Aula-2 Cultura de Celulas 2010

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Microscópio comum
CULTURA DE CÉLULA
MUNDO DE CONFOCAL A LASER
� Células vivas podem ser isoladas de um tecido e 
separadas em diferentes tipos celulares
� Enzimas para dissociar células, Tripsina, 
collagenase
Isolamento de células
Por centrifugação 
Isolamento de células 
O isolamento de linfócitos humanos por centrifugação
Gradiente de Ficoll
Cultura de Célula primária 
vs
Linhagem de célula contínua
Cultura de Célula primária Linhagem de célula contínua
Vantagens:
- experimentos homogêneos
- repetibilidade
Vantagens:
- Uso imediato
- Não exige o esforço de
estabelecimento
Cultura de Célula primária Linhagem de célula contínua
Cultura de células 
� Estudo de 
� fatores de crescimento específicos
� condições da cultura
� Expressão gênica
� Câncer
� Manutenção de patógenos intracelulares ou � Manutenção de patógenos intracelulares ou 
dependente de células vivas de hospedeiro
� Diagnóstico de infecção viral, de rickettsia
etc
� Cultura de células tronco
As linhagens celulares
Células podem ser fundidas para formar células híbridas. 
Ex: Hibridomas ( Anticorpos Monoclonais)
Linhagem 
Celular
Origem
3T3 Fibroblasto (rato)
BHK21 Fibroblasto 
(Hamster)(Hamster)
MDCK célula epitelial 
(cachorro)
Hela Célula epitelial 
(humana)
PtK1 Célula epitelial 
(rato)
L6 Mioblasto (rato)
Linhagens celulares de inseto em cultura
UFL-AG-286 Tn-5B
Linhagem de 
Protoplasto
Plantas
transgênicas
Blastocisto�
cultura de células tronco embrionário
Blastocisto�
cultura de células tronco embrionário
Composição de um meio de cultura para 
células de mamíferos
Aminoácidos Vitaminas Sais vários proteínas 
Arginina
Fenilalanina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Biotina
Folato
Nicotinamina
Pantotenato
Piridoxal
NaCl
KCl
NaH2PO4
NaHCO3
CaCl2
Glicose
Penicilina
Estreptom
icina
Vermelho 
Insulina
Transferrina
(Fe)
Fatores de 
crescimento Lisina
Metionina
Serina
Treonina
Triptofano
valina
Cisteína
Glutamina
Histidina
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina
CaCl2
MgCl2
Vermelho 
fenol
Soro fetal
crescimento 
específicos
Funções dos elementos Químicos 
essenciais
Carbono
Heterotróficos:
usam compostos orgânicos como principal fonte de carbono (fontes de compostos 
orgânicos: absorvido do meio, ingerir outros organismos autotróficos, 
heterotróficos)heterotróficos)
Autotróficos:
usam CO2 como fonte de carbono (precisam somente moléculas inorgânicas 
simples e íons do meio)
Classificação Nutricional 
Fonte de energia
Quimiotroficos
•Organismos que utilizam compostos químicos para obter energia
Fototroficos
•Organismos que utilizam energia radiante (Luz) para obter energia•Organismos que utilizam energia radiante (Luz) para obter energia
Classificação 
Fonte de energia
Quimiotróficos
Fototróficos
Fonte de Carbono
Heterotróficos:
Autotróficos:
Fotoautotróficos
• Fonte de energia:
Luz
• Fonte de carbono: 
CO2
bactéria de enxofre verde e púrpura,
Planta, cianobacterias (Anabaena)Planta, cianobacterias (Anabaena)
Foto-heterotróficos
• Fonte de energia:
Luz
• Fonte de carbono: 
Compostos orgânicos
bactérias púrpuras e verdes não-enxofradas
Quimioautotróficos
• Fonte de energia:
inorgânicas
H2S - Beggiatoa,
S - Thiobacillus thiooxidans
NH3 - Nitrosomonas
• Fonte de carbono: 
COCO2
Quimio-heterotroficos
• Fonte de energia:
Orgânicas
• Fonte de carbono: 
Compostos orgânicos
maioria de bactéria, fungos, protozoários e animais
saprófitos (vivem em material orgânico morto) e parasitas 
(material orgânico vivo)
Fatores Físicas necessários 
para crescimento
•Temperatura
•PH
•Atmosfera gasosa•Atmosfera gasosa
•Pressão osmótica
Temperatura
• Maioria de células crescem nas temperaturas ideais para 
seres humanos
• Células crescem em uma faixa grande de temperaturas:
Exemplos: Bacillus subtilis 8 – 53 C, 
