PCR Kame & Aldy(1)

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Centro Universitário - UNIBRASIL
PCR
Reação em Cadeia de Polimerase
Professora: Lyia 
Alunas: Aldiny Paula
 Kamelyn Casagrande
4BMAD
PCR – consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. 
PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os propostos inicialmente. PCR é comparada em importância à definição da estrutura do DNA. 
1984 - PCR foi apresentada pela primeira em um encontro científico 
Publicação: 
Mullis and Faloona, 1987 
Saiki at al. 1988 
1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus. 
1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para fazer PCR. 
PCR requer 7 componentes essenciais: 
- DNA polimerase termoestável 
- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA 
- Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) 
- Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion divalente, usualmente Mg2+ 
- Tampão para manter o pH
Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl) 
- Template de DNA 
Considerações
-Validade dos reagentes
-Número de congelamentos e 
descongelamentos 
-Contaminação (cabelos, pele...)
Pureza (1,8 valor de referência, 
espectrofotômetro)
-Quantidade de material genético
–Pouco: pouca amplificação 
–Muito: pouca amplificação 
 Abs 260
P= ________
 Abs 280
PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos: 
1- Desnaturação da template por aquecimento 
2- Pareamento dos iniciadores à sequência alvo fita única 
3- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável 
Cada uma das novas fitas de DNA estendidas a partir dos “primers” serve como template para síntese de uma nova fita. Os “primers” presentes na reação fazem o pareamento com as novas fitas, na região de complementariedade antiparalela entre “primer”- “template”. Isso garante a aumento exponencial do número de novas fitas. 
Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência de um dos primers na extremidade 5’ e a sequência complementar ao outro primer na extremidade 3’
1)
2)
3)
Fases da PCR:
1ª Fase: Aquecimento a mais
de 90ºC para a separação da
dupla fita 
Separa tanto a Fita de DNA original quanto os produtos de amplificação
2ª Fase: Anelamento dos primers 
Hibridização 
Temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par de primers 
Determina a especificidade da ligação
3ª Fase: Extensão dos primers - duplicação do DNA Temperatura ótima em torno de 72ºC
Ao final da reação, a quantidade de DNA amplificado em relação ao DNA inicial é igual a 2n, sendo que n= número de ciclos da PCR
Exemplo: PCR de 29 ciclos: 229= 536.870.912 cópias para cada fita original
1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador 
automático 
Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica 
>>Perda da atividade da Polimerase 
>>Acúmulo de inibidores 
>>Limitação dos componentes 
>>Competição entre produtos 
>>Pareamento Produto x Molde
>>Competição com anelamento do primer
Tipos de PCR e Variações da técnica
PCR que ocorre dentro de uma célula em lâmina. Pode ser realizada em células ou tecidos fixados.
Variação da PCR Convencional, na qual são utilizados 2 pares de primers (ao invés de um par), para amplificar um mesmo fragmento.
 2 Pares para amplificar um mesmo fragmento
PCR com 2 ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos de uma mesma amostra.
Amplificar diferentes fragmentos de uma mesma amostra
Real Time – PCR
-Detecção, amplificação e quantificação numa única etapa (agilidade na obtenção de resultados)
É uma ótima técnica quantitativa e muito utilizada atualmente
Utiliza Mix comerciais como reagente
Metodologia da PCR 
+ 
Detecção de sinais fluorescentes
PCR: Aplicabilidade
- diagnóstico médico (Polimorfismos)
- mapeamento genético
- detecção de doenças hereditárias
- clonagem de genes 
- testes de paternidade
criação de organismos transgênicos
Genética forense
Real Time – PCR:
-Todas as aplicações da PCR tradicional
-Quantificação de Carga Viral
-Quantificação de Expressão gênica
-Testes de Eficiência terapêutica
-Detecção de Agentes Infecciosos 
-Caracterização de Agentes (Genotipagem)
Doença de Alzheimer 
-Genes da proteína β- amilóide 
(PPA,cromossomo 21) e 
-Da proteína apolipoproteína E 
(APOE, cromossomo 19) >> PSEN1, PSEN2, TNF-a, o PSEN1 e o CYP46
Referencias utilizadas:
BOTELHO, Ingrid Thaís Beltrame .Reação em cadeia da Polimerase. UFSC. Disponível em:<http://proto.ufsc.br/files/2012/03/PCR.pdf> .Acesso em:26/10/2015
 VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível em:< http://etallcorp.xpg.uol.com.br/aula3.pdf>. Acesso em:27/10/2015
Obrigada!!