Técnicas Bio Mol

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22/06/2012
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Técnicas de Técnicas de Técnicas de Técnicas de 
Biologia Biologia Biologia Biologia 
MolecularMolecularMolecularMolecular
A insulina humana utilizada no tratamento A insulina humana utilizada no tratamento A insulina humana utilizada no tratamento A insulina humana utilizada no tratamento 
de diabetes...de diabetes...de diabetes...de diabetes...
• Insulina humana difere da suína em 1 aa e da 
bovina em 3
• Alguns pacientes não se adaptam a insulinas animais
Como obter insulina humana para Como obter insulina humana para Como obter insulina humana para Como obter insulina humana para 
tratamento dessas pessoas?tratamento dessas pessoas?tratamento dessas pessoas?tratamento dessas pessoas?
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Desenvolvimento de Desenvolvimento de Desenvolvimento de Desenvolvimento de 
Tecnologias de DNA Tecnologias de DNA Tecnologias de DNA Tecnologias de DNA 
recombinanterecombinanterecombinanterecombinante
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• A produção de insulina humana recombinante 
para tratamento de diabéticos foi aprovada em 
1982 pela FDA
• O segundo produto de engenharia genética que 
veio a ser aprovado foi o hCG, hormônio de 
crescimento humano, em 1985.
• Clonagem de genes específicos em 
pequenos elementos genéticos auto-
replicantes (Vetores de Clonagem)
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• Como encontrar um 
gene específico em 
um genoma de 
mamífero, que tem 
~3 bilhões pb 
(haplóide)?
• Como isolar 
quantidades 
suficientes desse 
gene para permitir o 
estudo de sua 
estrutura e função?
Técnicas básicas utilizadas Técnicas básicas utilizadas Técnicas básicas utilizadas Técnicas básicas utilizadas 
para identificar, amplificar e para identificar, amplificar e para identificar, amplificar e para identificar, amplificar e 
clonar genesclonar genesclonar genesclonar genes
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Dois modos de amplificar genes e outras 
sequências de DNA:
• in vivo – clonagem molecular
• in vitro – Reação em Cadeia da 
Polimerase PCR
Tudo começa com a Tudo começa com a Tudo começa com a Tudo começa com a 
descoberta das descoberta das descoberta das descoberta das 
enzimas de enzimas de enzimas de enzimas de 
restrição...restrição...restrição...restrição...
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO (tipo II)
� Reconhecem uma sequência de bases 
específica na dupla-hélice de DNA 
� Cortam ambas as fitas da hélice em lugares 
determinados
� Encontradas em ampla variedade de 
organismos procarióticos
� Função biológica: clivar moléculas de DNA 
exógeno
� DNA da própria célula (endógeno) não é 
clivado porque apresenta os sítios de 
reconhecimento de sua enzima metilados
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
� Reconhecem 
sequências de 4 a 8 
pb e hidrolisam uma 
ligação fosfodiéster 
em cada fita
� Os sítios de 
restrição ou de 
clivagem possuem 
dupla simetria 
rotacional (sequências 
palindrômicas)
� Os sítios de 
clivagem são 
simetricamente 
posicionados
� São conhecidas + 
de 200 enzimas
ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
Seqüência 
reconhecida
Nome Origem
5’GGATCC 3’
3’CCTAGG 5’
BamHI Bacillus 
amyloliquefaciens
5’GGCC 3’
3’CCGG 5’
HaeIII Haemophilus 
aegyptius
5’CTGCAG 3’
3’GACGTC 5’
PstI Providencia 
stuartii
5’GAATTC 3’
3’CTTAAG 5’
EcoRI E. coli RY13
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
5’ G-G-A-T-C-C 3’
3’ C-C-T-A-G-G 5’
: : : : : : 
5’ G G-A-T-C-C 3’
3’ C-C-T-A-G G 5’
: :
Extremidades coesivas
BamHI
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
5’ G-A-T-A-T-C 3’
3’ C-T-A-T-A-G 5’
: : : : : :
5’ G-A-T A-T-C 3’
3’ C-T-A T-A-G 5’
: : : : : :
EcoRV
Extremidades cegas
Construção de moléculas de DNA recombinante
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Construção de moléculas de DNA recombinante
Construção de moléculas de DNA recombinante
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OBTENÇÃO DE MOLÉCULA DE DNA RECOMBINANTE
Clonagem molecular
Atenção! Não 
confundir com 
clonagem de 
organismos!!
