Microscopia Ótica

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Microscopias 
Objetivos 
Conceituar microscópio óptico (MO) 
Citar os componentes da parte mecânica do MO e suas funções. 
Citar os componentes da parte óptica do MO e suas funções. 
Identificar e dizer o significado de cada inscrição do corpo metálico das objetivas e das oculares. 
Definir limite de resolução e poder de resolução do MO. 
Definir abertura numérica. 
Conceituar distância de trabalho (WD). 
Descrever o princípio básico da microscopia de Fluorescência. 
Descrever o princípio básico da microscopia Confocal a laser. 
Citar outros tipos de microscopia de luz. 
Descrever o princípio básico da microscopia eletrônica de transmissão e sua importância para o estudo 
ultraestrutural das organelas celulares. 
Descrever o princípio básico da microscopia eletrônica de varredura. 
Citar a importância da microscopia eletrônica (tomografia). 
Principais diferenças entre o MO e o MET - Sumário 
 
Parâmetros Microscópio Óptico Microscópio Eletrônico 
Iluminação Feixe de luz Feixe de elétrons 
Aumento objetivas Variáveis Fixas 
Formação de Imagens Absorção de luz Dispersão de elétrons 
Comprimento de onda Luz visível = 550 nm Ultravioleta = 200 nm 
Aceleração 20Kv=0,08 
 100Kv=0,04 
Resolução Luz visível = 200 nm Ultravioleta = 100 nm 
Ponto-a-ponto = 0,3 nm 
 Latice = 0,14 nm 
Poder de Aumento 1000 a 1500 X 
MET = 800.000 X 
MEV = 100.000 X 
MEAV = 1.000.000 X 
Meio de Trabalho Água, óleo, etc. Vacuo 
Tipos de Lentes Vidro, Quartzo Eletromagnéticas 
Microscópio Óptico 
A invenção do microscópio óptico (MO) causou uma verdadeira revolução no pensamento humano, colo-
cando ao alcance do homem um universo até então desconhecido e inacessível. Hoje em dia, o MO tornou-
se indispensável em praticamente todas as atividades científicas e industriais; nos laboratórios em geral, na 
medicina, na pesquisa, nos setores de controle de qualidade de produção e nas empresas. 
 
