Genética forense

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Programa de Educação 
Continuada a Distância 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Curso de 
DNA Forense 
 
 
 
 
 
Aluno: 
 
 
 
 
 
 
 
 
EAD - Educação a Distância 
 Parceria entre Portal Educação e Sites Associados 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Curso de 
DNA Forense 
 
 
 
MÓDULO I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores 
descritos na bibliografia consultada.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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SUMÁRIO 
 
 
Módulo I 
Introdução 
Breve histórico do DNA forense 
Fundamentos de biologia molecular 
 
 
Módulo II 
DNA genômico x DNA mitocondrial 
Marcadores de variação genética 
Análise do DNA forense: aspectos gerais 
Estudo da metodologia aplicada à identificação humana 
Exame pericial em local de crime 
 
 
Módulo III 
Coleta do material biológico 
Extração de DNA 
Quantificação de DNA 
Reação de amplificação pela polimerase - PCR 
 
 
Módulo IV 
Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA 
Gel de agarose 
Gel de poliacrilamida 
Eletroforese capilar 
 
 
 
 
 
 
 
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Módulo V 
Interpretação dos resultados 
Análise de outros perfis genéticos 
Cromossomo Y 
DNA mitocondrial 
Controle de qualidade dos laboratórios 
Controle de qualidade externo: testes de proficiência em genética forense 
Considerações finais 
Glossário 
Referências bibliográficas 
 
 
 
 
 
 
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MÓDULO I 
 
Introdução 
 
A identificação humana pelo estudo do perfil genético é amplamente utilizada em 
casos de caracterização de vínculo genético familiar, seja em processos cíveis (ex.: 
exclusão ou não da paternidade), como também em processos criminais (ex.: cadáveres e 
materiais biológicos encontrados na cena do crime). 
Atualmente, a mídia tem contribuído de forma 
significativa para a divulgação e popularização dessa 
tecnologia, que vem evoluindo sobremaneira nas 
últimas duas décadas. 
No entanto, algumas considerações sobre 
essa tecnologia não passam de mito, pois não se 
pode concluir que “o DNA resolve tudo”, mas que a 
análise do perfil genético pode auxiliar na 
identificação humana fazendo parte das provas 
periciais de um determinado caso criminal ou civil. 
 
Segundo Butler (2005), os testes de DNA 
para identificação humana podem ser utilizados para: 
 Casos forenses: análise do DNA do 
suspeito com aquele obtido da evidência biológica encontrada na cena do crime ou nas 
vítimas; 
 Teste de paternidade ou caracterização de vínculo genético familiar: 
exclusão ou não de supostos pais, filhos, mães e outros membros da família; 
 Desastres em massa: identificação dos fragmentos humanos e dos corpos 
encontrados em um desastre com inúmeras vítimas; 
 Investigações históricas; 
 Investigações de pessoas desaparecidas; 
 
 
 
 
 
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 Identificação de militares; 
 Banco de DNA de criminosos 
ou de evidências biológicas. 
 
Para isso, é necessário que alguns 
conhecimentos sejam adquiridos para sua 
posterior realização laboratorial. Tais 
conhecimentos teóricos serão ensinados 
nesse curso, que englobará desde os 
fundamentos básicos da biologia molecular 
até a elaboração de protocolos para a 
realização do estudo do DNA forense. 
 
 
 
 
 
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Breve Histórico do DNA Forense 
 
Antes da utilização do DNA para identificação humana, os genes e suas 
estruturas foram estudados para outras finalidades, sendo resumidamente descrito a 
seguir: 
 1856-1863: Gregor Mendel 
 
Figura 1: Gregor Mendel 
 
→ Considerado o “pai da genética moderna” 
→ Estabeleceu as regras da herança genética 
→ Realizou experimentos com 21.000 plantas híbridas para estabelecer o conceito 
de herança genética (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 2: Resumo dos experimentos realizados por Mendel, com diversos tipos de plantas e sua 
herança genética, com a presença de genes dominantes YY e recessivos yy. 
 
 
 1900-1933: Thomas Hunt Morgan (Figura 3) 
 
 Figura 3: Thomas Hunt Morgan contribuiu para a genética moderna ao descobrir a herança 
cromossômica e a recombinação genética. 
 