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Clonagem molecularClonagem molecularClonagem molecularClonagem molecular
���� Reprodução de várias cópias de uma 
sequência de DNA
� Um fragmento de DNA 
de interesse é inserido 
em uma molécula de DNA 
circular, chamada vetor, 
para produzir uma 
quimera ou molécula de 
DNA recombinante.
� O vetor age como um 
veículo que transporta o 
gene para dentro de uma 
célula hospedeira, que 
geralmente é uma 
bactéria, embora outros 
tipos de células também 
possam ser utilizados.
Clonagem molecular
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�Dentro da célula 
hospedeira o vetor se 
multiplica, produzindo 
várias cópias idênticas de 
si mesmo, mas também da 
sequência exógena que ele 
carrega.
� Quando a célula 
hospedeira se divide, 
cópias da molécula de 
DNA recombinante são 
passadas para a progênie 
e replicações adicionais do 
vetor ocorrem.
Clonagem molecular
� Depois de um grande 
número de divisões 
celulares, uma colônia, ou 
clone, de células 
hospedeiras idênticas é 
produzido. Cada célula no 
clone contém uma ou mais 
cópias da molécula de DNA 
recombinante; dizemos 
então que a sequência de 
interesse carregada pela 
molécula recombinante agora 
está CLONADA!
Clonagem molecular
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VETORES DE CLONAGEMVETORES DE CLONAGEMVETORES DE CLONAGEMVETORES DE CLONAGEM
• Vetores Plasmidiais
• Vetores de Bacteriófagos
• Vetores Cosmidiais
• Vetores Eucarióticos e de Transporte
• Cromossomos Artificiais
Vetores Plasmidiais
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Características essenciais 
de um vetor de clonagem
Estrutura do sítio 
de policlonagem
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Vetores de bacteriófagos
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Vetores Cosmidiais
Híbrido de plasmídeo e bacteriófago
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Cosmídeo
Estrutura básica e utilidade de um vetor de transporte de 
E. coli-levedura
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Cromossomos artificiais
YAC – levedura
BAC – bacteriano
PAC – (P1) bacteriófago
TEL = telômeros de levedura
ARS = sequência de replicação autônoma (Origem de 
replicação) de levedura
CEN = centrômero de levedura
URA3+ = gene necessário para a biossíntese de 
uracila (marcador selecionável)
Site = sítio de policlonagem
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Amplificação de Sequências de DNA por Amplificação de Sequências de DNA por Amplificação de Sequências de DNA por Amplificação de Sequências de DNA por 
PCRPCRPCRPCR
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• Kary Mullis e cols. (1985)
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Eureca!
PCR!
°C
95
75
55
35
Quando a temperatura 
aumenta o DNA 
desnatura!Se a temperatura diminuir 
um pouco, usando dois 
primers que anelam em 
fitas opostas, eles vão 
hibridizar com as 
seqüências complementares 
no DNA!
Se a temperatura for 
ideal para a DNA-
polimerase, então 
nucleotídeos serão 
acrescentados à 
extremidade 3’ de cada 
primer, seguindo o molde!
Se repetirmos este ciclo, 
teremos um fragmento 
amplificado!!
