Aula CLAE

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HISTÓRICO 
1905 - Tswett - Iniciou a cromatografia de adsorção, pigmentos de plantas. 
1941 -Martin, Synger - cromatografia de partição PRÊMIO NOBEL 
1952 - Marti, James - cromatografia gasosa 
1958 - Stahl - padronizou procedimentos para a CCF e os materiais. 
1968 - KIRKLAND, HUBER, HORVATH - Promovem a CLAE 
MÉTODOS ESPECÍFICOS EM CLAE 
Profa. Dra. Sheila Garcia / Analises Farmacêutica 1 
MECANISMO DE SEPARAÇÃO DE DIFERENTES FORMAS DE 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO (ADSORÇÃO) 
Está baseado nas interações do SOLUTO com os centros ativos de um 
ADSORVENTE SÓLIDO, finamente dividido = FE. 
 Alumina (básica), Carvão ou SÍLICA GEL(ligeiramente ácida). 
Para CLAE partículas de até 5 m. 
 FM - compete pelos sítios de adsorção polar, com as moléculas do soluto. 
 São bem separados os solutos solúveis em solventes orgânicos. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-LÍQUIDO (PARTIÇÃO) 
Principio - distribuição das moléculas do soluto entre duas fases líquidas imiscíveis. 
 Suporte inerte (sílica gel) que retém a fase líquida (FE) 
A CLL é dividida em duas categorias, com base nas polaridades relativas das FE e 
FM. 
 CLL normal - quando a FE = polar e a FM = apolar. 
 CLL invertida (reversa) - FE = apolar e a FM = polar. 
Na CLL as FE e FM são escolhidas para serem tão pouco solúveis uma na outra 
quanto possível, porém a FM pode provocar uma lenta remoção da FE. 
 Solução: saturar a FM com a FE = pré-coluna. 
Neste item se encaixa a CROMATOGRAFIA DE PAR IÔNICO, por ser um processo de 
partição. 
 
 
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CROMATOGRAFIA EM FASE LIGADA 
 
Superar problemas da CLL convencional. (Perda de FE) 
 
 
 OH 
 Si-OH + (1) C18-Si- Cl3 Si- O - Si - C18 + 3 HCl 
 (2) H2O OH ligação covalente 
 
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AS LIGAÇÕES SILOXANO SÓ SÃO 
ATACADAS EM CONDIÇÕES 
MUITO ÁCIDAS (pH < 2) OU MUITO 
BÁSICAS (pH > 9). 
 
FASES QUÍMICAMENTE LIGADAS 
FASE NORMAL (FN) 
 
AMINO 
 
 CIANO 
 
FASE REVERSA (FR) 
 
CIANO 
 
OCTADECIL 
 
 
FENIL 
 
 
 
 
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Si O Si CH3
Si O Si
Si O Si
CN
Si O Si
CN
S i O S i NH 2 
CROMATOGRAFIA POR PERMEAÇÃO DE GEL (EXCLUSÃO) 
 
SEPARAÇÃO POR TAMANHO E FORMAS MOLECULARES. 
FE CONSTITUÍDA POR MATERIAIS POROSOS, COM OS TAMANHOS DOS POROS 
ESTREITAMENTE CONTROLADOS. 
 Bio-Gel - poliacrilamida, Sephadex - dextrano reticulado, não suportam pressão. 
 Ultrastryragel (Waters) - micropartículas de copolímero de estireno / divinil-benzeno. 
 Sílica ou vidro poroso. 
 
LIMITES DE EXCLUSÃO PARA O SEPHADEX 
 
 TIPO LIMITE DE MASSA 
 MOLECULAR EXCLUÍDO 
 G-25 3500 - 4500 
 G-50 8000 - 10000 
 G-75 40000 - 50000 
 G-100 100.000 
 G-200 200.000 
 
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CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA 
 
 RESINA DE TROCA IÔNICA consistem em pérolas de substâncias orgânicas 
altamente polimerizadas, reticulados, contendo grande número de grupos ácidos ou 
básicos. 
 Apesar das resinas serem insolúveis em água, os grupos ativos são hidrófilos e 
têm vários graus de afinidade para solutos iônicos. 
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 RESINAS DE TROCA IÔNICA PARA CROMATOGRAFIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 CROMATOGRAFIA EM FASE QUIRAL 
 
 25% das substâncias prescritas na terapêutica são comercializadas como 
misturas racêmicas. 
 