 
 
 
 
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→ Descobriu a herança cromossômica (Figura 4) e a recombinação genética, na 
qual os ocorre a troca de fragmentos cromossômicos antes da divisão celular 
(Figura 5). 
 
 Figura 4: Representação esquemática dos resultados dos experimentos de Morgan: herança de 
genes ligados ao cromossomo X. 
 
 
Figura 5: Esquema ilustrativo do método de recombinação genética dos cromossomos. 
 
 
 
 
 
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 1944: Avery, MacLeod e McCarty (Figura 6) 
→ Atribuíram ao DNA a herança genética 
 
 Figura 6: Fotografias dos pesquisadores que estudaram a herança genética do DNA. 
 
 
 
 
 
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 Grupos sanguíneos: Antes dos testes utilizando-se ácidos nucléicos, muitos 
tipos de exames sanguíneos eram utilizados para auxiliar na investigação de paternidade. 
Esses testes, baseados em diferentes sistemas de grupos sanguíneos ofereciam 
resultados de até 70 a 90%, se todos fossem analisados e combinados. Os grupos 
sanguíneos recomendados pela Associação Médica Americana eram os sistemas 
eritrocitários: ABO, Rh, MNs, Kell, Duffy, Kidd e o sistema sanguíneo leucocitário HLA 
(PAGE-BRIGHT, 1982). 
 
 1953: James Watson e Francis Crick (Figura 7). 
 
→ Descoberta da estrutura do DNA (Figuras 8 e 9) 
 
 Figura 7: Watson e Crick. 
 
 
 
 
 
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 Figura 8: Fórmula química de uma cadeia simples de ácido nucléico e diagrama da molécula de 
DNA. 
 
 Figura 9: Modelo original da molécula de DNA descrita por Watson e Crick em 1953.13 
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 1985 – Alec Jeffreys (Figura 10): 
 
 
 Figura 10: Alec Jefreys em seu laboratório – a origem da análise do perfil de DNA. 
 
 
→ DNA fingerprint ou impressão digital de DNA (Figura 10 e 11) foi descrito pela 
primeira vez por Alec Jeffreys, em 1985, e revolucionou a análise do DNA visando a 
caracterização de vínculo genético. 
A identificação das regiões polimórficas é realizada empregando-se Polimorfismo 
de Comprimento de Fragmentos de Restrição (Restriction Fragment length polymorphism 
– RFLP), no qual o DNA é submetido à digestão utilizando-se enzimas de restrição 
específicas que cortam a dupla fita de DNA em regiões determinadas. Os fragmentos são 
separados eletroforeticamente, e posteriormente desnaturados, neutralizados e 
transferidos do gel de eletroforese para uma membrana de nylon, em um processo 
denominado Sourthen blotting. Mediante a presença de uma solução de hibridização com 
sondas específicas contendo fósforo radioativo, os fragmentos de DNA fita simples irão 
 
 
 
 
 
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hibridizar e aqueles não correspondentes serão removidos. Após a autorradiografia, os 
VNTRs poderão ser visualizados para análise (Figura 11 e 12) (COMMITTEE ON DNA 
TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1992; JEFFREYS, 1985). 
 
 
 
 Figura 11: Análise da impressão digital de DNA por Alec Jeffreys. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 12: Representação esquemática da análise de Repetições Consecutivas de Número 
Variável ou VNTR. 
 
 
Desde então, algumas tecnologias foram desenvolvidas incluindo a análise de 
Repetições Consecutivas Curtas ou STRs (Edwards et al, 1991) por gel de poliacrilamida 
corados por prata (Nelleman et al, 1994) ou analisados por equipamentos 
semiautomáticos que utilizam gel de poliacrilamida e realizam a leitura por laser dos 
fragmentos amplificados pela PCR com iniciadores marcados com fluoróforos que emitem 
fluorescência (Kimpton et al, 1993; Gill et al, 1995). 
Atualmente, a eletroforese por capilar (Pearce et al, 1993) é amplamente utilizada 
e possui o mesmo princípio que a eletroforese em gel analisados por laser, com a 
 
 
 
 
 
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diferença de que possui capilares para a separação eletroforética dos fragmentos de DNA 
(Butler, 2005). Há também relatos da utilização de microchips de DNA para a análise de 
STRs (Radtkey et al, 2000; Huang et al, 2004; Divine e Allen, 2005; Bienvenue et al, 
2005), podendo também ser um potencial para a análise futura dos STRs (Figura 13). 
 