Definição 
O MO trata-se de um instrumento de óptica com capacidade de mostrar bastante ampliada (aumento) e 
com determinados detalhes (resolução), a imagem de pequenas estruturas não visíveis ao olho desarma-
do. 
De acordo com as referências bibliográficas consultadas, verificamos que, para fins didáticos, o microscó-
pio óptico pode ser dividido em várias partes; adaptamos àquela proposta por José Hibb (2003). Assim, 
podemos distinguir duas partes: 
Mecânica ou Estativa - serve de suporte para a parte óptica e para o manuseio da preparação histológica 
em estudo; 
Óptica - destinada a obtenção e ampliação da imagem do corte, bem como, fornecer iluminação adequada 
ao mesmo. 
Mecânica ou Estativa – consta dos seguintes componentes: 
Base 
Normalmente trata-se de uma peça quadrada ou ligeiramente retangular, com 5cm de altura, que tem por 
funções: sustentar os demais componentes da parte mecânica do Microscópio e; abrigar, internamente, 
alguns componentes do sistema óptico de iluminação (lâmpada, lentes convergentes e espelho). Na sua 
parte antero-superior, possui um diafragma de campo e uma lente convergente. 
Coluna 
Encontra-se presa na extremidade posterior da Base, com formato de um "L" invertido, sendo a parte me-
nor, responsável pela sustentação do Corpo binocular (antigo Tubo) e do Revolver e, na parte maior, a Pla-
tina, a Subplatina e os Mecanismos de Movimentos. 
Corpo Binocular 
É uma peça metálica, com formato de trapézio, que tem como funções principais: 
1. Proteger internamente, um sistema de prismas que desvia os raios luminosos provenientes do sistema 
de iluminação Þ corte Þ lentes da objetiva Þ lentes oculares e daí à retina de nossos olhos; 
2. Sustentar em sua parte superior externa, as oculares. 
Revolver 
É uma peça metálica, cromada, de forma circular-achatada, presa centralmente à parte inferior da Coluna 
(braço menor), por meio de um parafuso. Possui 4 ou 5 orifícios que servem para sustentar as Objetivas e 
apresenta um movimento giratório, através do qual permite a inserção de cada uma delas no eixo óptico 
(linha vermelha) 
Platina 
É uma peça plana, geralmente quadrada e fixa (não giratória), que serve para suporte da preparação histo-
lógica em estudo. Fica presa à Coluna e disposta perpendicularmente ao eixo óptico da Objetiva. No cen-
tro, apresenta um orifício que permite a passagem dos raios luminosos provenientes do sistema de Ilumi-
nação, localizado abaixo da Subplatina. Na parte superior da Platina, encontramos o Charriot, sistema de 
presilhas (uma fixa e a outra móvel) apropriado para prender e movimentar a preparação histológica, no 
sentido norte-sul e leste-oeste, através de seus parafusos (parafusos do Charriot). 
Mecanismos de Movimentos 
Consiste de um sistema formado por dois parafusos grandes e coaxiais, de avanço amplo e rápido, o Ma-
crométrico, e de outro sistema também composto por dois parafusos pequenos e coaxiais, de avanço lento 
e diminuto, o Micrométrico. O primeiro movimenta a platina proporcionando a aproximação entre a Obje-
tiva e a preparação histológica (foco do corte), ao passo que, o segundo, também movimenta impercepti-
velmente aos olhos desarmados, a altura da Platina e assim possibilita à obtenção do foco fino da prepara-
ção. 
Subplatina 
Consta de um aro metálico, localizado abaixo da Platina, cuja função é a de sustentar ou prender, por meio 
de parafusos fixadores, parte dos componentes do Sistema de Iluminação (Filtro, Diafragma Íris e lentes do 
Condensador), podendo movê-la, no sentido norte-sul, através do parafuso do Condensador. 
Óptica 
Podemos subdividir a Parte Óptica em dois sistemas: 
1. Formação e Ampliação da Imagem - compreende as objetivas e as oculares; 
2. Iluminação - constituído pelo condensador (sistema de lentes, diafragma iris e filtro) e a fonte de luz 
incidente (lâmpada, sistema de lentes, espelho e diafragma de campo). 
Sistema de Formação e Ampliação de Imagem 
Objetivas 
São formadas por um sistema de lentes convergentes, montadas em um tubo metálico. Formam uma ima-
gem Aumentada, Real e Invertida, do objeto em estudo. A objetiva tem Poder de Resolução, ou seja, a ca-
pacidade de produzir imagens nítidas ou distintas de pontos situados muito próximos entre sí. 
Geralmente, as objetivas são classificadas de acordo com o grau de correção das aberrações. A objetiva de 
uso geral para trabalhos de rotina é a acromática, enquanto que, para fotomicrografias, a mais aperfeiçoa-
da é a plan-apocromática. 
Aberrações 
Denominam-se aberrações, aqueles defeitos de imagens produzidos normalmente nas lentes, devido a 
fenômenos de dispersão à deflexão da luz que passa pelas mesmas. Se as aberrações não forem corrigidas, 
as lentes tendem a produzir imagens distorcidas, pouco nítidas e em cores alteradas. 
As principais aberrações produzidas pelas lentes são: 
Cromática 
É devido ao fato das lentes simples não poderem concentrar em um só ponto os raios de diferentes com-
primentos de onda (de diferentes cores), de modo que formam imagens borradas, com anéis coloridos. 
Esta aberração é corrigida através do uso de objetivas acromáticas, apocromáticas que oferecem imagens 
claras, desprovidas destes halos (anéis). 
Esférica 
Uma lente simples tende a focalizar raios que passam na sua periferia, em local mais próximo (a) do que os 
raios que passam no seu centro (b). Em decorrência, produzirá uma imagem pouco nítida. 
Curvatura de campo 
A imagem ampliada, produzida por uma lente, tende a ser curva. Evidentemente, esta distorção da ima-
gem prejudica a sua qualidade e impede que todo o campo seja visto em foco ao mesmo tempo. Nestas 
condições, o centro do campo aparece em foco e a periferia desfocada, ou vice-versa: 
Todas estas aberrações são corrigidas nas lentes do microscópio, por diversas técnicas. A mais importante 
consiste em associar várias lentes de características diferentes que neutralizem as aberrações. Assim, as 
melhoresobjetivas são constituídas por um número maior de lentes e, consequentemente, têm seus pre-
ços mais elevados. 
 
