04 - Métodos analíticos I - Microscopia

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06/09/2013
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MÉTODOS ANALÍTICOS PARA O 
ESTUDO DA CÉLULA - MICROSCOPIA
O QUE É MICROSCOPIA?
Microscópio  grego: micron = 
pequeno + scopos = observar;
Instrumento para observar objetos muito 
pequenos para serem vistos a olho nu;
Microscopia: ciência que investiga 
pequenos objetos pelo uso de 
microscópios.
ESCALAS DE APROXIMAÇÃO – CÉLULA VS ÁTOMO
Ótimo vídeo: Powers of ten (1977)
http://youtu.be/0fKBhvDjuy0
HISTÓRIA DO MICROSCÓPIO
Ainda há muito debate sobre quem inventou o microscópio;
Lentes e tubos com água eram usados por chineses há mais de 2000 a.C;
1590 – holandeses Hans e Zacharias Jansen inventaram o primeiro microscópio 
composto;
1609 – Galileo Galilei inventa o occhiolino, outro microscópio composto;
1665 – Robert Hooke cunha o termo célula para estruturas de cortiça;
1674 – Antony van Leeuwenhoek, um comerciante holandês, trouxe o microscópio à 
atenção de biólogos  descreveu animais unicelulares (animálculos) e estruturas 
celulares.
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MICROSCÓPIO DE GALILEO E DE HOOKE MICROSCÓPIO DE LEEUWENHOEK
Maior poder de aumento = lentes pequenas;
Lentes esféricas;
Artefatos: aberrações esféricas e cromáticas;
P = 1/f dificuldades no uso desse tipo de microscópio;
Animálculos observados por Leeuwenhoek
MICROSCÓPIO MODERNO SIMPLIFICANDO...
1 – Condensadora;
2 – Objetivas;
3 – Oculares;
Além disso:
 Base, suporte, fonte de luz...
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CONCEITOS UTILIZADOS EM MICROSCOPIA
Poder de AMPLIAÇÃO:
 Número de vezes (x) que as dimensões de um objeto são multiplicadas;
 Ex.: 10x, 40x, 100x, ...
 Em um microscópio, é a multiplicação dos poderes de ampliação de cada uma das lentes do 
conjunto (objetiva + ocular, p.e.);
 Ampliação e definição:
 Ampliação útil vs ampliação vazia  detalhamento;
 Depende da abertura numérica da lente;
Resolução
 Habilidade de revelar detalhes estruturais adjacentes como separados e distintos;
 Limite de resolução: menor distância entre dois pontos em que eles ainda possam ser 
distinguidos;
AMPLIAÇÃO
Quanto maior a ampliação:
 Maior o nível de detalhes;
 Menor o campo de visão;
 Menor a luminosidade;
AMPLIAÇÃO X DEFINIÇÃO PODER DE RESOLUÇÃO
Capacidade de diferenciar dois pontos 
separados a uma distância x, sem que 
haja sobreposição das imagens;
Limite  depende do comprimento de 
onda da luz visível!
	ܮܴ ൌ
଴,଺ଵ	ൈ	஛
ே஺
Onde,
λ = comprimento de onda;
NA = abertura numérica.
As seguintes medidas de 
comprimento são normalmente 
utilizadas na microscopia: 
•μm (micrômetro) = 10-6 m
•nm (nanômetro) = 10-9 m
•Å (Angström) = 10-10 m
Escala logarítimica
Olho humano: 0,2 mm;
Melhor microscópio óptico: 0,2 μm;
3 ordens de grandeza de diferença
Limite de 
resolução é 
inversamente 
proporcional ao 
poder de 
resolução!
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ABERTURA NUMÉRICA
É a razão entre o diâmetro da lente e sua distância focal;
Depende do índice de refração do meio pelo qual a luz passa;
	ܰܣ ൌ ݊ ൈ sin
ఏ
ଶ
Onde,
 n = índice de refração;
 θ = ângulo de abertura (CÂD);
n do ar = 1;
n do óleo = 1,5!
A
DC
DEFINIÇÃO E ABERRAÇÃO
Definição
Capacidade de uma objetiva em tornar 
o contorno de uma imagem de um 
objeto limpa e distinta;
Depende da eliminação de aberrações 
esféricas e cromáticas;
Aberração
Resultado da difração diferencial da luz 
em um sistema óptico;
 Esférica  presença de mais de um ponto 
focal devido à diferença entre raios axiais 
e marginais;
 Cromática  presença de mais de um 
ponto focal devido à diferença de 
difração de diferentes comprimentos de 
onda;
Podem ser corrigidas com o uso de 
objetivas especiais (acromáticas ou 
apocromáticas).