 Figura 13: Eventos históricos no mundo e no Brasil relacionados à análise de DNA forense. 
 
 
O Projeto Genoma concluído agora pode identificar pelo sequenciamento do DNA 
humano a localização de genes, revelando que há provavelmente cerca de 20.500 genes 
humanos. Tal fato revelou ao mundo informações detalhadas sobre a estrutura, 
organização e funcionamento do conjunto completo de genes humanos. O Consórcio 
 
 
 
 
 
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Internacional para Sequenciamento do Genoma Humano publicou o primeiro rascunho do 
genoma humano na revista Nature, em fevereiro de 2001, com a sequência de todo o 
genoma de três milhões de pares de bases, cerca de 90% completo. A surpreendente 
conclusão desta primeira versão era de que o número de genes humanos pareceu ser 
significativamente menor do que estimativas anteriores, a qual variou de 50.000 genes a 
140.000 (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
A sequência completa foi concluída e publicada em abril de 2003. Após a 
publicação da maioria do genoma, em fevereiro de 2001, Francis Collins, diretor do 
Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Human Genome Research 
Institute – NHGRI), observou que o genoma poderia ser pensado em termos de um livro 
com várias utilizações: “Trata-se de um livro de história, uma narrativa da viagem da 
nossa espécie através do tempo. É um trabalho manual, com um projeto para construção 
incrivelmente detalhado de cada célula humana. E é um livro-texto transformador da 
medicina, com informações que darão aos profissionais da saúde novos poderes para 
tratar, prevenir e curar as doenças” (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH 
INSTITUTE, 2008). 
As ferramentas criadas através do Projeto Genoma também estão sendo 
utilizadas para caracterizar o genoma de outros organismos usados extensivamente em 
pesquisa biológica como ratos, moscas e frutas. Tal pesquisa é importante porque a 
maioria dos organismos tem genes muito semelhantes ou “homólogos”, possuindo 
funções similares. Estes objetivos são necessários e continuarão a exigir uma variedade 
de novas tecnologias que tornarão possível e relativamente rápido construir um primeiro 
esboço do genoma humano, assim como aperfeiçoar este projeto (NATIONAL HUMAN 
GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
 
 
 
 
 
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As técnicas utilizadas no projeto genoma incluem: 
→ Sequenciamento de DNA; 
→ O emprego da técnica de análise de Fragmentos de 
Restrição dos Polimorfismos de Comprimento (RFLP); 
→ Cromossomos artificiais em levedura (YAC); 
→ Cromossomos artificiais em bactéria (TAS); 
→ A reação em cadeia da polimerase (PCR); 
→ Eletroforese. 
Fonte: An Overview of the Human Genome Project. 
 Disponível em http://www.genome.gov/12011238 
 
 
 
 
 
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Fundamentos de Biologia Molecular 
 
O DNA (ácido desoxirribonucléico) armazena toda a informação genética, sendo 
encontrado nos cromossomos do núcleo e nas mitocôndrias, a maior parte localizada no 
primeiro (Figuras 14 e 15). 
 
 
 
 Figura 14: A célula é a unidade básica de todos os indivíduos vivos. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 15: DNA a molécula da vida: do cromossomo a cadeia dupla de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
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O DNA pode ser extraído de amostras de sangue, de esfregaços bucais, de 
saliva, de osso, de dente, de tecidos e órgãos, de fios de cabelos, de sêmen, entre outros 
materiais biológicos (Brettell et al, 2005) (Figura 16). 
 
 Figura 16: Amostras biológicas para análise do DNA forense. 
 
 
 
 
 
 
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As moléculas de DNA caracterizam-sepor polímeros de alto peso molecular, 
compostos de unidades básicas de nucleotídeos contendo 2-desoxirribose ligados entre 
as posições 3’ e 5’ de carbonos por ligações fosfodiéster. A estrutura do DNA é uma dupla 
hélice de cadeias complementares opostas, na qual as duas moléculas são mantidas 
juntas por fracas pontes de hidrogênio (Figuras 17 e 18) (Watson & Crick, 1953). 
A) 
 
 
 
 
 
 
 
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B) 
 
 Figura 17: A) Representação esquemática da dupla hélice da molécula de DNA segundo Watson 
& Crick, 1953; B). Estrutura química da molécula de DNA, com sua natureza antiparalela com o carbono 3’ 
com o carbono 5’. As bases C e G são ligadas por três pontes de hidrogênio e as A e T, por duas. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 18: Representação esquemática da molécula de DNA. 
 