Significado das Inscrições no Corpo Metálico das Objetivas 
Várias inscrições podem ser vistas no corpo metálico das objetivas. De acordo com o que será apresentado 
em sala de aula, observamos, em um lado, a marca da firma (Carl Zeiss - Germany), e do outro: na parte 
superior esquerda, o Tipo e o Poder de Aumento da Objetiva (Plan 25); na inferior esquerda, o comprimen-
to do Tubo (ou corpo binocular) em mm (170); na parte superior direita, a Abertura Numérica (A 0,45) e na 
inferior direita, espessura máxima da lamínula em mm (0,17). Além destas, podemos encontrar ainda, os 
tipos: ( - ) - objetiva que pode ser usada com ou sem lamínula, e: (0) - objetiva que deve ser usada somente 
sem lamínula. 
Poder de Resolução 
Denomina-se Poder de Resolução a capacidade que tem os instrumentos ópticos de formarem imagens 
distintas de pontos situados próximos uns dos outros. No microscópio óptico, esta característica básica é 
inerente da Objetiva. O Poder de Resolução depende do comprimento de onda (λ) e da Abertura Numé-
rica ( AN ). 
Limite de Resolução 
Denomina-se Limite de Resolução a menor distância que deve haver entre dois pontos para que eles pos-
sam ser definidos ou para que apareçam individualizados. O Limite de Resolução é inversamente propor-
cional ao Poder de Resolução. Limite de Resolução de uma Objetiva ou Microscópio Óptico pode ser ex-
presso pela fórmula : 
LR = (K x λ) / AN 
 
Abertura Numérica (AN) 
A Abertura Numérica expressa uma relação matemática entre o Poder de Resolução de uma Objetiva e sua 
capacidade de captar luz. Abertura Numérica é definida matematicamente, como o produto do menor ín-
dice de refração ( n ) interposto entre a preparação histológica e a objetiva pelo seno do semiângulo de 
abertura ( sen µ), sendo este, o ângulo formado pelos raios mais externos que penetram na Objetiva. As-
sim, podemos dizer que: 
 
AN = n x sen µ 
 
Nas Objetivas a seco ( 4X, 10X e 40X ), existe AR entre a lente frontal da Objetiva e a preparação histológica 
; o índice de refração ( n ) dado é de valor 1,00. Na Objetiva de imersão em óleo ( 100X ), utilizamos uma 
gota de óleo entre a preparação histológica e a lente frontal da mesma e o índice de refração passa a ter 
um valor maior do que aquele estipulado para o AR : 1,51 . 
Comprimento de Onda (λ) 
Com relação ao comprimento de onda, os melhores e mais altos valores de resolução foram obtidos com 
o uso do ultravioleta, que possui o menor λ. Na região visível do espectro, a luz Azul tem o mais curto, 
seguido pelo verde e vermelho. Na prática, a preparação histológica é iluminada por luz branca, constituí-
da por diversos comprimentos de onda. Geralmente, toma-se o λ da faixa do verde-amarelo (0,55mm) 
para o cálculo do Limite de Resolução, fixando-se o valor da constante ( K ) em 0,61. Para a sala de aula, 
não podemos alterar o λ e, assim, a Resolução fica restrita à AN das Objetivas; quanto mais complexas e 
corrigidas opticamente forem as Objetivas, maiores serão os valores de AN Com dois exemplos, mostrare-
mos que o Limite de Resolução é estritamente dependente da AN da Objetiva e que não existe relação com 
o Aumento final dado pelo microscópio óptico (Poder de Aumento da Objetiva versus Poder de Aumento 
da Ocular) e nem com o Poder de Aumento da Ocular utilizada (levando em consideração as nossas con-
dições de sala de aula prática ) : 
 
