6. ESPECTROSCOPIA E CROMATOGRAFIA

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6. PRÍNCIPIOS DE ESPECTROSCOPIA E CROMATOGRAFIA 
 
ESPECTROSCOPIA 
 
 O que é A espectroscopia é a designação para toda técnica de levantamento de dados 
físico-químicos através da transmissão, absorção ou reflexão de energia radiante incidente em 
uma amostra. Uso É utilizada para análise de elementos simples, da estrutura química de 
compostos inorgânicos ou grupos funcionais de uma substância orgânica utilizando radiação 
electromagnética. 
A radiação eletromagnética é o deslocamento de ondas que oscilam em fase dos campos 
elétricos e magnéticos. A luz visível é apenas uma pequena parte de todo o espectro da radiação 
eletromagnética possível, que vai desde as ondas de rádio aos raios gamas. As ondas 
eletromagnéticas foram previstas teoricamente e caracterizadas por Maxwell e confirmadas 
experimetalmente por Hertz. 
Características O comprimento de uma onda é designada pela letra λ (lambda) que é a 
distância entre dois pontos, altos e baixos, de mesmo valor. O valor máximo do módulo do 
campo é a sua amplitude (E). O tempo que uma onda demora pra percorrer um determinado 
comprimento de onda é determinado por t. O inverso do período determina a frequência (f = 
1/t), expressa em Hertz, que indica o número de comprimento de onda que passa por um ponto 
em determinado intervalo de tempo. 
 
 
Propriedades As ondas eletromagnéticas se propagam de maneira constante, porém 
dependerá do meio em que se encontra. Diferentes meios apresentam diferentes índices de 
refração. Em um meio não linear, como um cristal, interferências poder causar uma divisão da 
onda em duas partes com velocidades diferentes. Na passagem de um material para o outro, a 
frequência (f) mantem-se constante enquanto a velocidade muda (v). Ainda, a frequência é 
inversamente proporcional ao comprimento de onda (λ). 
v = λ x f ou λ = 
 
 
 
 Quanto maior o comprimento de onda, menor será a energia contida nesta. Quanto 
maior a energia, maior o poder de penetração na matéria. 
 
Espectro Eletromagnético É classificado pelo comprimentos das ondas e dividida em 
diferentes regiões, caracterizando o comportamento das diferentes ondas eletromagnéticas 
(figura 1). 
 Região Raio X (1 – 10 nm): eletrons das camadas mais internas K e L tem a capacidade 
de saltar entre as camadas liberando energia (compostos radioativos). 
 Região UV distante (10-200 nm): ionização de átomos através da vibração das 
moléculas. 
 Região UV próximo (200-400 nm) e visível (2-25 µm): transição de elétrons de 
valência dos eletrodos. 
 Infravermelho Próximo (700 nm a 2µm): interações moleculares 
 Infravermelho Distante (25-59µm): rotação moleculares 
 
Estado Energético Um feixe luminoso é composto por pacotes discretos de energia 
consistidos de fótons. A frequência da onda é proporcional à magnitude de energia da partícula. 
Os fótons são emitidos e absorvidos por partículas e funcionam como transportadores de 
energia. 
Se um fóton for absorvido por um átomo, ele excita um elétron. Este pula para uma 
camada superior (outro nível de energia). Se a energia for suficiente ele pode subir para outra 
camada ou escapar da atração do núcleo. Porém, a tendência é que o elétron retorne ao seu 
estado anterior. Quando ele retorna à sua camada, ele libera a mesma energia recebida em forma 
de ondas eletromagneéticas. 
Métodos de Espectroscopia Existem diversos métodos de análises espectroscópicas, 
tanto molecular quanto atômica. Para cada um deles os instrumentos de medidas sofrem 
variações. 
 
 
Espectroscopia Visível e Ultravioleta 
A espectrofotometria visível e ultravioleta é um dos métodos analíticos mais usados nas 
determinações analíticas em diversas áreas. A região ultravioleta do espectro é geralmente entre 
200 a 400 nm, e do visível entre 400 e 800 nm. 
É muito importante para a determinação quantitativa de compostos orgânicos e 
inorgânicos contendo grupos absorventes. Assim, o composto de interesse deve conter ou reagir 
om um composto cromóforo. Assim, por exemplo, se quero quantificar a quantidade de fósforo 
adicionarei um cromóforo que reaja co o P formando um complexo que emite luz. 
A absorção da região visível e ultravioleta depende, em primeiro lugar, do número e do 
arranjo dos elétrons nas moléculas e íons absorventes. Como consequência, a quantidade de 
energia absorvida pode ser relacionada com o tipo de ligação que existe entre as espécies 
estudadas. 
Do ponto de vista prático, o aspecto mais importante é a determinação de quanta luz é 
absorvida pela amostra. Isso é descrito pela lei de Beer-Lambert que dá a relação entre a 
intensidade de luz que entra e incide na solução (I0) e a que sai da solução (I): 
 