 
A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina através de duas ou 
três uniões de hidrogênio respectivamente. Essas bases nitrogenadas (adenina - A, timina 
- T, citosina - C e guanina – G ou g) (Figura 19), ao se ligarem com o açúcar, constituem o 
nucleosídeo; sendo que o último ligado com um grupamento fosfato, constitui o 
nucleotídeo, que é a unidade básica de repetição na fita de DNA (Watson & Crick, 1953) 
(Figura 20). 
 
 
 
 
 
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 Figura 19: Estrutura química das bases nitrogenadas e suas respectivas pontes de hidrogênio. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 20: O nucleotídeo e par de bases (“base pair” - bp) 
 
 
Determinados fragmentos de DNA especificam a síntese de RNA em um 
processo denominado transcrição. O ácido ribonucléico (RNA) é um polímero linear 
composto de cadeia de unidades de ribose ligadas pelas posições 3’ e 5’ por intermédio 
de grupamentos fosfodiéster, tendo como função a síntese protéica e também pode 
constituir o genoma de alguns vírus. O gene é uma unidade de transcrição que consiste 
de um segmento de DNA específico que se estende do início do sítio de transcrição ao 
sítio de término de transcrição. O RNA especifica a síntese de polinucleotídeos que 
formarão as proteínas, sendo tal processo denominado tradução, ocorrendo nos 
ribossomos, nas mitocôndrias e cloroplastos (Figuras 21, 22 e 23) (Beard & Armentrout, 
1967; Srinivasan & Yathindra, 1977). 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 21: Fluxograma da transcrição e translação. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 22: Mecanismo de produção de aminoácidos pelas células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 23: Ilustração da transcrição e translação. 
 
 
As regiões de um gene que codificam proteínas são denominadas éxons e 
aquelas que não a realizam, íntrons. Cada éxon codifica uma porção específica da 
proteína completa. Em algumas espécies, incluindo a humana, os éxons são separados 
por longas regiões de DNA denominadas íntrons ou DNA “lixo”, que aparentemente não 
estão associadas à codificação de DNA (National Human Genome Research Institute, 
2008) (Figura 24 e 25). 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 24: Diferenças entre os éxons e íntrons. Observe a remoção da parte amarela, 
correspondente ao íntron. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 25: Diferenças entre os éxons e íntrons. 
 
 
 
 
 
 
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Os alelos constituem as variantes de um gene em uma região particular, ou lócus, 
em um cromossomo. Diferentes alelos produzem variações nas características individuais 
como, por exemplo, cor do cabelo ou tipo sanguíneo (National Human Genome Research 
Institute, 2008) (Figura 26). 
 
 
 
 Figura 26: Alelos correspondentes à cor dos olhos, ligados ao cromossomo X. 
 
 
 
 
 
 
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A duplicação celular ocorre através da mitose (Figura 27) e a formação de 
gametas masculinos e femininos ocorre através da meiose (Figura 28). 
 
 Figura 27: A mitose é responsável pelo crescimento e desenvolvimento dos indivíduos, bem como 
a reposição de células injuriadas ou destruídas do corpo. 
 
 
 
 
 
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 Figura 28: A meiose é um processo de divisão celular pelo qual uma célula diplóide (pares de 
cromossomos, sendo um materno e outro paterno) origina quatro células haplóides (um cromossomo), 
reduzindo à metade o número de cromossomos constante de uma espécie. 
 