Neisseria gonorrhoeae 30 – 40 CNeisseria gonorrhoeae 30 – 40 C
Palavra Chave
as enzimas
pH 
• pH ótimo – media entre pH Maximo e mínimo 
• Bem definido para cada espécie 
• Células mantém pH neutro dentro da célula 
(mesmo bem acido ou básico o pH externo) 
 
pH
•pH ótimo – media entre pH Maximo e mínimo
Bem definido para cada espécie
•Células mantém pH neutro dentro da célula
(mesmo bem acido ou básico o pH externo)(mesmo bem acido ou básico o pH externo)
•pH muda decorrente de crescimento celular ou 
contaminação
Neutral / ácido
Atmosfera Gasosa
•No habitat natural – células necessitam concentrações diferentes de O2, 
CO2, N2, CH4
•No laboratório - tem que fornecer estes gases em concentrações 
apropriadas
•CO2 & O2: os dois gases principais que afetam o crescimento de células•CO2 & O2: os dois gases principais que afetam o crescimento de células
•4 grupos fisiológicos, em termos de resposta ao oxigênio:
aeróbios
facultativos
anaeróbios
microaerófilos
Pressão Osmótica
A água influencia a pressão osmótica do ambiente
Solução isotônica fora e dentro da célula: 
Solução hipertônico fora da célula: 
célula perde água, crescimento inibido 
(ex: alimentos salgados)
Solução hipotônico fora da célula: 
água flui para dentro da célula – e a rompe
Meios de cultura para crescimento
Agar:
•Agente solidificante
•Polissacarídeo complexo obtido a partir de algas
•Permanece solido (porque poucos mos podem degradar o agar)•Permanece solido (porque poucos mos podem degradar o agar)
•Solidifica em baixo de 40 C
Meios quimicamente definidos:
• Composição química e exata e conhecida
• Precisa fonte de energia, carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, e 
fatores orgânicos necessário que o mo não sintetiza
Meio complexo
• Para o cultivo de rotina no laboratório (quimicamente indefinidos)
• Produtos naturais adicionados como extrato de levedura, 
de carne, de planta
• Menos controle sobre os concentrações exatas de químicas
• Para mos heterotróficas 
• Componente protéica 
peptonas = pequenos cadeias de aminoácidos
energia, carbono, nitrogênio, enxofre
Meios para Anaeróbicos
•Oxigênio pode causar morte de célula
•Usa MEIOS com bicarbonato de sódio (na presença de 
água libera CO2)
•Usa tubos com tampas seladoras
•Usa jarras para placas: 
•Quando muitos organismos anaeróbicas – usa compartimento e 
incubadora de CO2
Preservação de Culturas puras
Métodos
Curto prazo:
•4 C na geladeira
•Transfere regular para novo meio de cultura
Longo Prazo 
•Nitrogênio liquido (–196 C)
Crescimento
Tempo de geração: 
•Tempo necessário para célula se dividir (=dobrar população)
Depende de:Depende de:
•Organismo
•Condições ambientais
•E. coli: 30 minutos
•Maioria das bactérias: 1- 3 horas
•Leveduras 4 horas
•Células de inseto e mamífero 24-48 horas
Curva de crescimento 
•4 fases:
•Lag
•Log
•Estacionaria
•Declineo ou morte celular
•Fase Lag / latente
•Células não se reproduzem imediatamente depois de inocular 
um novo meio
•O que esta acontecendo? : síntese de DNA, expressão gênica e 
produção de enzimas necessários
•Fase Log / crescimento exponencial•Fase Log / crescimento exponencial
•Divisão celular
•Aumento logarítmico
•Tempo de geração – atinge um valor constante
•Período de maior atividade metabólica da célula
•Fase estacionária
•Depois de crescimento exponencial – acumulação de células
•Velocidade de crescimento diminui
•Numero de morte celular = numero de células novas = população 
estável
•Atividade metabólica decresce
Causas:Causas:
•Termino de nutrientes
•Acumulo de produtos de degradação
•Mudanças no pH
•Fase de Declínio / morte celular
•Numero de células mortas excede o de células novas
•Continua ate o população desaparece totalmente
Cultivo de Vírus animais em 
laboratório:
•Em animais
•Em ovos embrionados
•Em cultivos celulares
Isolamento de vírus