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HISTÓRICO 1905 - Tswett - Iniciou a cromatografia de adsorção, pigmentos de plantas. 1941 -Martin, Synger - cromatografia de partição PRÊMIO NOBEL 1952 - Marti, James - cromatografia gasosa 1958 - Stahl - padronizou procedimentos para a CCF e os materiais. 1968 - KIRKLAND, HUBER, HORVATH - Promovem a CLAE MÉTODOS ESPECÍFICOS EM CLAE Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 1 MECANISMO DE SEPARAÇÃO DE DIFERENTES FORMAS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO (ADSORÇÃO) Está baseado nas interações do SOLUTO com os centros ativos de um ADSORVENTE SÓLIDO, finamente dividido = FE. Alumina (básica), Carvão ou SÍLICA GEL(ligeiramente ácida). Para CLAE partículas de até 5 m. FM - compete pelos sítios de adsorção polar, com as moléculas do soluto. São bem separados os solutos solúveis em solventes orgânicos. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO (PARTIÇÃO) Principio - distribuição das moléculas do soluto entre duas fases líquidas imiscíveis. Suporte inerte (sílica gel) que retém a fase líquida (FE) A CLL é dividida em duas categorias, com base nas polaridades relativas das FE e FM. CLL normal - quando a FE = polar e a FM = apolar. CLL invertida (reversa) - FE = apolar e a FM = polar. Na CLL as FE e FM são escolhidas para serem tão pouco solúveis uma na outra quanto possível, porém a FM pode provocar uma lenta remoção da FE. Solução: saturar a FM com a FE = pré-coluna. Neste item se encaixa a CROMATOGRAFIA DE PAR IÔNICO, por ser um processo de partição. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 2 CROMATOGRAFIA EM FASE LIGADA Superar problemas da CLL convencional. (Perda de FE) OH Si-OH + (1) C18-Si- Cl3 Si- O - Si - C18 + 3 HCl (2) H2O OH ligação covalente Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 3 AS LIGAÇÕES SILOXANO SÓ SÃO ATACADAS EM CONDIÇÕES MUITO ÁCIDAS (pH < 2) OU MUITO BÁSICAS (pH > 9). FASES QUÍMICAMENTE LIGADAS FASE NORMAL (FN) AMINO CIANO FASE REVERSA (FR) CIANO OCTADECIL FENIL Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 4 Si O Si CH3 Si O Si Si O Si CN Si O Si CN S i O S i NH 2 CROMATOGRAFIA POR PERMEAÇÃO DE GEL (EXCLUSÃO) SEPARAÇÃO POR TAMANHO E FORMAS MOLECULARES. FE CONSTITUÍDA POR MATERIAIS POROSOS, COM OS TAMANHOS DOS POROS ESTREITAMENTE CONTROLADOS. Bio-Gel - poliacrilamida, Sephadex - dextrano reticulado, não suportam pressão. Ultrastryragel (Waters) - micropartículas de copolímero de estireno / divinil-benzeno. Sílica ou vidro poroso. LIMITES DE EXCLUSÃO PARA O SEPHADEX TIPO LIMITE DE MASSA MOLECULAR EXCLUÍDO G-25 3500 - 4500 G-50 8000 - 10000 G-75 40000 - 50000 G-100 100.000 G-200 200.000 Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 5 CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA RESINA DE TROCA IÔNICA consistem em pérolas de substâncias orgânicas altamente polimerizadas, reticulados, contendo grande número de grupos ácidos ou básicos. Apesar das resinas serem insolúveis em água, os grupos ativos são hidrófilos e têm vários graus de afinidade para solutos iônicos. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 6 RESINAS DE TROCA IÔNICA PARA CROMATOGRAFIA Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 7 CROMATOGRAFIA EM FASE QUIRAL 25% das substâncias prescritas na terapêutica são comercializadas como misturas racêmicas. Quase sempre apenas um isômero é terapeuticamente ativo. As razões para o sucesso desta técnica são claras, pois além das vantagens de qualquer método de separação, acrescenta-se a separação de enanciômeros. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 8 COMPLEXAÇÃO ENANCIOSSELETIVA Duas moléculas reagem entre si quando começam a perturbar a energia eletrônica orbital uma da outra. Ex. ligações de H, interações dipolo-dipolo, interações estéricas RECONHECIMENTO QUIRAL Quando os enanciômeros passam através da FEQ cada um forma com esta um ADSORBATO TRANSITÓRIO (=DIÁSTEREOISOMERO) Os ADSORBATOS devem diferir adequadamente na energia livre para que a separação enanciomérica possa ser observada MÉTODOS DIRETOS E INDIRETOS DIRETOS: Uso de FEQs que formam complexos transitórios diastereoisoméricos com os enanciômeros do soluto. A diferença de estabilidade entre os complexos leva à diferença de separação. Trabalhos científicos uso de celulose/amilose, ciclodextrinas, como FE. INDIRETOS: Uso de aditivos quirais na fase móvel. Ex. ácido canforssulfônicos, quinina DESVANTAGENS: muito dispendiosos, modo de operação complexo Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 9 Determinação de V0 da coluna: volume interno da coluna (cilindro) Vi = . r 2 . C exemplo: Para uma coluna 4,6 x 150 mm Vi (coluna vazia) = 3,14 . (2,3) 2. 