 
 
 
 
 
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A transferência das informações genéticas de uma geração a outra ocorre através 
da replicação do DNA, catalisada por enzimas denominadas DNA polimerases. Essas 
enzimas mediam a síntese da nova fita de DNA in vivo, utilizando como molde (template) 
a fita complementar da molécula existente. Inicialmente, a molécula de DNA tem as suas 
fitas separadas pelo rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm a dupla hélice, 
em um processo denominado desnaturação, que ocorre in vivo em pH alcalino. Além da 
fita molde, é necessária a presença de um oligonucleotídeo iniciador ou primer, ou seja, 
um pequeno fragmento de DNA simples, complementar a fita molde, desoxinucleotídeos 
trifosfatados (dATP, dCTP, dGTC, dTTP), que serão incorporados à fita duplicada. A 
replicação do DNA ocorre em regiões específicas denominadas origem de replicação 
(Marmur & Doty, 1959). 
Sucintamente, a replicação ocorre com a adição de um nucleotídeo à fita de DNA 
pela ligação de seu grupo fosfórico, presente no carbono 5' da desoxirribose, com a 
hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do último nucleotídeo presente na cadeia 
replicada. Por esse motivo, descreve-se que a síntese de DNA ocorre no sentido 5´-> 3´ 
(Figura 29) (Marmur & Doty, 1959;). Todo o processo descrito acima será a base do 
princípio da amplificação do DNA in vitro denominada reação em cadeia pela polimerase 
(PolymeraseChain Reaction – PCR), que será estudado nos tópicos adiante. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 29: Posição 5´- 3´das fitas de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
----------------FIM DO MÓDULO I--------------- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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MÓDULO II 
 
 
DNA Genômico X DNA Mitocondrial 
 
O conjunto completo de sequências no material genético de um organismo é 
denominado genoma, incluindo todos os cromossomos mais qualquer DNA presente nas 
organelas. O genoma nuclear humano possui cerca de 3300 Mb, distribuídos em 22 
cromossomos autossômicos e 2 sexuais (Figura 30 e 31), compostos de 30 a 35 mil 
genes, caracterizando por 1,5% a 2% de DNA codificante de proteínas, sendo que 46% 
do total constitui-se de sequências de DNA repetitivas (Wiemann, 2001; Szymasky, 2005). 
 
 
 Figura 30: Cromossomos humanos. 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 31: Cariótipo de um humano do sexo masculino. 
 
 
A finalização do sequenciamento do DNA humano (Tabela 1) trouxe alguns dados 
que alteraram os valores esperados pela comunidade científica, como por exemplo, a 
quantidade de genes. Estimava-se que o genoma humano possuía mais de 80.000 genes, 
mas após o Projeto Genoma, estima-se que existam de 20.000 a 25.000 genes (Figura 
32). 
 
 
 
 
 
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 Tabela 1: Quantidade de nucleotídeos em cada cromossomo humano. 
 
 
 
 
 
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 Figura 32: Resumo das características básicas do genoma humano. 
 
 
 
 
 
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O genoma mitocondrial possui particularidades que o diferenciam do genoma 
cromossômico, sendo sua herança materna. Sua estrutura circular de 16,5Kb lhe fornece 
maior resistência à digestão enzimática de uma única célula há a presença de milhares de 
mitocôndrias, cada qual com uma cópia de DNA mitocondrial, sendo que 93% do seu 
genoma é codificante, não possuindo íntrons e com poucas regiões repetitivas (Anderson 
et al, 1981). Dentro de uma única célula há inúmeras cópias do genoma mitocondrial, ao 
contrário do genoma nuclear, que possui uma cópia por célula (Budowle et al, 2003) 
(Figura 33, 34 e 35). 
 
 
Adaptado de http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/july1999/dnaf1.htm. Acessado em 28/09/2008 
Figura 33: Diferenças básicas entre o DNA genômico ou nuclear e mitocondrial. 
 
 
 
 
 
 
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Figura 34: Representação esquemática do DNA genômico ou nuclear e do DNA mitocondrial 
(mtDNA). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 35: Representação esquemática do DNA mitocondrial (mtDNA), de acordo com as suas 
regiões hipervariáveis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Marcadores de Variação Genética 
 