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5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTAGTCGCTAAAT.......GGCAGGTCAGTCGATCGATTCGCTA 3’
3´CTAAGCATGAGACGACTGACGATCAGCGATTTA.......CCGTCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTAGTCGCTAAAT.......GGCAGGTCAGTCGATCGATTCGCTA 3’
3´CTAAGCATGAGACGACTGACGATCAGCGATTTA.......CCGTCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTAGTCGCTAAAT.......GGCAGGTCAGTCGATCGATTCGCTA 3’
AGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCT
3´CTAAGCATGAGACGACTGACGATCAGCGATTTA.......CCGTCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTAGTCGCTAAAT.......GGCAGGTCAGTCGATCGATTCGCTA 3’
TCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTA
3´CTAAGCATGAGACGACTGACGATCAGCGATTTA.......CCGTCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTAGTCGCTAAAT.......GGCAGGTCAGTCGATCGATTCGCTA 3’
3´CTAAGCATGAGACGACTGACGATCAGCGATTTA.......CCGTCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
5´GATTCGTACTCTGCTGACTGCTAGTCGCTAAAT.......GGCAGGTCAGTCGATCGATTCGCTA 3’
3´CTAAGCATGAGACGACTGACGATCAGCGATTTA.......CCGTCCAGTCAGCTAGCTAAGCGAT 5’
Aquecimento/Desnaturação
Resfriamento/Anelamento primers
Extensão pela DNA polimerase
Duas moléculas idênticas
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Desnaturação
Anelamento dos 
primers
Extensão pela DNA-
polimerase
Adição de 
Enzima
Ciclo da PCR
Thermus aquaticusVive em águas a 75°C
DNA-polimerase 
termo-estável!!
Automação do 
processo!!
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Desnaturação da amostra de DNA para 
separação das fitas (94°C, 5 min)
Primers ligam-se às 
fitas do DNA
(30-65°, 30 seg)
Polimerase sintetiza 
novas fitas de DNA 
(65-75°C, 1-2 min)
Desnaturação para 
separação das fitas de 
DNA (94°C, 30 seg)
Ciclo da PCR
N° de 
ciclos
N° de moléculas-
alvo dupla-fita
N° de 
ciclos
N° de moléculas-
alvo dupla-fita
1 0 15 8.192
2 0 16 16.384
3 2 17 32.768
4 4 18 65.536
5 8 19 131.072
6 16 20 262.144
7 32 21 524.288
8 64 22 1.048.576
9 128 23 2.097.152
10 256 24 4.194.304
11 512 25 8.388.608
12 1.024 30 268.435.456
13 2.048 31 536.870.912
14 4.096 32 1.073.741.824
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Componentes essenciais da PCR
� DNA molde
� dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
� Oligonucleotídeos sintéticos 
(primers)
� DNA-polimerase termoestável
� Cátions divalentes
� Cátions monovalentes
� Tampão para manter o pH
Fontes de DNA molde para PCR
☺ DNA total extraído de células
☺ cDNA 
☺ Material de museu
☺ Saliva, sangue, cabelo, pêlo (com 
bulbo)
☺ Fezes, urina
☺ Biópsias
☺ Fósseis
☺ Múmias
☺ ...
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Aplicações da PCR
� Amplificação de sequências específicas de DNA
� Sequenciamento direto dos produtos de PCR
� Detecção de mutações
� Acompanhamento de tratamento do câncer
� Detecção de infecções bacterianas e virais
� Determinação do sexo em células pré-natais
� Estudos de evolução molecular
� Genética Forense
� Genética da Conservação
�...
Teria sido Mullis o 
primeiro a pensar 
nessa amplificação in 
vitro?
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Não!!!!!
1971 – trabalho de Ghobind Khorana e cols 
propunha a técnica
Entretanto, em 1971:
• genes não haviam sido sequenciados
• DNA polimerase termoestável não tinha sido 
descrita
• síntese de oligonucleotídeos era + uma arte do 
que uma ciência
Caiu no esquecimento!!!