 Quase sempre apenas um isômero é terapeuticamente ativo. 
 
 As razões para o sucesso desta técnica são claras, pois além das vantagens de 
qualquer método de separação, acrescenta-se a separação de enanciômeros. 
 
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 COMPLEXAÇÃO ENANCIOSSELETIVA 
 
Duas moléculas reagem entre si quando começam a perturbar a energia eletrônica orbital uma da outra. 
Ex. ligações de H, interações dipolo-dipolo, interações estéricas 
 
 RECONHECIMENTO QUIRAL 
 
 Quando os enanciômeros passam através da FEQ cada um forma com esta um ADSORBATO 
TRANSITÓRIO (=DIÁSTEREOISOMERO) 
 
 Os ADSORBATOS devem diferir adequadamente na energia livre para que a separação enanciomérica 
possa ser observada 
 
 MÉTODOS DIRETOS E INDIRETOS 
 DIRETOS: 
Uso de FEQs que formam complexos transitórios diastereoisoméricos com os enanciômeros do soluto. 
 
A diferença de estabilidade entre os complexos leva à diferença de separação. 
 
Trabalhos científicos uso de celulose/amilose, ciclodextrinas, como FE. 
 
 INDIRETOS: 
 Uso de aditivos quirais na fase móvel. 
Ex. ácido canforssulfônicos, quinina 
 
 DESVANTAGENS: muito dispendiosos, modo de operação complexo 
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Determinação de V0 da coluna: 
volume interno da coluna (cilindro) Vi =  . r
2 . C 
exemplo: Para uma coluna 4,6 x 150 mm 
Vi (coluna vazia) = 3,14 . (2,3)
2. 150 = 2492 L = 2,49mL 
V0 = 1/2 Vi = 1/2 . 2,49 = 1,245 mL 
TR0 = V0 / fluxo Se fluxo = 1mL/min. TR0 = V0 
 
Quanto injetar? EVITAR SOBRECARGA 
VMÁXIMO  1% do VINTERNO 
VMÁXIMO = 0,0249 mL = 25 L (Loop) 
 
 
Coeficiente de distribuição ou de partição (K) 
K = quantidade de amostra / mL de FE = mL FM =  
 quantidade de amostra / mL de FM mL FE 
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PARAMETROS PARA UMA SEPARAÇÃO E ANÁLISE EFICIENTES 
 Relação de Capacidade (k’) - RETENÇÃO 
k’= VA - V0 = TRA - TR0 =T’RA = tempo na FE 
 V0 TR0 TR0 tempo na FM 
Seletividade () - grau com que o sistema consegue diferenciar os componentes de 
uma mistura. 
 = k’B = T’RB / TR0 = T’RB 
 k’A T’RA/ TR0 T’RA 
Eficiência da coluna (N) = no de pratos teóricos 
AEPT = altura equivalente de um prato teórico (H) = L (cm)/ N 
N = 16 (TRB / WB)
2 ou N = 5,54 (TRB / W B)
2 
 