A variabilidade do DNA humano confere a diferença entre cada ser vivo, sendo 
que pode ser denominada por polimorfismo se a variação genética possuir frequência 
acima de 1% em determinada população e mutação abaixo desse valor (Beiguelman, 
2006). Jeffreys et al. (1985) foi um dos primeiros a analisar as regiões de minissatélites do 
DNA humano, possibilitando a investigação de paternidade e a identificação em casos 
criminais. O polimorfismo dos minissatélites permite que ocorra a diferenciação dos 
indivíduos, aumentando a possibilidade de termos uma quantidade maior de alelos na 
população, desde que não sejam gêmeos idênticos, posto que terão o mesmo perfil 
genético. Para a análise do minissatélite, Jeffrey et al. desenvolveram o DNA fingerprint 
(impressão digital de DNA). Ao utilizar a tecnologia de Southern blot, obtiveram um 
padrão de bandas específico para cada indivíduo, como se fosse uma impressão digital. 
Os Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo de 
comprimento de sequência única englobam os VNTR (Variable Number of Tandem 
Repeats) ou repetições consecutivas de número variável (Wyman e White, 1980; Jeffreys 
et al,1985; Wolff et al,1989) ou minissatélites descritos no parágrafo anterior, e também os 
STR (Short Tandem Repeats) ou repetições consecutivas curtas ou microssatélites 
(Edward et al, 1991; Edward et al, 1992) (Figuras 36, 37 e 38). 
A diferença entre eles é o tamanho da sequência que se repete, sendo que nos 
microssatélites essa estrutura é menor, pois possuem repetições constituídas de 2 a 9 
pares de bases, e o minissatélite, de 10 a 64 pares de bases. Esse DNA satélite na 
maioria das vezes não é transcrito, consequentemente não está associado com a 
expressão da informação genética (Nelleman et al, 1994; Hamond et al, 1994; Gill et al, 
1994; Urquart et al, 1994; Chakraborty et al, 1999). 
 
 
 
 
 
 
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Figura 36: Representação esquemática comparando as VNTRs das STRs, segundo sua unidade de 
repetição. 
 
 
Figura 37: Representação esquemática das repetições consecutivas do STR TPOX e seus 
respectivos alelos. 
 
 
 
 
 
 
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Os Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de nucleotídeo único 
é uma variação na sequência de DNA que ocorre quando um nucleotídeo é alterado por 
outro em sequências de DNA que podem ou não codificar genes (Delahunty, 1996; 
Sobrino et al, 2005; Butler, 2005) (Figuras 38 e 39). 
 
 
Figura 38: Representação esquemática comparando os polimorfismos de sequência com os de 
comprimento. 
 
 
 
 
 
 
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Figura 39: Representação esquemática de sequências de DNAde três indivíduos distintos com a 
presença de um SNP (polimorfismo de sequência) e um STR (polimorfismo de comprimento), mostrando 
suas diferenças. 
 
 
Atualmente, os STRs e SNPs são empregados amplamente para a identificação 
humana e possuem diferenças relevantes (Gill et al, 2004; Butler, 2005) (Quadro 1). 
 
 
 
 
 
 
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Quadro 1: Comparação entre os STRs e SNPs (adaptado de Butler, 2005). 
STR SNP 
Variam de 2 a 9 nucleotídeos que se 
repetem consecutivamente 
Troca de bases A/T, A/G, A/C, C/T, 
C/G, T/G. 
Apresentam-se em diversos alelos, 
normalmente mais de 5 
Normalmente 2 
Detectado por separação 
eletroforética em gel ou capilar 
Análise por sequenciamento ou 
hibridização em microchip. 
O FBI preconiza 13 STRs Estima-se que mais de 50 SNPs 
seriam necessários para a análise (Gill 
et al, 2004) 
Vantagens: 
• Banco de dados populacionais 
realizado no mundo todo 
• A presença de vários alelos 
facilita a identificação de 
mutações e misturas de DNA. 
Vantagens: 
• Os produtos de PCR podem ser 
menores, resultado em maior 
chance de amplificação, 
principalmente em amostras 
biológicas degradadas. 
• Após devidamente otimizados e 
estudados, pode-se analisar mais 
de 1000 SNPs em um mesmo 
microchip, mas essa tecnologia 
ainda não é amplamente 
empregada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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A análise dos SNPs também pode estar associada aos fenótipos individuais, 
havendo uma possibilidade futura de identificação de traços físicos como, por exemplo, a 
cor da íris (Frudakis et al, 2003). Sua grande aplicação na atualidade se dá nas pesquisas 
de farmacogenética e na indústria farmacêutica, na caracterização de doenças de origem 
genética e bioquímica (Wang et al, 1998). 
Jobim et al. (2006) relata que os melhores STRs utilizados na identificação 
humana são aqueles com maior polimorfismo (maior número de alelos), menor tamanho 
(100 a 200 pares de bases), elevado índice de discriminação e heterozigose, e baixa 
frequência de mutações. Para isso, há a necessidade dos laboratórios realizarem a 
frequência genética em pelo menos 100 indivíduos não relacionados. 
 
