam como marcadores biológicos de danos genéticos e podem ser utilizados como instrumento de monitoração , considerando que retornam aos níveis basais quando o organismo permanece por um período sem contato com a substância indutora
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Atualmente, o TMN é empregado, também, como método de biomonitoramento de ambientes poluídos, com intuito de se detectar a presença de agentes genotóxicos.
Os peixes são frequentemente utilizados quando a avaliação da contaminação é feita em ambientes aquáticos
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Vantagens:
Pode ser empregado tanto in vivo quanto in vitro, sendo que in vivo a atividade metabólica é mantida, não ocorrendo o mesmo em um sistema teste in vitro
Apresenta sensibilidade para medir atividade genotóxica em condições laboratoriais e no campo
Pode ser aplicado em qualquer população de
células em proliferação, sem levar em conta o seu cariótipo, pois o teste não é afetado pelo pequeno tamanho e o grande número de cromossomos
Amostras de sangue periférico são apropriadas e suficientes para avaliações em biomonitoramentos: permite colecionar várias amostras do mesmo indivíduo
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Microscopicamente, micronúcleos são pequenos corpúsculos, não 
refratários, circulares ou ovóides, exibindo a mesma coloração padronizada do 
núcleo principal
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Preferencialmente, camundongos jovens de quatro a cinco semanas de idade, mantidos em dieta equilibrada, recebendo alimento e água 
Grupos de controle e experimental são distribuídos aleatoriamente, e dividem-se em: 
Grupo-controle negativo,  grupo-controle positivo  e grupo-teste 
Recomenda-se que cada grupo seja composto de dez animais, preferencialmente machos, para evitar o  fator hormonal existente nas fêmeas.
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Tratados uma única vez com as substâncias respectivas de cada grupo, e as coletas devem ser feitas no mínimo doze e no máximo trinta horas  após o tratamento, sendo necessário padronizar os horários da coleta.
Após o sacrifício, retira-se a medula óssea a partir do fêmur e centrifuga-se a 1000 rpm/5 min.
O sobrenadante é descartado, e a partir do resíduo são preparados os esfregaços (duas lâminas por animal), que, depois de secados à temperatura ambiente, são corados com a técnica de coloração de Leishmann  e observados  ao microscópio de fluorescência. 
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Conta-se o número de eritroblastos policromáticos (EP) com micronúcleo em relação ao total de Eps (no mínimo 1000 EPs por lâmina).
Os micronúcleos podem ser visualizados usando-se diferentes técnicas, entre elas a coloração de Giemsa ou a fluorescência
Suas freqüências são quantificadas microscopicamente
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QUESTÕES DE CONCURSOS
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1. (IRH – UPENET – IAUPE – 2013) A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) tem sido muito utilizada para quantificar plasmídeos, DNA e cargas parasitárias ou virais. Sobre isso, assinale a alternativa CORRETA sobre essa metodologia. 
(A) A quantificação de DNA/RNA é baseada na quantidade de material genômico da sequência alvo na fase de platô. 
(B) A quantificação da carga da parasitemia ou viremia é baseada na amplificação e incorporação de biotina radioativa. 
(C) O Ct, também chamado de ciclo de tempo, é o principal parâmetro utilizado para a quantificação do material genômico. 
(D) As sondas marcadas com compostos fluorescentes são utilizadas em conjunto com primers para a região de interesse. 
(E) A detecção de fluorescência dos fragmentos externos à sequência-alvo ocorre ao final da fase log.
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2. (UFMS – COPEVE – 2013) Quando em 1990 foi publicada a descoberta da técnica de PCR por Kary B. Mullis, talvez ainda não se imaginassem as vantagens dessa técnica para o avanço e o progresso dos métodos diagnósticos moleculares. A investigação laboratorial de microrganismos por meio de técnicas moleculares exibe sensibilidade e especificidade muito maior do que a maioria dos testes tradicionalmente utilizados. Em relação à PCR, marque a afirmativa correta. 
(A) A desnaturação do DNA envolve a ruptura de ligações do tipo pontes dissulfeto para o encaixe do primer. 
(B) Para um bom anelamento do primer, é necessário que se tenha maior quantidade de domínios ricos em adenina e timina. 
(C) O anelamento do primer se dá, normalmente, em temperaturas 5° a 10°C maiores que a temperatura de melting. 
(D) O cloreto de magnésio se liga aos deoxinucleotídeos, agindo como cofator para a ação da enzima DNA polimerase. 
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3. (PREF. CAMPINAS/SP – CETRO – 2013) A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) é utilizada amplamente em exames laboratoriais devido a sua exatidão para detecção de doenças infecciosas e hereditárias. Devido a tal fato, desde a década de 90 do século passado, a doença de Chagas tem sido diagnosticada por essa técnica. Assinale alternativa que justifica o uso da técnica de PCR para a diagnose da Doença de Chagas. 
(A) Para diagnosticar a Doença de Chagas, a técnica de PCR tem como princípio a detecção de proteínas específicas de Trypanosoma cruzi liberadas no sangue do paciente, usando como padrão albumina de soro bovino (BSA). 
(B) A técnica permite a amplificação do DNA de Trypanosoma cruzi devido a vários ciclos de duplicação da DNA polimerase, enzima responsável pela síntese dos iniciadores (primers). 
(C) A técnica de PCR compreende as etapas de Desnaturação, Splicing, Extensão e Hibridização ou annealing. 
(D) Para a PCR são necessários reagentes e equipamentos como enzima DNA polimerase, iniciadores, nucleosídeos trifosfatados, magnésio termociclador e um equipamento de eletroforese. 
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4. (CETESB – VUNESP – 2013) A reação da cadeia da polimerase (PCR) consiste em três fases que se repetem, o que constitui a base da parte do nome “reação em cadeia”. Assinale a alternativa que corresponde à primeira fase dessa metodologia molecular.
(A) Extensão dos iniciadores (“primers”)
(B) Anelamento ou acoplamento dos iniciadores (“primers”)
(C) Hibridização fluorescente in situ
(D) Desnaturação do DNA ou a separação dos dois filamentos do DNA
(E) Síntese de uma nova fita de DNA com auxílio da DNA polimerase
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5. (UFPI – COPESE – 2013) A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) é uma metodologia voltada para a amplificação de sequências que revolucionou a biologia molecular e teve sua importância reconhecida com a entrega do premio Nobel de Química, em 1993, para o seu idealizador, o bioquímico Kary Mullis. Para que a PCR ocorra é de fundamental importância a utilização de pequenos fragmentos de nucleotídeos, denominados de oligonucleotídeos iniciadores (do inglês, primers), que são estendidos pela ação da enzima DNA polimerase para a síntese de uma novo fragmento. Considere a necessidade de amplificação da sequência de 120 pares de base (pb) abaixo demonstrada. 
 