 
 
 
Onde a absorbância A medida, I0 é a intensidade de luz incidente a um dado 
comprimento de onda, I é a intensidade transmitida pela amostra, L é o caminho óptico pela 
amostra, E é a constante que absorbtividade e c é a concentração da substância (em mol/L) 
A absorbância (A) é o inverso da transmitância (T), portanto: T = 
 
 
. 
O instrumento usado na espectroscopia UV/VIS é chamado de espectrofotômetro. Para 
obter a informação sobre a absorção de uma amostra, ela é inserida no caminho óptico do 
aparelho. Então, uma luz de terminado comprimento de onda é passada pela amostra. O 
espectrofotometro mede o quanto de luz foi absorvida ou transmitida pela amostra (absorbância 
ou transmitância). 
Os espectrofotometros em geral consistem de 5 componentes principais: fontes de 
radiação, monocromador, compartimento com a amostra, sistema detector e dispositivo de 
processamento de dados. 
As fontes de radiação mais comuns baseiam-se na incandescência e devem gerar 
radiação continua e emitir todos os comprimentos de onda, dentro da região expectral utilizada. 
Como recipientes são utilizados cubetas de vidro ou quartzo. 
Já os monocromadores são essenciais e tem como função a seleção do comprimento de 
onda. São constituidos por uma fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação e 
deuma fenda de saída. O elemento de dispersão pode seer um prima ou uma rede de difração. 
 
Espectroscopia de Chama 
Baseia-se na análise de elementos de uma amostra líquida introduzida na análise de 
elementos. A leitura envolve os fenômenos físicos de evaporação, vaporização e atomização. 
Para esses processos ocorreram rapidamente, o líquido deve ser convertido para um aerosol. 
Os átomos no estado fundamental são capazes de absorver energia luminosa em um 
determinado comprimento de onda, alcançando um estado de excitação. Quando o elétron é 
excitado (recebe energia), ele muda de orbital (fenômeno de absorção). Quando retorna, ele 
libera energia (fenômeno de emissão). 
O espectro de absorção de um dado elemento é associado às transições entre o estado 
fundamental e os estados de energia mais avançados onde o átomo de cada elemento origina um 
espectro característico. Assim, a espectroscopia de chama lê a intensidade da radiação emitida 
pelos átomos excitados. 
Produção de átomos na fase gasosa: 
1) Nebulização da solução (produção de gotículas); 
2) Desolvatação (produção de partículas sólidas na chama); 
3) Atomização (produção de átomos livres na chama); 
4) Excitação (produção de átomos no estado excitado). 
 
Constituintes da fotometria de chama (figura 2): 
1) Sistemas de aspiração de amostra e entrada de gases (temperatura e pressão 
adequada); 
2) Chama (converte a amostra líquida e gasosa); 
3) Filtro óptico (permite que chegue ao detetor apenas a radiação correspondente ao 
elemento desejado) 
4) detetor, circuito amplificador e indicador (os detectores transformam a energia 
luminosa recebida em sinalelétrico; a seleção do comprimento de onda é feito por cromadores 
ou filtros de interferência). 
 
Espectrofotometria de Absorção Atômica 
Se baseia na absorção de energia luminosa por espécies atômicas neutras, não excitadas, 
e em forma gasosa. Cada espécie atômica possui um espectro de absorção devido à transição 
eletrônica. A espécie atômica em estado fundamental é capaz de absorver comprimentos de 
ondas iguais as que ela emite quando excitada. 
Na absorção, o elemento é levado à condição gasosa para sua dispersão atômica através 
da qual se passa o feixe de luz apropriado. A extensão da absorção é uma medida da população 
de átomos do elemento presente na chama e, portanto, da concentração do elemento na amtra. 
 