Análise do DNA Forense: Aspectos Gerais 
 
Para analisar uma amostra de material biológico visando caracterização de 
vínculo genético, seja familiar ou em casos criminais, qualquer contaminação de DNA 
estranho, ou mesmo a inadequação das metodologias aplicadas, pode resultar tanto na 
impossibilidade de estabelecer os perfis genéticos como na inutilização da amostra, posto 
que principalmente em casos forenses a amostra pode ser única. A primeira preocupação 
no estudo do perfil genético, visando à identificação humana, é avaliar o quanto as 
metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, assim como seus 
princípios moleculares e genéticos. 
Tendo em vista assegurar uma geração de dados corretos e tecnologias 
adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade é essencial para os 
laboratórios de análises clínicas que realizam identificação humana pelo DNA. Todas as 
metodologias de análise de DNA forense devem ser submetidas a um programa de 
validação visando assegurar a segurança, a reprodutibilidade e robustez da técnica 
(Klosterman, 2001). Resumidamente, a análise de DNA forense ocorre da seguinte 
maneira (Figura 40): 
 
 
 
 
 
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Figura 40: Esquema da sequência dos métodos a serem utilizados para o estudo do DNA forense, 
englobando os estudos da Biologia, da Tecnologia envolvida e da Genética aplicada. 
 
 
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense (ISFG), que 
atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética Forense (ISFG), 
publica recomendações envolvendo polimorfismos de DNA, demonstrando o interesse em 
avaliar a reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. O FBI acrescenta 
alguns itens para o controle de qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências 
de DNA forense, que inclui, além desses cuidados, a realização de periódicos testes de 
proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de 
qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e identificar 
 
 
 
 
 
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tópicos que devem ser aperfeiçoados e a auditoria para averiguar a qualidade das 
atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 2000). 
Os exercícios propostos para laboratórios que realizam caracterização de vínculo 
genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos mãe, filho e 
suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, seus protocolos 
metodológicos, assim como os resultados obtidos entre os participantes (Bjerre et al, 
1997; Hallengerb e Morling; 2001). 
No Brasil, tais testes de proficiência em identificação humana pelo DNA são 
realizados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de Genética 
Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic Genetics), não 
havendo um grupo específico que realize testes de proficiência no país. Esses testes 
consistem na análise de amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam um 
caso forense para a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 
2000). 
As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório 
podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o 
desenvolvimento e cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos 
para o exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (Neumayer, 1998; INTERPOL, 2001). 
Nos EUA o FBI implantou o CODIS - Combined DNA Index System, que tornou-se 
operacional em 1998, e combina a ciência forense com a tecnologia eletrônica, formando 
um banco de dados de perfis genéticos de DNA extraído de evidências biológicas 
coletadas na cena do crime e DNA de criminosos condenados por agressão sexual e 
outros tipos de violência física (Figura 41). Todos os estados americanos podem ter 
acesso a esse banco de DNA e, dessa maneira, há a possibilidade de comparar os perfis 
genéticos de um suspeito em um crime com os perfis contidos no CODIS, averiguando se 
o mesmo cometeu anteriormente outra infração (FBI, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 41: Inspeção visual de evidência forense. 
 
 
O CODIS selecionou 13 STRs para a análise do perfil genético: CSF1PO, FGA, 
TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, 
e D21S11 (Budowle & Moretti, 1999) (Figura 42 e Tabela 2). Esse conjunto de loci 
transformou-se uma referência para outros países do mundo, no que se refere à ciência 
forense (Sun et al, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 42: STRs recomendados pelo Banco de DNA, vinculadoao FBI (CODIS), segundo a sua 
distribuição nos cromossomos humanos. Fonte: http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/fbicore.htm. 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 2 – Informação dos 13 STRs recomendados pelo CODIS. 
 