ABERRAÇÃO ESFÉRICA
Ponto focal 1
Ponto focal 2Plano do objeto
ABERRAÇÃO CROMÁTICA
Ponto focal 1
Ponto focal 2Plano do objeto
Ponto focal 3
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RELAÇÃO ENTRE AUMENTO, AN E DISTÂNCIA 
FOCAL
Aumento
Abertura numérica 
da lente objetiva
Distância da amostra 
para a lente (mm)
10x 0,25 5,5 
20x 0,54 1,4
40x 0,65 0,6
100x 1,32 0,1
UTILIZAÇÃO DO ÓLEO DE IMERSÃO
Objetivas de alto poder (100x);
Distâncias muito pequenas;
Impede que a luz se refrate para fora 
da lente;
Aumenta a abertura numérica e diminui 
o limite de resolução (lembrar da 
fórmula)  Maior poder de aumento.
PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Congelamento;
Fixação:
 Estabilização do material;
 Preservação da estrutura;
 Calor, solventes orgânicos, ácidos e aldeído;
Desidratação:
 Substituição da água por um composto miscível 
com o meio de inclusão;
Inclusão:
 Endurecimento do material biológico;
 Parafina, resinas plásticas;
PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLÓGICO
Microtomia:
 Seccionamento em aparelho denominado 
micrótomo: cortes de 1 a 10 μm;
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COLORAÇÃO
Ausência de contraste em amostras;
Diferentes componentes podem ser 
corados seletivamente:
Corantes básicos: Azul de toluidina, azul 
de metileno, hematoxilina = coloração 
de substâncias basófilas (DNA, RNA, 
glicoproteínas ácidas);
Corantes ácidos: Eosina, Orange G, 
Fucsina = coloração de substâncias 
acidófilas (proteínas básicas 
citoplasmáticas).
VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS VIVAS
Estado mais natural;
O contraste pode ser obtido por alguns 
corantes ou por técnicas óticas:
A) campo claro;
C) contraste de interferência;
B) contraste de fase;
D) campo escuro.
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
Diferença entre a luz que passa pela 
amostra ou não: difração;
Mudança da amplitude e do 
comprimento de onda da luz;
Filtrado por uma placa de fase 
ampliação do contraste (diferença entre 
fundo e amostra);
MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA
Visualização de células vivas ou mortas;
Baseia-se em fluoróforos;
Substâncias que são excitadas em um 
comprimento de onda e que emitem luz em 
um outro comprimento;
Necessária a utilização de filtros no 
microscópio ótico:
1 filtro  regula o comprimento de onda de 
excitação;
2º filtro  regula o comprimento de onda 
emitido (visualiza-se apenas a estrutura 
alvo)
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FLUORÓFOROS VISUALIZAÇÃO DE CÉLULAS
Marcação de células 
epiteliais em cultura:
Vermelho  junções de 
oclusão entre células;
Verde  proteínas 
porinas do núcleo.
Célula deve ser 
permeabilizada para a 
entrada de anticorpos: 
visualização de células 
mortas
COLOCALIZAÇÃO
Por meio de marcações específicas, é 
possível verificar se duas proteínas 
ocupam um mesmo compartimento 
celular (ex. localização de proteínas 
lisossomais);
Nesse caso, considera-se a colocalização
apenas nos pontos onde haja a soma 
das cores de ambas as sondas 
fluorescentes (ex. verde + vermelho = 
amarelo).
PROTEÍNAS FLUORESCENTES
Isoladas de organismos fluorescentes:
alta variedade de cores
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PROTEÍNAS QUIMÉRICAS (FUSIONADAS COM GFP)
Manipulação genética de organismos  fusão de 
proteínas próprias com a proteína repórter.
Mitocôndrias 
marcadas com GFP
(CÉLULA VIVA)
MICROSCÓPIO CONFOCAL
Abertura reduzida (pinhole): bloqueio de raios fora de foco! Necessária uma fonte de luz poderosa: LASER
Microscópio de 
epifluorescência
(fluorescência 
convencional)
Microscópio confocal
RECONSTITUIÇÃO DE PLANOS (Z-STACK)
Imagem pode ser reconstruída em cada 
um dos diferentes planos:
Criação de um modelo tridimensional!