Validação de Metodologia Analítica

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Validação de Metodologia Analítica 
ICH 
 INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION OF 
TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF 
PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE 
VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND 
METHODOLOGY Q2(R1) 
Ficou em consulta pública desde novembro de 1995 
Novembro de 2005 
 
 
RE 899 – 29/05/2003 
"Guia para validação de métodos analíticos e 
bioanalíticos" 
Sheila Garcia - Analises Farmacêuticas 
Introdução 
 Por que é necessário a monitoração 
analítica? 
 “Evidência documentada de que um sistema se 
encontra em grau de fazer aquilo que propõem de 
forma consistente e dentro das especificações e 
atributos de qualidade pré-estabelecidos.” 
 
 Qual o objetivo da validação analítica? 
◦ “Demonstrar que o método é apropriado para a 
finalidade pretendida, ou seja, determinação 
qualitativa, semi quantitativa e quantitativa de 
fármacos e outras substâncias em produtos 
farmacêuticos. 
Sheila Garcia - Analises Farmacêuticas 
Técnicas analíticas: 
 métodos de cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia líquida de 
alta eficiência (CLAE); 
 métodos não-cromatográficos, desde que estes ofereçam uma 
seletividade aceitável (por ex. titulometria, espectrofotometria UV-
VIS); 
Testes imunológicos ou microbiológicos: desde que observado o grau 
de variabilidade usualmente associado a estas técnicas. 
 
 
 
A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o 
método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a 
confiabilidade dos resultados. 
 deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, 
sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise. 
 
 
Deve-se utilizar substâncias de referência oficializadas pela Farmacopéia 
Brasileira ou, na ausência destas, por outros códigos autorizados pela 
legislação vigente. No caso da inexistência dessas substâncias, será 
admitido o uso de padrões de trabalho, desde que a identidade e o 
teor sejam devidamente comprovados. 
Sheila Garcia - Analises Farmacêuticas 
 No caso de metodologia analítica descrita 
em farmacopéias ou formulários oficiais, 
devidamente reconhecidos pela ANVISA, a 
metodologia será considerada validada. 
 No caso de metodologia analítica não 
descrita em farmacopéias ou formulários 
oficiais, devidamente reconhecidos pela 
ANVISA, a metodologia será considerada 
validada, desde que sejam avaliados os 
parâmetros relacionados a seguir, conforme 
especificado nas Tabelas 1 e 2. 
 
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Classificação dos testes. 
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Categoria Finalidade do teste 
I 
Testes quantitativos para a determinação do princípio ativo em 
produtos farmacêuticos ou matérias–primas 
II 
Testes quantitativos ou ensaio limite para a determinação de 
impurezas e produtos de degradação em produtos farmacêuticos e 
matérias-primas 
III Testes de performance (por exemplo: dissolução, liberação do ativo) 
IV Testes de identificação 
Para a garantia da qualidade do resultado analítico, todos os 
equipamentos utilizados na validação devem estar devidamente 
calibrados e os analistas devem ser qualificados e treinados 
Ensaios necessários 
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Parâmetro 
Categoria I 
Categoria II Categoria 
III 
Categoria 
IV 
Quantitativo Ensaio limite 
Especificidade Sim Sim Sim * Sim 
Linearidade Sim Sim Não * Não 
Intervalo Sim Sim * * Não 
Precisão 
Repetibilidade Sim Sim Não Sim Não 
Intermediária ** ** Não ** Não 
Limite de detecção Não Não Sim * Não 
Limite de quantificação Não Sim Não * Não 
Exatidão Sim Sim * * Não 
Robustez Sim Sim Sim Não Não 
• pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico. 
 
** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da 
Precisão Intermediária. 
 
 A metodologia analítica deverá ser 
revalidada nas seguintes circunstâncias 
 mudanças na síntese da substância ativa; 
 mudanças na composição do produto acabado; 
 mudanças no procedimento analítico. 
 
 Determinadas outras mudanças podem 
requerer validação também, 
dependendo da natureza das mudanças. 
 