5’-CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT GCCCTCATTC CGCGTGCAGG 
ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA GCAATGCGCT TATTACAGTG-3’ 
 
Marque a opção que apresenta, respectivamente, os iniciadores senso e antissenso. 
 
(A) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’. 
(B) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’. 
(C) 5’-GACTGTGAGATTGAGGCCAG-3’ e 5’-GTGACATTATTCGCGTAACG-3’. 
(D) 5’-CTGGCCTCAATCTCACAGTC-3’ e 5’-CACTGTAATAAGCGCATTGC-3’. 
(E) 5’-GACCGGAGTTAGAGTGTCAG-3’ e 5’-GCAATGCGCTTATTACAGTG-3’.
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6. (UFPI – COPESE – 2013) A técnica de biologia molecular conhecida como RFLP (do inglês, Restriction Fragment Length Polymorphism) é utilizada para a detecção de variações de sequências de DNA, reconhecidas por enzimas de restrição, capazes de clivar sequências específicas do DNA (sítios de restrição), com posterior visualização em gel de eletroforese dos fragmentos obtidos após digestão. Considere a sequência de 120 pb apresentada na questão anterior como sendo o alelo selvagem de um gene X de um organismo diploide, sendo outro alelo deste gene X possuidor de uma transição de G>A na posição 32 do produto de PCR. Marque a opção que apresenta os tamanhos dos fragmentos obtidos após digestão pela enzima BstI (sítio de restrição 5’-CG ▼CG-3’) do produto de PCR da sequência de 120 pb. 
 