Exemplo 1 A: (Obj. 10X) - (Oc. 20X) - (AN = 0,15) - (AF = 200X) 
B: (Obj. 40X) - (Oc. 05X) - (AN = 0,65) - (AF = 200X) 
 
Aplicando-se a fórmula, verifica-se que no caso A, o Limite de Resolução será de 2,2 mm e, no caso B, 0,5 
mm. Portanto, mesmo sendo o Aumento Final (AF) de ambos os microscópios iguais ( 200X ), a imagem 
fornecida pelo caso B será muito mais rica em detalhes. 
 
Exemplo 2 A: (Obj. 40X) - (Oc. 10X) - (AN = 0,65) - (AF = 400X) 
B: (Obj. 40Xi) - (Oc. 10X) - (AN = 1,00) - (AF = 400X) 
 
Ao compararmos as duas situações, onde usamos a mesma Ocular, com Objetivas de 40X normal e 40Xi de 
imersão, o que variamos foi simplesmente a AN da segunda (1,00 ao invés de 0,65), sendo o Aumento Final 
o mesmo. Neste exemplo, a situação B, fornecerá uma imagem muito rica em detalhes, e fica patente que 
esta riqueza é fornecida pela AN da Objetiva e não pelo Poder de Aumento da Ocular utilizada. 
Distância de Trabalho (WD) 
Outra característica importante das Objetivas é sua Distância de Trabalho (WD). A WD é a distância entre a 
lente frontal de uma Objetiva e o topo da Lamínula ou da preparação histológica. Normalmente, quanto 
maior o Poder de Aumento de uma Objetiva, menor será a WD. 
Oculares 
Cada Ocular é composta por duas lentes convergentes, simples ou composta, uma superior, denominada 
lente ocular propriamente dita, e uma inferior, chamada lente de campo, ambas, montadas em um cilin-
dro metálico. A Ocular mais comumente usada é a do tipo Huygen, onde as lentes são plano-convexas 
tendo, a convexidade de ambas, voltada para a preparação histológica. Existem as Oculares de Ramsden, 
também formadas por lentes tipo plano-convexas, porém, com a convexidade para seu interior. As Ocula-
res têm como função principal formar uma imagem Virtual, Aumentada e Direta, da imagem real dada 
pela Objetiva. Além desta, corrigem pequenos defeitos da imagem que ainda persistem após passarem 
pelas Objetivas. No Corpo metálico (rosca superior), normalmente, podemos visualizar duas inscrições: 
H10X ou R10X ( a letra expressa o tipo de Ocular e o número, o Poder de Aumento da mesma ). As Ocula-
res de 10X, em geral, apresentam Número de Campo igual a 18 mm. O quociente: Número de Campo / 
Poder de Aumento da Objetiva, nos fornecerá o Diâmetro do Campo de Visão. A Ocular apresenta em 
seu interior, uma seta que permite apontar qualquer estrutura no Campo de Visão. 
Sistema de Iluminação 
Este sistema compreende o Condensador (sistema de lentes, diafragma íris e filtro) e Sistema de Ilumina-
ção. 
Condensador 
Conjunto de lentes montado num corpo metálico, situado abaixo da Platina do microscópio Óptico (preso a 
subplatina, por um parafuso de fixação), que concentra e fornece a luz necessária à iluminação do material 
em estudo. Os Condensadores mais usados são formados geralmente, por duas lentes: uma biconvexa (in-
terna) e outra plano-convexa (superior), com face plana voltada para o orifício da platina. 
De acordo com o tipo de luz transmitida, temos Condensadores específicos: Campo-claro, Campo-escuro, 
Contraste de Fase e de Fluorescência. Quanto a correção óptica, os Condensadores assemelham-se às Ob-