Separação de moléculas de Separação de moléculas de Separação de moléculas de Separação de moléculas de 
ácidos nucleicos através de ácidos nucleicos através de ácidos nucleicos através de ácidos nucleicos através de 
eletroforese em geleletroforese em geleletroforese em geleletroforese em gel
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MICHAELIS (1909):
Eletro – eletricidade
Phoros – levar através de
Separação de macromoléculas em uma matriz colóide 
submetida a um campo elétrico
ELETROFORESE DE ÁCIDOS NUCLÉICOS
Em gel:
� De agarose (horizontal)
� De poliacrilamida (vertical)
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Separação de moléculas de DNA por eletroforese em 
gel de agarose
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MIGRAÇÃO DE FRAGMENTOS DE DNA EM GEL DE 
ELETROFORESE
VISUALIZAÇÃO DO DNA EM GEL DE AGAROSE
Procedimento mais comum:
���� Coloração com brometo de etídeo e visualização sob 
luz UV
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ELETROFORESE VERTICAL
Construção de bancos ou Construção de bancos ou Construção de bancos ou Construção de bancos ou 
bibliotecas genômicas bibliotecas genômicas bibliotecas genômicas bibliotecas genômicas 
e de cDNAe de cDNAe de cDNAe de cDNA
cDNA? Isso é de comer? 
Comestível DNA?
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http://www.epibio.com/guide_to_genomic_library_production.asp
Biblioteca genômica
Biblioteca genômica
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Síntese de 
cDNA
Biblioteca de 
cDNA
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Triagem de bibliotecas de DNA para Triagem de bibliotecas de DNA para Triagem de bibliotecas de DNA para Triagem de bibliotecas de DNA para 
sequências de interessesequências de interessesequências de interessesequências de interesse
Hibridização de ácidos nucleicos!
Dependendo da 
condição de 
hibridização, 
pareamentos mais ou 
menos perfeitos 
serão formados entre 
fitas simples de DNA
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Como se faz a hibridização?Como se faz a hibridização?Como se faz a hibridização?Como se faz a hibridização?
1)Separação de moléculas de DNA ou RNA por 
eletroforese em gel de agarose
2)Desnaturação das moléculas no gel
3) Transferência do ácido nucleico para uma 
membrana
4) Hibridização com uma sonda de DNA previamente 
marcada com radioatividade ou com fluorescência
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Forno de hibridização rotatório
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Southern blotting – transferência de DNA para 
uma membrana de nitrocelulose ou náilon
Northern blotting - transferência de RNA para 
uma membrana de nitrocelulose ou náilon
Sequenciamento de DNASequenciamento de DNASequenciamento de DNASequenciamento de DNA
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Método de Sanger – terminação de cadeia com 
dideoxinucleotídeos
Método de 
Sanger –
terminação 
de cadeia 
com 
dideoxinucleo
tídeos
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Diferença entre um dNTP e um ddNTP
Na reação de sequenciamento usa-se, além dos dNTPs, 
ddNTP em menor quantidade
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São feitas 4 
reações 
separadas:
1) Os 4 dNTPs + 
ddATP*
2) Os 4 dNTPs + 
ddTTP*
3) Os 4 dNTPs + 
ddCTP*
4) Os 4 dNTPs + 
ddGTP*
Cada reação é submetida a 
eletroforese em gel de 
poliacrilamida, de forma 
que os fragmentos 
sintetizados são separados 
por tamanho
• Após a eletroforese, o gel é 
seco e colocado sob um filme 
de raio X para
• Os fragmentos marcados 
com radioatividade 
impressionam o filme
• Após a revelação, faz-se a 
leitura do filme de baixo para 
cima
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SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO POR ELETROFORESE 
CAPILAR
� Permite análise simultânea de várias amostras
� Detecta moléculas próximas ao final da separação 
eletroforética
� Permite a utilização de alta voltagens (até 30 kV) 
devido à dissipação instantânea do calor emanado pela 
corrida
�Detecta as moléculas em migração pela passagem de 
uma fonte de luz através de uma porção do tubo e 
detecção da luz emitida do outro lado
ELETROFORESE CAPILAR
Utiliza o princípio de Sanger para o 
sequenciamento de DNA
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ELETROFORESE CAPILAR – Sequenciamento de DNA
Pirosequenciamento (Pal Nyrén & Mostafa 
Ronaghi, 1996)
• Técnica de sequenciamento baseada no princípio 
de “sequenciamento por síntese”
• Molde de DNA fita simples, primer, DNA 
polimerase, ATP-sulfurilase, luciferase, apirase
• DNA imobilizado
• Adição de A, C, G e T e remoção após a 
síntese, sequencialmente 
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5’ AACGTACACAGTACTGTTAGGCGACCATA 3’
AATCCGCTGGTAT 5’ 
PPi
ATP
Luz
Apirase
(lavagem)
Próxima 
base
dNTP
ATP-sulfurilase
Luciferase
DNA polimerase
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Pirosequenciamento
1. DNA é fragmentado 
2. DNA fita simples é ligado a microesferas
3. Cada esfera é colocada em um poço de uma lâmina de fibra 
óptica e o DNA é copiado milhares de vezes
(A) Os 4 dNTPs são lançados 
sobre os pocinhos (B); a luz 
produzida é capturada por 
uma câmera (C) e analisada.