(A) 88 pb, 68 pb e 32 pb.			(D) 88 pb, 68 pb, 32 pb e 20 pb. 
(B) 120 pb, 68 pb e 52 pb e 20 pb		(E) 68 pb, 52pb, 32 pb e 20 pb. 
(C) 120 pb, 68 pb e 20 pb.
5’-CTGGCCTCAA TCTCACAGTC TGCCTGCATC CGCGTACTCT GCCCTCATTC CGCGTGCAGG 
ACTATGACGT AGCAGCAGGT GACCTTTACG GAGGATAAGA GCAATGCGCT TATTACAGTG-3’ 
 
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7. Supondo que uma mutação presente em um dos alelos encontrados no indivíduo heterozigoto crie o sítio de restrição para a enzima utilizada no ensaio abaixo; o gel representa o resultado da PCR-RFLP para detecção desse polimorfismo. Quais das amostras poderiam representar o indivíduo heterozigoto?
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8. (SESAPI - NUCEPE – 2012) A evolução experimentada pela biologia molecular produziu importantes mudanças e aperfeiçoamentos no diagnóstico clínico. Uma das técnicas mais empregadas nas diversas áreas do diagnóstico molecular é a reação em cadeia da polimerase (PCR). Sobre essa técnica, pode-se afirmar que: 
(A) é uma reação enzimática que permite detectar, por amplificação, qualquer fragmento de DNA de sequência desconhecida. 
(B) utiliza uma enzima termolábil, que amplifica a região de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA. 
(C) quando o alvo do teste é fragmento de RNA e não de DNA, a primeira etapa é a conversão de cDNA para RNA usando transcriptase reversa. 
(D) a amplificação obtida com a técnica de PCR ocorre através de alterações lineares e contínuas de temperatura. 
(E) a extração de RNA é necessária para a detecção de certos vírus, como o HIV, que têm RNA em vez de DNA.
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9. (SESAPI – NUCEPE – 2012) Modificações da reação em cadeia da polimerase (PCR) resultam em técnicas que permitem uma variedade de aplicações. Considerando essas técnicas, correlacione aquelas enumeradas abaixo com as respectivas aplicações a que se destinam. Técnicas 
1) RT-PCR / 2) Nested PCR / 3) Multiplex PCR / 4) PCR em tempo real / 5) PCR a partir de primers randômicos  
Aplicação 
( ) Muito empregada em estudos epidemiológicos. 
( ) Permite detectar múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra. 
( ) Empregada para quantificação de amostras e testes de carga viral. 
( ) Aumenta a sensibilidade e a especificidade do método através de uma segunda etapa de amplificação. 
( ) Permite estudar vírus que contêm RNA e análises de expressão gênica. 
 
A sequência correta é: 
 