Absorção atômica Vs Chama 
Os dois métodos tem em comum o fatam de ambos introduzirem a amostra na chama 
em forma de aerosol. Porém, a espectroscopia consiste em medir a quantidade de radiação 
emitida pelos átomos durante sua passagem do estado excitado para o fundamental. Já a 
absorção atômica conssite em medir a radiação absorvida pelos átomos no estado fundamental. 
A absorção atômica é muito mais vantajosa, pois a quantidade de elétrons no estado 
excitado é menor do que os no estado fundamental. Ou seja, há uma sensibillidade muito maior 
para a técnica de absorção atômica. 
Na absorção atômica, fontes especiais de luz conjugadas com eficientes sistemas de 
seleção de comprimentos de ondas permitem a determinação específica de elementos. O 
resultado final é a diferença entre a quantidade de luz emitida e a quantidade de luz resultante 
depois da absorção pelos átomos no estado fundamental. 
 
Instrumentação 
1. fontes de luz emitem o espectro de interesse; 
2. céluala de absorção na qual os átomos da amostra são produzidos; 
3. monocromador para a dispersão da luz e seleção do comprimento de onda; 
4. detetor que mede a intensidade de luz, transformando o sinal luminoso emm 
elétrico 
5. display 
 
Existe espectrofotometro de feixe simples e duplo. No sistema duplo, um feixe passa 
pela amostra e o outro passa ao redor da células. O sinal analítico, nesse caso, é a razão entre as 
intensidades de luz dos dois feixes. 
 
CROMATOGRAFIA 
 
Cromatografia é um método físico-químico de separação por distribuir os componentes 
de uma mistura em duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel. A fase móvel é um gás 
ou líquido que leva a mistura a ser separada. A fase estacionária é aquela através da qual a 
mistura é carregada pela fase móvel. 
O método é baseado nos conceitos de solubilidade, tamanho e massa.. A interação dos 
componentes da mistura com as duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, 
incluindo iônica, bipolar, apolar e especificidades de afinidade e solubilidade. 
Os componentes segurados preferencialmente na fase estacionária são retidos por mais 
tempo no sistema do que aqueles que são distribuídos seletivamente na fase móvel. Como 
consequência, solutos são eluídos do sistema com concentrações locais na fase móvel na ordem 
de aumento dos seus coeficientes de distribuição. Consequentemente, uma separação é 
alcançada. 
 
Tipos de Cromatografia 
 
A grande variabilidade de combinações entre as fases móveis e estacionárias faz com 
que a cromatografia tenha uma série de técnicas diferenciadas. A cromatografia pode ser 
classificada de várias formas: 1) com base nas interações do soluto com a fase estacionária ou 2) 
com base na forma da fase de cromatografia e 3) pelo estado físico da fase móvel. 
 
 
Tipos de Cromatografia: Com base nas interações soluto x fase estacionária 
 
 Cromatografia de Adsorção – é um dos tipos mais antigos de cromatografia. Esta 
utiliza a fase móvel líquida ou gasosa que é adsorvida na superfície de uma fase estacionária. 
Cada solutos tem seu próprio equilibrio entre a adsorção na superfície sólida e a solubilidade do 
solvente (eluente). Os menos solúveis ou menos adsolvidos trafegam de forma mais lenta. O 
resultado é uma separação em bandas contendo diferentes solutos. A cromatografia líquida 
utilizando coluna de silica gel é um exempo de cromatografia de adsorção. 
 
 
 Cromatografia de Partição – nessa técnica a fase estacionária é um líquido não volátil 
que é retido como um fino filme na superfície de um sólido inerte. A mistura a ser separa é 
carregada por um gás ou um líquido através da fase móvel. Os solutos distribuiem-se entre as 
fases estacionária e móvel, com o componente mais solúvel na fase móvel atingindo o final da 
coluna de cromatografia primeiro. Cromatografia de papel é um exemplo. 
 
 
Cromatografia de Troca Iônica: Nesse tipo de cromatografia, usa-se uma resina (fase 
estacionária sólida) que possui íons ânios ou cátions ligados covalentemente a esta, que atraem 
os íons de carga oposta do soluto da fase móvel líquida, através de forças eletroestáticas. As 
moléculas mais carregadas iônicamente são ligadas fortemente na resina logo no início da 
coluna, trafegando lentamente e eluindo por último. 
 
 
 Cromatografia por Exclusão Molecular: Esta cromatografia difere das demais, pois 
nenhum estado de equilibrio é estabelecido entre o soluto e a fase estacionária. Ao invés, a 
mistura passa como gás ou líquido através de um gel poroso. O design do tamanho do poro é 
definido para permitir a passagem grandes partículas de soluto. As partículas menoras, no 
entanto, permeiam o gel e descem lentamente, então quanto menor a partícula, mais tempo 
levará para atravessar a coluna. Assim, a separação é de acordo com o tamanho da partícula. 
 