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RESOLUÇÃO = Retenção . Separação. Eficiência 
 R = k’  - 1 N 
 1 + k’  4 
Ajustando k’ através da polaridade da FM 
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SELETIVIDADE DA FM - característica química da FM () 
Coluna- C8 0,4x150mm, partícula 5m, fluxo 3,0mL/min, Temperatura 50
oC, detetor 254nm. 
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 INSTRUMENTAÇÃO 
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DETETORES 
QUALIDADES DE UM DETETOR IDEAL PARA CLAE 
1-ALTA SENSIBILIDADE E BAIXO LIMITE DE DETECÇÃO 
2- RESPOSTA RÁPIDA A TODOS OS SOLUTOS 
3-INSENSIBILIDADE A MUDANÇAS NA TEMPERATURA E NA VAZÃO DA FM. 
4- RESPOSTA INDEPENDENTE DA FM. 
5- PEQUENA CONTRIBUIÇÃO AO ALARGAMENTO DO PICO, PELO VOLUME EXTRA DA 
CELA DO DETETOR 
6- RESPOSTA QUE AUMENTE LINEARMENTE COM A QUANTIDADE DE SOLUTO 
7- NÃO DESTRUIÇÃO DO SOLUTO 
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DETETORES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
USAR UMA CÉLULA DE REFERÊNCIA QUANDO SE APLICA GRADIENTE E 
OCORRE VARIAÇÃO SIGNIFICATIVA DE ABSORBÂNCIA PARA O ULTRAVIOLETA. 
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 PROPRIEDADES GERAIS DOS DETETORES EM TERMOS DE SUA APLICAÇÃO 
1-RESPOSTASELETIVO AMOSTRA ESPECÍFICA 
UNIVERSAL QUALQUER AMOSTRA 
2- SENSIBILIDADE 
 RELAÇÃO ENTRE O SINAL PRODUZIDO E A QUANTIDADE DE AMOSTRA QUE GERA 
ESTE SINAL 
3-RUÍDO 
É A VARIAÇÃO NO SINAL DO INSTRUMENTO QUE NÃO É ATRIBUÍDA A AMOSTRA. 
PODE ACONTECER POR: FALHAS ELETRÔNICAS, VARIAÇÕES DE FLUXO OU 
TEMPERATURA, FLUTUAÇÃO NA VOLTAGEM, BOLHAS DE AR NO DETETOR. 
QMD (QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL)  É A QUANTIDADE DE AMOSTRA QUE 
PRODUZ UM SINAL IGUAL AO DOBRO DO NÍVEL DE RUÍDO DO INSTRUMENTO. 
4-LINEARIDADE 
PARA SE UTILIZAR UM SINAL GERADO PELO DETETOR COMO UMA MEDIDA 
QUANTITATIVA, ESTE SINAL DEVE SER DIRETAMENTE PROPORCIONAL À 
CONCENTRAÇÃO DO SOLUTO. 
5- ESTABILIDADE 
UM BOM DETETOR DEVE SER INSENSÍVEL AS TROCAS DE TEMPERATURA E A 
VARIAÇÃO DE FLUXO E COMPATÍVEL COM PROGRAMAÇÕES DA FASE MÓVEL. 
 
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 DETECTOR DE ULTRAVIOLETA 
Altamente seletivo, depende da propriedade do composto 
Quantidade mínima de detecção - 10 -6 g/mL 
Baixa sensibilidade à temperatura 
Não é sensível à vazão da FM 
Útil com gradiente 
SELEÇÃO DE 1 COMPRIMENTO DE ONDA POR VEZ a escolha do analista ou fixo 
em 254 nm (absorbância de anel aromático) 
 
 
 
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 DETECTOR DE ULTRAVIOLETA COM FOTODIODO 
 Permite coletar os dados de um pico em vários comprimento de onda simultaneamente. 
 
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 DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA 
Altamente seletivo, depende da propriedade do composto 
Quantidade mínima de detecção - 10 -12 g/mL 
Baixa sensibilidade à temperatura 
Não é sensível à vazão da FM 
Útil com gradiente 
 
 DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRAÇÃO 
 Universal ( para qualquer substância) 
 Quantidade mínima de detecção - 10 -7 g/mL 
 Alta sensibilidade à temperatura 
 Não é sensível à vazão da FM 
 Não pode ser usado com gradiente 
 
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 DETECTOR ELETROQUÍMICO 
 seletivo, depende da propriedade do composto (oxi-redução) 
 Quantidade mínima de detecção - 10 -12 g/mL 
 Média sensibilidade à temperatura 
 Sensível à vazão da FM 
 Não pode ser usado com gradiente 
 
 DETECTOR POR CONDUTIVIDADE ELÉTRICA 
 seletivo, depende da propriedade do composto - condutividade elétrica, devido a 
presença de íons 
 Quantidade mínima de detecção - 10 -8 g/mL 
 Média sensibilidade à temperatura 
 Sensível à vazão da FM 
 Não pode ser usado com gradiente 
 
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 ANÁLISE QUANTITATIVA 
 
 É baseada numa comparação da altura ou da área do pico da substância em 
análise com um ou mais padrões. 
 Sob condições controladas estes parâmetros variam linearmente com a 
concentração. 
 