A) 5, 4, 3, 2, 1. 	B) 5, 3, 4, 2, 1. 	C) 4, 3, 5, 2, 1. 	D) 4, 3, 1, 5, 2. 	E) 3, 5, 4, 1, 2
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10. (UFG – 2012) A reação em cadeia de polimerase (PCR) é uma técnica que, entre outras utilidades, identifica um fragmento de DNA ou locais de restrição e mutações pontuais. A fase da PCR, que consiste na separação das fitas de dupla hélice de DNA, é a
(A) modelação
(B) desnaturação
(C) polimerização
(D) replicação
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11. (FUNDELTA – 2012) A técnica de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) possibilita uma clonagem rápida de genes. Sobre essa técnica sabe-se que: 
(A) pode ser realizada mesmo que não se saiba nada sobre a sequência de DNA que se deseja amplificar; 
(B) os primers necessários à reação ligam-se a fitas simples de DNA geradas por calor; 
(C) utiliza a mesma DNA-polimerase envolvida na replicação de células eucarióticas; 
(D) todas as etapas são realizadas em temperaturas bastante próximas; 
(E) o aquecimento do DNA se faz necessário a partir do terceiro ciclo da reação;
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12. (HRC/SESAU – FUNCAB – 2010) PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma técnica para a amplificação de regiões específicas do DNA. Podemos afirmar sobre a técnica de PCR:
(A) utiliza iniciadores específicos para determinada sequência e múltiplos ciclos de síntese de DNA.
(B) a separação das fitas complementares não requer tratamento por calor.
(C) a técnica é simples sendo eficaz com apenas um ciclo.
(D) embora seja um método extremamente sensível, não é possível detectar moléculas de DNA isoladas em uma amostra.
(E) os iniciadores se encontram nas extremidades 3' dos fragmentos finais de DNA produzido. 
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13. (PREF. PILAR – MASTER – 2010) Nas reações de amplificação de material gênico através da técnica de PCR, no caso de Dengue, HTLV e HIV, faz-se necessário produzir: 
(A) transcrição de DNA complementar a partir do genoma desses vírus 
(B) transcrição de RNAm complementar a partir do genoma desses vírus 
(C) na etapa de transcrição reversa, um RNA viral complementar aos vírus 
(D) na etapa de amplificação reversa, um RNA viral complementar aos vírus
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14. (CETESB – VUNESP – 2009) A cada ciclo da reação em polimerização em cadeia (PCR) ocorre sequencialmente:
(A) detecção, desnaturação e mutação.
(B) polimerização, restrição e desnaturação.
(C) mutação, detecção e pareamento.
(D) restrição, polimerização e detecção.
(E) desnaturação, pareamento e polimerização
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(SECAD – CESGRANRIO – 2009) Analise o texto e a ilustração apresentados abaixo, para responder às questões de nos 15 e 16. Um biomédico obtém a eletroforese de um gel de agarose corado com brometo de etídeo de seus produtos de PCR, como mostrado a seguir
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15. Quanto aos produtos de PCR contidos nas linhas I e II, tem-se que
(A) I é maior que II.
(B) I é mais negativo que II.
(C) II é maior que I.
(D) II é mais positivo que I.
(E) I e II são do mesmo tamanho.
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16. Um dos produtos do PCR mostrado é removido do gel e, após limpeza do DNA, utilizado para uma reação de ligação que o insere em um plasmídeo. Esse plasmídeo é, então, inserido em bactérias competentes para obtenção de múltiplas cópias do mesmo. Com esse procedimento de inserção no plasmídeo e obtenção de cópias, o biomédico realiza um(a).
(A) isolamento.
(B) clonagem.
(C) transfecção.
(D) seleção.
(E) infecção.
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(PREF. IPOJUCA – CESPE – 2009) Considerando as técnicas e os equipamentos utilizados em laboratórios de biologia molecular, julgue os itens que se seguem.
 
17. A reação de PCR, utilizada na amplificação de DNA, é responsável pela adição de aminoácidos a uma estrutura gênica, de forma a produzir várias cópias de um gene.
 
18. Um termociclador utilizado para amplificação de DNA é um equipamento capaz de provocar alterações na temperatura dos tubos do experimento de forma que o aumento, a redução e a duração desses processos seja controlada.
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19. (SESPA – MOVENS – 2008) Com relação à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), julgue os itens abaixo e, em seguida, assinale a opção correta.
I – A DNA polimerase pode ser direcionada para sintetizar uma região específica do DNA.
II – As duas fitas de DNA podem servir como molde para a síntese de uma nova molécula, desde que seja fornecido um oligonucleotídeo iniciador (Primer) para cada fita.
III – Na PCR, a região do DNA que deverá ser amplificada é demarcada pelo oligonucleotídeo iniciador e as novas fitas de DNA sintetizadas têm início a partir desse iniciador.
IV – O resultado final da PCR é a amplificação de uma região específica do DNA.
V – A Taq polimerase, DNA polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus, é uma das limitações da PCR, por ser termossensível, sendo necessário ser adicionada a cada ciclo da reação.
 
Estão certos apenas os itens:
(A) I e II.
(B) II, IV e V.
(C) I, II e IV.
(D) I, II, III e IV
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(PREF.RIO BRANCO – CESPE – 2007) Considerando a técnica da PCR julgue os próximos itens.
 