jetivas, havendo também, aqueles utilizados com Objetivas a seco, bem como, outros, usados com Objeti-
vas de Imersão. 
Embora negligenciado no cálculo do Limite de Resolução, o Condensador apresenta em seu Corpo Metáli-
co, inscrições especificando o Tipo e a NA do mesmo. Na escolha de um Condensador é importante consi-
derar sua NA, que deve ser equivalente ou superior à NA da Objetiva de maior aumento a ser utilizada 
(normalmente, NA do Condensador =1,32 para a objetiva de imersão em óleo). 
Os Condensadores apresentam também, um sistema de palhetas plásticas - o Diafragma Iris, situado logo 
abaixo de seu sistema de lentes. É importante salientar que a abertura do Diafragma Iris é crítica para a 
formação da imagem; quando totalmente aberto, a qualidade da imagem perece, devido à reflexão da luz 
ao longo do trajeto óptico do microscópio. Se estiver muito fechado, obtém-se uma menor resolução e 
diminuição da nitidez. 
Dessa forma, para cada Objetiva existe uma abertura ideal do Diafragma Iris e recomendamos regulá-la, 
sempre. 
Filtros 
Os filtros são utilizados para modificar a cor (cromáticos), a intensidade (cinza-neutros) ou capacidade 
térmica(catatérmicos), da luz que chega ao sistema óptico do microscópio. Os Filtros que mudam a cor 
(cromáticos) são mais frequentemente usados para acentuar o contraste da imagem; por exemplo, é co-
mum utilizar-se Filtro Azul para fotografar material corado por Hematoxilina - Eosina. 
O filtro azul converte a temperatura de cor da iluminação de halogênio na temperatura de cor da luz natu-
ral, exibindo a amostra em suas cores naturais (diâmetro = 32,5 mm). 
Fonte de Luz 
Geralmente, os Iluminadores consistem de uma lâmpada de 6 a 12 volts e dois sistemas de lentes: um 
situado internamente na Base (formado por 3 a 4 lentes) e, outro (geralmente uma lente), montado em 
um corpo metálico, localizado na parte anterior e externa, na Base, corretamente posicionados e definindo 
a trajetória óptica, no microscópio. Alguns equipamentos possuem o Iluminador situado na Base, próximo 
da inserção com a Coluna; quando emitem raios luminosos, eles são concentrados por um conjunto de 
lentes e desviados em sua trajetória horizontal, para outra, vertical, por um espelho, posicionado a 45°, em 
direção ao Condensador, espécime em estudo, objetivas, oculares (eixo óptico) e finalmente a retina de 
nossos olhos. Nos microscópios modernos, encontramos ainda, o Diafragma de Campo, semelhante em 
constituição ao Diafragma Iris, fica situado abaixo do sistema de lentes convergentes externo, porém, in-
ternamente na Base. A principal função dos Iluminadores é fornecer luz de qualidade e intensidade ade-
quada para uma iluminação uniforme e eficiente do campo. 
Ampliação do Microscópio Óptico 
A Ampliação final de um determinado espécime em observação, ao microscópio óptico pode ser expressa: 
 
AUMENTO FINAL = Poder Aumento da OBJETIVA x Poder Aumento OCULAR 
 
Deve ficar claro para o estudante que o AUMENTO de uma estrutura somente terá valor se houver conco-
mitantemente, AUMENTO DE RESOLUÇÃO. Caso contrário, o Aumento será dito VAZIO, sem significado 
para as nossas proposições.