 REQUISITOS PARA QUANTIFICAÇÃO EFICIENTE 
 Boa resolução dos picos. 
 
 
 
 
 
 
 
 T= W0,05 / 2f Cálculo da simetria do pico é determinado para o padrão, estando 
descrito em cada monografia. 
Ex. Haloperidol - fator de calda < 2,0 
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 Precisão das injeções da solução padrão. 
 5 injeções DPR < 2,0 % 
 6 injeções DPR > 2,0 % 
 Cada pico representa apenas uma substância. 
 Não pode haver adsorção e/ou decomposição dos compostos no sistema 
cromatográfico. 
 Existência de substâncias de pureza confiável para serem usadas como 
padrões. 
 Amostra deve ser representativa do total. 
 Técnica de injeção correta. 
 Evitar sobrecarga. 
 Injeção com seringa 
 
 
 
 
 
 usar VÁLVULA DE VOLUME FIXO, aumenta a precisão. 
 
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VOLUME INJETADO 20 L 10 L 2 L
DESVIO PADRÃO %
(para seringa de 25 L) 0,25 0,5 2,5
 MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA SUBSTÂNCIA ATIVA 
NA AMOSTRA 
 ALTURA DO PICO 
 Variáveis que devem ser controladas rigorosamente no método da altura do 
pico: 
 temperatura 
 fluxo da FM 
 
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 ÁREA DO PICO - neste método as variáveis anteriores não influenciam. 
 
 Métodos manuais: 
 Triangulação Área = Wbase . h 
 2 
 Triangulação à meia altura Área = Wbase, 1/2h .h 
 
 Trapezoidal Área = (W15% + W85%) h 
 2 
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 INTEGRAÇÃO AUTOMÁTICA 
 A maioria dos instrumentos cromatográficos modernos são equipados com integrador 
eletrônico digital que permite com precisão a estimativa da área do pico. 
 
 MÉTODOS PARA CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DA SUBSTÂNCIA 
 
 PADRÃO EXTERNO - preparação de padrões de concentração semelhante à 
amostra e o ensaio cromatográfico nas mesmas condições de operação. 
 
ÁREA PADRÃO = ÁREA AMOSTRA 
CONC. PADRÃO CONC. AMOSTRA 
 
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MÉTODOS PARA
MEDIDA DA
ÁREA
EXATIDÃO DO MÉTODO DE
ACORDO COM ASSIMETRIA DO
PICO
1,0 1,5 2,0 2,5
TRIANGULAÇÃO 96.8 92.9 90.4 83.4 %
TRIANGULAÇÃO
À MEIA ALTURA
93.9 93.1 92.5 82.5 %
TRAPEZOIDAL 100.4 100.4 100.5 100.7 %
 PADRÃO INTERNO - são evitadas as variáveis introduzidas pela amostra. 
 Neste procedimento, uma quantidade medida cuidadosamente de uma 
substância denominada, padrão interno, é introduzida em quantidades iguais 
no padrão e na amostra. 
 
ÁREA PADRÃO / ÁREA PI = ÁREA AMOSTRA / ÁREA PI 
CONC. PADRÃO CONC. AMOSTRA 
 
 CONSIDERAÇÕES SOBRE O PADRÃO INTERNO 
 DEVE SER QUIMICAMENTE SEMELHANTE A AMOSTRA 
 APRESENTAR ÁREA SIMILAR À AMOSTRA 
 ELUIR PRÓXIMO À AMOSTRA 
 SER ESTÁVEL 
 NÃO FAZER PARTE DA AMOSTRA 
 RESULTAR EM PICOS COMPLETAMENTE RESOLVIDOS (R>1,5) 
 
 ESCOLHA DA FM NO DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO 
 Informações sobre a amostra e os objetivos da análise 
 Necessidade de procedimentos especiais (tratamento da amostra ...) 
 Escolha do detector e sua sensibilidade 
 Escolha do método cromatográfico, teste preliminares, estimar as melhores condições de 
separação. 
 Otimizar as condições de separação 
 Verificar sobre problemas que necessitam de tratamentos especiais. 
 Avaliar se o método pode ser usado em rotina de laboratório. 
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