20. A PCR envolve três etapas básicas, que são repetidas várias vezes em ciclos: desnaturação térmica do DNA-molde; anelamento de oligonucleotídeos sintéticos (iniciadores da reação de polimerização) a cada uma das fitas do DNA-molde e polimerização das novas fitas de DNA, usando dNTP como substrato.
21. Nessa técnica, a cada ciclo, os produtos recém-sintetizados são retirados do sistema de reação.
22. A PCR tem inúmeras aplicações, no entanto não pode ser aplicada a estudos arqueológicos, visto que, em tais materiais, as moléculas de
DNA encontram-se degradadas.
23. Nessa técnica, são empregadas DNA polimerases termoestáveis, como a Taq DNA polimerase.
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(PREF. BOA VISTA – CESPE – 2004) O diagnóstico por métodos que envolvem biologia molecular e DNA recombinante vem sendo empregado com grande frequência não apenas em laboratórios de pesquisa, mas também na rotina de análises clínicas. Em relação a esses métodos, julgue os itens a seguir.
24. A técnica de PCR demanda um conhecimento prévio da sequência que será amplificada.
25. A partir de uma molécula de DNA, submetida a 30 ciclos de PCR, serão obtidas 60 novas cópias dessa molécula.
26. Na técnica de PCR, utiliza-se a DNA polimerase, que é uma enzima somente presente em vírus.
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27. (SSE – UEG – 2004) Considere as afirmativas a seguir: 
 
I. A reação em cadeia da polimerase é um dos procedimentos que envolvem a genética molecular, utilizando primers especificamente destinados a amplificar regiões curtas e específicas de DNA. 
II. A reação em cadeia da polimerase é muito utilizada no teste de paternidade, devendo somente ser realizada com amostras biológicas de três indivíduos envolvidos, ou seja, mãe, filho e um suposto pai. 
III. A reação em cadeia da polimerase é realizada inicialmente com a ação da enzima DNA polimerase resistente a temperatura, a Taq polimerase, a qual catalisará o crescimento a partir de primers de DNA. 
Marque a alternativa CORRETA: 
 