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PCR em tempo real
• Amplifica e quantifica uma molécula de DNA-alvo.
• Permite detecção e quantificação de uma ou mais 
sequências específicas de DNA em uma amostra
• O DNA é detectado à medida que a reação 
progride em tempo real
• Frequentemente combinado com transcrição reversa 
para quantificar mRNA ou RNA não codificante em 
células ou tecidos
• Um software calcula a expressão gênica relativa ou 
número de cópias de mRNA
1. Uma PCR comum é preparada e 
uma sonda complementar ao DNA 
alvo é adicionada.
Sonda com repórter 
fluorescente em uma 
extremidade e um 
“extintor” de fluorescência 
na outra (impede detecção 
da fluorescência)
2. Durante o estágio de 
anelamento da PCR, tanto os 
primers quanto a sonda anelam 
ao DNA
RT-PCR Método da sonda repórter fluorescente
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3. A polimerização de uma nova fita de DNA é iniciada a partir 
dos primers e assim que a DNA polimerase alcança a sonda 
hibridizada ao molde de DNA a sua atividade de exonuclease 5’-3’ 
degrada a sonda, separando o repórter fluorescente do extintor e 
provocando aumento na fluorescência
4. A fluorescência é detectada em medida em um termociclador 
PCR real time e seu aumento geométrico (correspondendo ao 
aumento geométrico do produto) é utilizado na quantificação
Aplicações da PCR em tempo real
No laboratório:
• detecção rápida de ácidos nucleicos que são diagnósticos de 
doenças infecciosas, câncer, anormalidades genéticasNa pesquisa:
• quantificação da expressão gênica
• no espaço de tempo
• em diferentes tecidos
• em resposta a variações ambientais
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http://learn.genetics.utah.edu/
Faça uma extração de DNA, uma eletroforese , Faça uma extração de DNA, uma eletroforese , Faça uma extração de DNA, uma eletroforese , Faça uma extração de DNA, uma eletroforese , 
um PCR e clone um camundongo em um um PCR e clone um camundongo em um um PCR e clone um camundongo em um um PCR e clone um camundongo em um 
laboratório virtual emlaboratório virtual emlaboratório virtual emlaboratório virtual em
Assista às seguintes animações:
http://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4&feature=related
Sequenciamento Illumina
http://www.youtube.com/watch?v=UfsHl5_2rMw&feature=related
Human Genome Project Animation
http://www.youtube.com/watch?v=kYAGFrbGl6E&feature=related
Pyrosequencing
http://www.youtube.com/watch?v=jylCHBxTKkw&feature=related
Pyrosequencing (explicado)
http://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4&feature=related
(Real Time- PCR)
http://www.youtube.com/watch?v=rKPJpxCW2qw
http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_3.
html (síntese de cDNA)
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http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_4
.html (hibridização) 
http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_5
.html (Southern blot)
http://highered.mcgraw-
hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter14/animation_quiz_1
.html (Clonagem molecular)