150 = 2492 L = 2,49mL V0 = 1/2 Vi = 1/2 . 2,49 = 1,245 mL TR0 = V0 / fluxo Se fluxo = 1mL/min. TR0 = V0 Quanto injetar? EVITAR SOBRECARGA VMÁXIMO 1% do VINTERNO VMÁXIMO = 0,0249 mL = 25 L (Loop) Coeficiente de distribuição ou de partição (K) K = quantidade de amostra / mL de FE = mL FM = quantidade de amostra / mL de FM mL FE Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 10 PARAMETROS PARA UMA SEPARAÇÃO E ANÁLISE EFICIENTES Relação de Capacidade (k’) - RETENÇÃO k’= VA - V0 = TRA - TR0 =T’RA = tempo na FE V0 TR0 TR0 tempo na FM Seletividade () - grau com que o sistema consegue diferenciar os componentes de uma mistura. = k’B = T’RB / TR0 = T’RB k’A T’RA/ TR0 T’RA Eficiência da coluna (N) = no de pratos teóricos AEPT = altura equivalente de um prato teórico (H) = L (cm)/ N N = 16 (TRB / WB) 2 ou N = 5,54 (TRB / W B) 2 Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 11 RESOLUÇÃO = Retenção . Separação. Eficiência R = k’ - 1 N 1 + k’ 4 Ajustando k’ através da polaridade da FM Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 12 SELETIVIDADE DA FM - característica química da FM () Coluna- C8 0,4x150mm, partícula 5m, fluxo 3,0mL/min, Temperatura 50 oC, detetor 254nm. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 13 INSTRUMENTAÇÃO Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 14 DETETORES QUALIDADES DE UM DETETOR IDEAL PARA CLAE 1-ALTA SENSIBILIDADE E BAIXO LIMITE DE DETECÇÃO 2- RESPOSTA RÁPIDA A TODOS OS SOLUTOS 3-INSENSIBILIDADE A MUDANÇAS NA TEMPERATURA E NA VAZÃO DA FM. 4- RESPOSTA INDEPENDENTE DA FM. 5- PEQUENA CONTRIBUIÇÃO AO ALARGAMENTO DO PICO, PELO VOLUME EXTRA DA CELA DO DETETOR 6- RESPOSTA QUE AUMENTE LINEARMENTE COM A QUANTIDADE DE SOLUTO 7- NÃO DESTRUIÇÃO DO SOLUTO Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 15 DETETORES USAR UMA CÉLULA DE REFERÊNCIA QUANDO SE APLICA GRADIENTE E OCORRE VARIAÇÃO SIGNIFICATIVA DE ABSORBÂNCIA PARA O ULTRAVIOLETA. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 16 PROPRIEDADES GERAIS DOS DETETORES EM TERMOS DE SUA APLICAÇÃO 1-RESPOSTASELETIVO AMOSTRA ESPECÍFICA UNIVERSAL QUALQUER AMOSTRA 2- SENSIBILIDADE RELAÇÃO ENTRE O SINAL PRODUZIDO E A QUANTIDADE DE AMOSTRA QUE GERA ESTE SINAL 3-RUÍDO É A VARIAÇÃO NO SINAL DO INSTRUMENTO QUE NÃO É ATRIBUÍDA A AMOSTRA. PODE ACONTECER POR: FALHAS ELETRÔNICAS, VARIAÇÕES DE FLUXO OU TEMPERATURA, FLUTUAÇÃO NA VOLTAGEM, BOLHAS DE AR NO DETETOR. QMD (QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL) É A QUANTIDADE DE AMOSTRA QUE PRODUZ UM SINAL IGUAL AO DOBRO DO NÍVEL DE RUÍDO DO INSTRUMENTO. 4-LINEARIDADE PARA SE UTILIZAR UM SINAL GERADO PELO DETETOR COMO UMA MEDIDA QUANTITATIVA, ESTE SINAL DEVE SER DIRETAMENTE PROPORCIONAL À CONCENTRAÇÃO DO SOLUTO. 5- ESTABILIDADE UM BOM DETETOR DEVE SER INSENSÍVEL AS TROCAS DE TEMPERATURA E A VARIAÇÃO DE FLUXO E COMPATÍVEL COM PROGRAMAÇÕES DA FASE MÓVEL. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 17 DETECTOR DE ULTRAVIOLETA Altamente seletivo, depende da propriedade do composto Quantidade mínima de detecção - 10 -6 g/mL Baixa sensibilidade à temperatura Não é sensível à vazão da FM Útil com gradiente SELEÇÃO DE 1 COMPRIMENTO DE ONDA POR VEZ a escolha do analista ou fixo em 254 nm (absorbância de anel aromático) Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 18 DETECTOR DE ULTRAVIOLETA COM FOTODIODO Permite coletar os dados de um pico em vários comprimento de onda simultaneamente. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 19 DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA Altamente seletivo, depende da propriedade do composto Quantidade mínima de detecção - 10 -12 g/mL Baixa sensibilidade à temperatura Não é sensível à vazão da FM Útil com gradiente DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRAÇÃO Universal ( para qualquer substância) Quantidade mínima de detecção - 10 -7 g/mL Alta sensibilidade à temperatura Não é sensível à vazão da FM Não pode ser usado com gradiente Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 20 DETECTOR ELETROQUÍMICO seletivo, depende da propriedade do composto (oxi-redução) Quantidade mínima de detecção - 10 -12 g/mL Média sensibilidade à temperatura Sensível à vazão da FM Não pode ser usado com gradiente DETECTOR POR CONDUTIVIDADE ELÉTRICA seletivo, depende da propriedade do composto - condutividade elétrica, devido a presença de íons Quantidade mínima de detecção - 10 -8 g/mL Média sensibilidade à temperatura Sensível à vazão da FM Não pode ser usado com gradiente Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 21 ANÁLISE QUANTITATIVA É baseada numa comparação da altura ou da área do pico da substância em análise com um ou mais padrões. Sob condições controladas estes parâmetros variam linearmente com a concentração. REQUISITOS PARA QUANTIFICAÇÃO EFICIENTE Boa resolução dos picos. T= W0,05 / 2f Cálculo da simetria do pico é determinado para o padrão, estando descrito em cada monografia. Ex. Haloperidol - fator de calda < 2,0 Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 22 Precisão das injeções da solução padrão. 5 injeções DPR < 2,0 % 6 injeções DPR > 2,0 % Cada pico representa apenas uma substância. Não pode haver adsorção e/ou decomposição dos compostos no sistema cromatográfico. Existência de substâncias de pureza confiável para serem usadas como padrões. Amostra deve ser representativa do total. Técnica de injeção correta. Evitar sobrecarga. Injeção com seringa usar VÁLVULA DE VOLUME FIXO, aumenta a precisão. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 23 VOLUME INJETADO 20 L 10 L 2 L DESVIO PADRÃO % (para seringa de 25 L) 0,25 0,5 2,5 MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA SUBSTÂNCIA ATIVA NA AMOSTRA ALTURA DO PICO Variáveis que devem ser controladas rigorosamente no método da altura do pico: temperatura fluxo da FM Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 24 ÁREA DO PICO - neste método as variáveis anteriores não influenciam. Métodos manuais: Triangulação Área = Wbase . h 2 Triangulação à meia altura Área = Wbase, 1/2h .h Trapezoidal Área = (W15% + W85%) h 2 Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 25 INTEGRAÇÃO AUTOMÁTICA A maioria dos instrumentos cromatográficos modernos são equipados com integrador eletrônico digital que permite com precisão a estimativa da área do pico. MÉTODOS PARA CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DA SUBSTÂNCIA PADRÃO EXTERNO - preparação de padrões de concentração semelhante à amostra e o ensaio cromatográfico nas mesmas condições de operação. ÁREA PADRÃO = ÁREA AMOSTRA CONC. PADRÃO CONC. AMOSTRA Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 26 MÉTODOS PARA MEDIDA DA ÁREA EXATIDÃO DO MÉTODO DE ACORDO COM ASSIMETRIA DO PICO 1,0 1,5 2,0 2,5 TRIANGULAÇÃO 96.8 92.9 90.4 83.4 % TRIANGULAÇÃO À MEIA ALTURA 93.9 93.1 92.5 82.5 % TRAPEZOIDAL 100.4 100.4 100.5 100.7 % PADRÃO INTERNO - são evitadas as variáveis introduzidas pela amostra. Neste procedimento, uma quantidade medida cuidadosamente de uma substância denominada, padrão interno, é introduzida em quantidades iguais no padrão e na amostra. ÁREA PADRÃO / ÁREA PI = ÁREA AMOSTRA / ÁREA PI CONC. PADRÃO CONC. AMOSTRA CONSIDERAÇÕES SOBRE O PADRÃO INTERNO DEVE SER QUIMICAMENTE SEMELHANTE A AMOSTRA APRESENTAR ÁREA SIMILAR À AMOSTRA ELUIR PRÓXIMO À AMOSTRA SER ESTÁVEL NÃO FAZER PARTE DA AMOSTRA RESULTAR EM PICOS COMPLETAMENTE RESOLVIDOS (R>1,5) ESCOLHA DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO Informações sobre a amostra e os objetivos da análise Necessidade de procedimentos especiais (tratamento da amostra ...) Escolha do detector e sua sensibilidade Escolha do método cromatográfico, teste preliminares, estimar as melhores condições de separação. Otimizar as condições de separação Verificar sobre problemas que necessitam de tratamentos especiais. Avaliar se o método pode ser usado em rotina de laboratório. Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 27
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