 
 
Tipos de Cromatografia: Com base na forma da “bed” de cromatografia 
 
 Cromatografia de Coluna: Na técnica de cromatografia em coluna, a fase estacionária 
ocorre dentro de um tubo de vidro aberto na parte superior de onde a amostra flui em direção à 
abertura funilada inferior. No interior desse tudo encontra-se um enchimento sólido no caso de 
cromatografia de coluna sólida ou um enchimento líquido no caso da cromatografia de coluna 
líquida. A fase móvel é líquida para ambas as técnicas. A ordem das substâncias dispostas na 
coluna estacionária dependerá da polaridade. 
 
 Cromatografia de Papel: É a técnica que envolve colocar um pequeno ponto ou linha 
da solução de amostra em um papel de cromatografia. O papel é posicionado em um jarro 
contendo o solvente no fundo e fechado. Ao subir pelo papel, o solvente encontra com a 
amostra da mistura que sobe junto com o solvente. Esse papel é feito de celulose, uma subtância 
polar, e os componentes da mistura trafegarão mais longe se eles foram apolares. Substâncias 
mais polares se ligam à celulose mais rapidamente e, assim, não trafegam muito longe. 
 Conforme cada soluto se distribui entre a fase estacionária e a móvel, a distância que um 
solvente se move é sempre a mesma fração de distância que o solvente se moveu. Essa fração é 
chamada de fração de retenção. 
 
 Cromatografia de Camada Fina (TLC): é uma técnica semelhante à cromatografia de 
papel. Entretanto, ao invés de utilizar uma fase estacionária de papel, envolve uma fase 
estacionária de camada fina de um adsorvente como silica gel, alumina ou celulose em um 
subtrato inerte. Comparada à de papel, tem a vantagem de corridas rápidas, melhor separação, e 
a opção entre diferentes adsorventes. Para uma melhor resolução e para permitir a quantificação, 
TLC de alta performance por ser utilizada. 
 
Tipos de Cromatografia: Estado físico da fase móvel 
 
 Cromatografia a Gás: é uma técnica de separação onde a fase móvel é um gás. Essa 
fase móvel sempre passa por uma coluna. É baseada no equilibrio de separação do analito entre 
a fase estacionária sólida(usualmente um líquido baseado em silicone) e um gás móvel 
(geralmente, Helio). 
 A fase estacionária é aderida no interior de uma tubo de vidro de pequeno diâmetro 
(uma coluna de capilar) ou a uma matriz sólida dentro de um grande tubo de metal (“packed” 
column). É amplamente utilizada na química analítica, porém as altas temperaturas utilizadas na 
técnica impossibilitam quantificar moléculas de grande peso molecular, biopolímeros ou 
proteínas (que desnaturam). 
 
 Cromatografia Líquida: é uma técnica de separação na qual a fase móvel é um líquido. 
Pode ser realizada em uma coluna ou em um plano. A cromatografia líquida de alto desempenho 
(HPLC) se distingue por usar a fase móvel à alta pressão. O uso de pressões elevadas permitem 
uma redução no diâmetro das partículas da fase estacionária, localizada no interior da coluna 
cromatográfica. As partículas de menor diâmetro apresentam maior sítio de adsorção, o que 
permite uma eficiente separação dos componentes da amostra. 
 A HPLC é, atualmente, uma das ferramentas mais poderosas na química analítica. 
Possui a habilidade de separar, identificar e quantificar os componentes presentes em qualquer 
amostra que possa ser dissolvida em um líquido. Além disso, permite identificar o componente 
de uma mistura mesmo se esse estiver em uma concentração baixíssima (partes por trilhão). 
 Os componentes básicos de uma HPLC são: 1) um reservatório contendo solvente – a 
fase móvel; 2) um controle de bombeamento solvente de alta pressão é utilizado para gerar e 
medir um fluxo específico da fase móvel, geralmente milimetros por minuto; 3) um injestor por 
onde a amostra é injetada no fluxo contínuo da fase móvel que carrega à amostra até a coluna; 
4) a coluna contém a fase estacionária necessária para a separação; 5) um detector que é 
necessário para detectar as bandas de componentes separados, conforme estes eluem pela coluna 
(a maioria não tem cor, então não podemos realmente vê-los); 6) o detector é ligado em um 
computador p/ coleta de dados que é o componente que grava os sinais elétricos necessários 
para gerar um cromatograma. 
 A fase móvel sai do detector e vai para descarte ou é coletada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Ondas eletromagnéticas 
 
Figura 2. Espectroscopia de chama