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Os parâmetros de validação análítica 
envolvem: 
 Especificidade/Seletividade, 
 Linearidade, 
 Intervalo de trabalho, 
 Precisão 
Repetitividade, 
intermediária e 
 Reprodutividade 
 Limite de Detecção, 
 Limite de Quantificação, 
 Exatidão, 
 Robustez. 
 
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ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE 
 ESPECIFICIDADE 
É a capacidade que o método possui de medir exatamente o composto 
de interesse na presença de outros componentes tais como impurezas, 
produtos de degradação e componentes da matriz. 
 
 SELETIVIDADE 
Capacidade de detecção de substâncias 
A seletividade avalia o grau de interferência de espécies como outro ingrediente ativo, excipientes, 
impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades similares 
que possam estar, porventura, presentes. A seletividade garante que o pico de resposta 
(MÉTODO CROMATOGRÁFICO) seja exclusivamente do composto de interesse. 
 
 
 Utilização de detectores de CLAE modernos (Ex. arranjo de fotodiodos, 
espectrômetro de massas) comparam o espectro obtido na separação com o de 
um padrão, isto pode ndicar um composto puro; 
 Adição padrão: preparação de uma curva analítica com a adição da substância de 
interesse na amostra comparada com uma curva analítica só com o padrão. 
 
 
 
 
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LINEARIDADE 
 É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os 
resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração da 
na amostra, dentro de um intervalo especificado. 
 
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y = ax + b 
Intercepto (coef linear) 
inclinação (coef angular) Váriavel independente 
Váriavel dependente 
O critério mínimo aceitável do coeficiente de correlação (r) deve ser = 0,99 
Correlação entre os pontos de uma mesma reta. 
y = 0,0428x - 0,0093 
 
,000
,2000
,4000
,6000
,8000
1,000
1,2000
1,4000
,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000
A
b
so
rb
ân
ci
a 
2
8
0
 n
m
 
Concentração mg/ml 
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04
A
na
lit
o c
al
cu
la
do
 em
 m
g/
m
L
Reference material mg/ml
Linearidade 
material referencia x analito calculado 
Tabela dos valores 
(x,y) 
 
 
x 
 
y 
 
 
# 
 
Reference 
material mg/ml 
 
Calculated 
mg/ml 
 1 
 
0.0100 
 
0.0101 
 2 
 
0.0150 
 
0.0145 
 3 
 
0.0200 
 
0.0210 
 4 
 
0.0250 
 
0.0260 
 5 
 
0.0300 
 
0.0294 
 6 
 
0.0400 
 
0.0410 
 
Validação - Linearidade 
R2= coeficiente de determinação 
(0 -1) sendo 1= 100% de correspondencia 
INTERVALO DE TRABALHO 
 O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior 
e inferior de um método analítico. Normalmente é derivado do estudo de 
linearidade e depende da aplicação pretendida do método 
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Ensaio Alcance 
 
Determinação quantitativa do 
analito em matérias-primas 
ou em formas farmacêuticas 
De 80% a 120% da concentração teórica do 
teste 
 
Determinação de impurezas 
 
Do nível de impureza esperado até 120% do 
limite máximo especificado. Quando 
apresentarem importância toxicológica ou 
efeitosfarmacológicos inesperados, os limites 
de quantificação e detecção devem ser 
adequados às quantidades de impurezas a 
serem controladas 
Uniformidade de conteúdo 
 
70 a 130% da concentração teórica do teste 
Ensaio de dissolução 
 
De ± 20% sobre o valor especificado para o 
intervalo. Caso a especificação para a 
dissolução envolva mais que um tempo, o 
alcance do método deve incluir -20% sobre o 
menor valor e +20% sobre o maior valor. 
PRECISÃO 
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 A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma 
série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. 
Esta é considerada em três níveis: 
◦ Repetibilidade (precisão intra-ensaio) - concordância entre os resultados 
dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma 
instrumentação. A repetibilidade do método é verificada por no mínimo 9 
(nove) determinações, contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 
(três) concentrações, baixa, média e alta, com 3(três) réplicas cada 
ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do teste, 
◦ Precisão intermediária (inter-ensaio) -concordância entre os resultados do 
mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas 
diferentes e/ou equipamentos diferentes. Para a determinação da precisão 
intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas 
diferentes, 
◦ Reprodutibilidade (interlaboratorial) - concordância entre os resultados 
obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente 
aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão 
de metodologia em farmacopéias. 
 