(A) Apenas as afirmativas I e II são corretas. 	(B) Apenas as afirmativas I e III são corretas. 
(C) Apenas as afirmativas II e III são corretas. 	(D) Todas as afirmativas estão corretas.
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(POLÍCIA FEDERAL – CESPE – 2004)
A figura mostra padrões de eletroforese em gel de fragmentos de restrição de DNA obtidos a partir de amostras de sangue colhidas de sete suspeitos em uma cena de crime. As amostras foram aplicadas na região superior do gel. Considerando os dados da figura, e as técnicas de biologia molecular, julgue os itens que se seguem.
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28. As bandas presentes na região inferior do gel representam fragmentos de DNA de menor massa molecular.
29. Se a análise mostrada na figura foi feita de forma correta, então foram utilizados apenas os eritrócitos das amostras.
30. Se o DNA for desnaturado, a técnica de PCR não pode ser realizada
31. Para o uso da técnica de PCR com a finalidade de amplificar determinada região de DNA, são indispensáveis dois oligonucleotídeos sintéticos.
32. Durante o processo de amplificação de uma sequencia de DNA in vitro, as soluções utilizadas não devem conter magnésio, cujo íon é um inibidor da polimerase.
33. Na técnica de PCR, as etapas de separação das fitas de anelamento com os primers e síntese da fita complementar são realizadas em temperaturas distintas.
34. A amplificação de um fragmento de DNA por PCR é muito eficiente, pois, ao serem realizados 30 ciclos de reações, são obtidas pouco menos de 1000 cópias da região de interesse.
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35. (UNESP – VUNESP – 2012) A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) quantitativa em tempo real permite
(A) a quantificação relativa ou absoluta do número de cópias do DNA e da expressão de genes e proteínas, pela utilização de iniciadores ou primers específicos marcados com fluorescência.
(B) a quantificação relativa ou absoluta do número de cópias do DNA e da expressão gênica, pela utilização de iniciadores ou primers específicos e uso de corante fluorescente ou sonda contendo uma molécula fluorescente.
(C) somente a quantificação relativa de número de cópias ou da expressão de genes específicos, pois essa metodologia requer o uso de amostras controle de referência. Desta forma, os dados obtidos são relativos à amostra controle.
(D) a quantificação relativa da expressão de genes e de proteínas, utilizando amostras de DNA ou RNA de alta qualidade.
(E) a quantificação relativa ou absoluta da expressão de proteínas em amostras de diversos tipos (blocos de parafina, tecidos congelados ou linhagens celulares) pelo uso de iniciadores ou primers marcados com fluorescência.
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36. (UNESP – VUNESP – 2012) Para se usar a metodologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para obter um clone de cDNA, deve-se:
(A) isolar e purificar o DNA genômico das células, sintetizar iniciadores ou primers específicos que flanqueiam o gene ou segmento de DNA a ser clonado e amplificar pela PCR. A PCR resultará na produção de várias cópias dos clones de cDNA selecionados.
(B) purificar o RNA mensageiro das células, realizar a transcrição reversa do RNA mensageiro utilizando oligo dT e uma enzima com atividade transcritase reversa para a produção de cDNA. Utilizar iniciadores específicos para amplificar o cDNA pela PCR e obter os clones de cDNA. 
(C) isolar e purificar o DNA genômico das células, cortar o DNA com enzimas de restrição flanqueando o gene de interesse, clonar o gene de interesse em um vetor adequado para o inserto e amplificar o inserto em células competentes. Após a amplificação do fragmento, isolar o DNA das células hospedeiras, amplificar o DNA com iniciadores que flanqueiem o gene de interesse. Desta forma, serão produzidas várias cópias do clone de cDNA.
(D) purificar o RNA mensageiro das células, sintetizar um primer contendo uma sequência oligo dA para a transcrição reversa do RNA mensageiro e produção de cDNA, utilizando a enzima transcritase reversa. Um segundo primer é adicionado e ocorre a amplificação do cDNA, produzindo um grande número de cópias do clone de cDNA.
(E) amplificar clones de DNA existentes pela aplicação da PCR, subclonar esses clones em células competentes, extrair e purificar o DNA desses clones, sintetizar iniciadores específicos e amplificar o DNA de interesse para a produção de várias cópias ou clones de cDNA.
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37. (FUND. SAÚDE – CEPERJ – 2011) A replicação do DNA dos eucariotos ocorre na fase S do ciclo celular. A replicação ocorre a partir de várias origens de replicação, sendo contínua numa fi ta e descontínua em outra fita. Várias enzimas participam desse processo, uma delas sintetiza um segmento de RNA iniciador da replicação a cada origem. Fazendo um paralelo com o que acontece no laboratório, na reação em cadeia pela polimerase (PCR) há também a necessidade da introdução na reação de iniciadores da síntese. Os iniciadores da PCR são formados por:
(A) segmentos pequenos de DNA
(B) segmentos pequenos de RNA
(C) ribonucleoproteínas
(D) peptídeos
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38. (FUND. SAÚDE – CEPERJ – 2011) Na reação em cadeia pela polimerase (PCR), nenhuma das DNAs polimerase humanas ou de outras espécies multicelulares puderam ser usadas na automação. A DNA polimerase que faz parte da reação é a Taq polimerase, que foi isolada de uma bactéria. A propriedade importante da Taq polimerase que a fez ser a DNA polimerase selecionada para a realização da PCR é que:
(A) ela adiciona nucleotídeos em qualquer direção
(B) ela adiciona nucleotídeos sem precisar de iniciadores
(C) ela não precisa de magnésio como cofator
(D) ela é termoestável a 90º
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39. (FUND. SAÚDE – CEPERJ – 2011) A técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR, polymerase chain reaction) possibilita a amplificação rápida in vitro de um pedaço de:
(A) DNA e de peptídeo
(B) DNA e de proteína
(C) peptídeo e de RNA
(D) DNA e de DNA complementar (DNAc)
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40. (FUND. SAÚDE – CEPERJ – 2011) A técnica a ser usada para medir a expressão gênica de um único gene viral a partir de uma população misturada de RNAs mensageiros humanos e virais é a de:
(A) microarranjos (microarray)
(B) reação em cadeia pela polimerase (PCR) quantitativa
(C) transcriptase reversa – reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) quantitativo
(D)
southern blot
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