 A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou 
 coeficiente de variação (CV%) 
 DPR< 2% bom e DPR< 5% aceitável 
 Limite de detecção 
Limite de detecção é a menor quantidade do analito 
presente em uma amostra que pode ser detectado, 
porém não necessariamente quantificado, sob as 
condições experimentais estabelecidas. 
 a estimativa do limite de detecção pode ser feita 
com base na relação de 3 vezes o ruído da linha de 
base. 
Pode ser determinado pela equação, 
 LD = DPa x 3 / IC, 
Onde: 
• DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no 
mínimo, 3 curvas de calibração construídas contendo 
concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de 
quantificação. 
• Este desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de 
calibração proveniente da análise de um número apropriado de 
amostras do branco; 
• IC é a inclinação da curva de calibração. 
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 Limite de Quantificação 
 é a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser 
determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições 
experimentais estabelecidas. Principalmente usado para quantificar 
impurezas, produtos de degradação em fármacos e produtos de 
degradação em formas farmacêuticas e é expresso como concentração do 
analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/V, partes por milhão) na 
amostra. 
 
 determinando-se o ruído da linha de base e considera-
se como limite de quantificação aquela concentração 
que produza relação sinal-ruído superior a 10:1. 
Pode ser determinado pela equação, 
 LD = DPa x 10 / IC, 
Onde: 
• DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de, no mínimo, 3 
curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco 
próximas ao suposto limite de quantificação. 
• Este desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da curva de calibração 
proveniente da análise de um número apropriado de amostras do branco; 
• IC é a inclinação da curva de calibração. 
LQ, LD e Razão sinal x ruido 
 Limite de Quantificação 
 Limite de Detecção 
 Razão sinal ruido 
ruido 
Pico A 
LD 
Pico B 
LQ 
Linha de 
base 
Validation 
EXATIDÃO 
Sheila Garcia - Analises Farmacêuticas 
 A exatidão de um método analítico é a concordância entre os valores 
dos resultados obtidos pelo método em estudo em relação ao seu 
valor verdadeiro; 
 ICH e ANVISA estabelecem a obediência de um mínimo de 9 
determinações de 3 níveis de concentração (3 concentrações em 
triplicata = 9 determinações) 
 Consititui a chave da validação; 
 Recuperação (%) deve estar entre 98 a 102%. 
 
EXATIDÃO – ADIÇÃO DE PADRÃO 
Sheila Garcia - Analises Farmacêuticas 
 É o método mais utilizado para validação de processos 
analíticos; 
 Utilizado quando for difícil ou impossível preparar ou obter 
um branco da matriz sem a substância de interesse; 
 Consiste na "fortificação" da amostra, ou seja, na adição de 
soluções com diferentes concentrações do analito de 
interesse seguida pela determinação da concentração do 
analito adicionado. 
 Quantidades conhecidas da substância são adicionadas em 
diferentes níveis numa matriz da amostra, antes do 
procedimento de preparo da amostra, que já contenha 
quantidades (desconhecidas) da substância; 
 A amostra sem adição do padrão e cada uma das amostras 
com o padrão adicionado devem ser analisadas e as 
quantidades medidas relacionadas com a quantidade 
adicionada. 
ROBUSTEZ 
 Cromatografia Líquida 
· Variação do pH da fase móvel 
· Variação na composição da fase móvel 
· Diferentes lotes ou fabricantes de colunas 
· Temperatura 
· Fluxo da fase móvel 
 Espectrofotometria 
· Variação do pH da solução 
· Temperatura 
· Diferentes fabricantes de solventes 
 Preparo das Amostras 
· Estabilidade das soluções analíticas 
· Tempo de extração 
 
Sheila Garcia - Analises Farmacêuticas 
Esse critério mostra a confiabilidade de um resultado analítico quando o 
método é submetido a variações deliberadas de condições analíticas.