Nome do 
Lócus 
Localização do 
cromossomo 
Unidade 
de 
repetição 
Acesso 
GenBank 
http://www.n
cbi.nih.gov/
Genbank/in
dex.html
Variação 
dos alelos 
Número de alelos 
observados 
CSF1PO 5q33.1 
c-fms pronto-
oncogene, 
6° intron 
TAGA X14720 6-16 15 
FGA 4q31.3 
α-fibrinogênio 
3° intron 
CTTT M64982 15-51,2 69 
TH01 11p15.5 
Tirosina hidroxilase 
1° intron 
TC|AT D00269 3-14 20 
TPOX 2p25.3 
Tiroide peroxidade 
10° intron
GAAT M68651 6-13 10 
VWA 12p13.31 
von Willebrand 
factor 
40° intron
[TCTG]
[TCTA] 
M25858 10-24 28 
D3S1358 3q21.31 [TCTG]
[TCTA]
NT_005997 9-20 20 
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10 
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22 
D8S1179 8q24.13 [TCTA]
[TCTG]
G08710 8-19 13 
D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14 
D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10 
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43 
D21S11 21q21.1 [TCTA]
[TCTG] 
complexo
AP000433 24-38 70 
Adaptado de Butler et al, 2005 
 
 
O DNA working group of the European Network of Forensic Science Institutes 
(ENFSI) e Scientific Working Group on DNA Analysis Methods (SWGDAM) (Gill et al, 
2004) levantam a possibilidade futura da substituição do banco de dados de DNA 
atualmente contendo os 13 STRs indicados pelo CODIS do FBI por um banco de dados 
 
 
 
 
 
56 
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de DNA contendo informações de SNPs. Entretanto, os autores citam que a curto e médio 
prazo não haverá a substituição dos bancos de dados, inclusive das tecnologias 
utilizadas, e sim a incorporação dos mesmos em estudos forenses visando à 
padronização do seu uso assim como de sua análise. 
Essa normatização possibilita maior facilidade em comparar tanto as frequências 
alélicas populacionais como os resultados dos perfis genéticos, mesmo que seja realizada 
em outros países. Visando futuramente implantar um banco de perfis genéticos de 
criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou os STRs sugeridos pelo 
CODIS como referência em perícias criminais em seu Manual de Padronização de 
Exames de DNA em Perícias Criminais (Secretaria Nacional de Segurança Pública - 
SENASP, 2006), que está sendo utilizado como referência para os laboratórios que 
trabalham com identificação humana. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Estudo da Metodologia Aplicada à Identificação Humana 
 
A análise do DNA em caracterização do vínculo genético engloba desde o 
domínio da metodologia de coleta do material biológico até a interpretação dos resultados 
obtidos (Butler, 2004) (Figura 43). Cada qual possui sua particularidade e cuidados 
inerentes à técnica que podem oferecer vantagens e desvantagens, de acordo com o 
objetivo almejado. 
 
 
 Figura 43: Esquema de todos os procedimentos envolvidos em caracterização do vínculo 
genético. 
 
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59 
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Exame Pericial no Local do Crime 
 
Em 2000, a Agência Federal de Investigação dos Estados Unidos (EUA), mais 
conhecida como FBI (Federal Bureau of Investigation), elaborou um guia para a 
investigação da cena do crime (TWGCSI – Grupo de trabalho técnico da investigação da 
cena do crime, 2000). Esse manual visa à padronização das práticas adotadas para a 
investigação da cena do crime dos policiais e peritos americanos, tornando-se referência 
em investigação da cena do crime, seja para o exame de DNA forense ou não. Eles 
elaboraram esse manual dividindo em cinco sessões distintas: chegada à cena do crime, 
documentação preliminar, avaliação da cena, processando a cena, finalizando a 
investigação da cena do crime. 
 
1) Chegada à cena do crime: Um dos cuidados mais importantes da perícia 
criminal é a manutenção das evidências físicas e a preservação da cena do crime, que 
deve ser realizada imediatamente após sua constatação, e é realizado normalmente pela 
polícia local (Figura 44). 
 
a) Anotar o local, a data, o tipo de ocorrência, casas, veículos, eventos 
ocorridos e elementos envolvidos; 
b) Não permitir que pessoas, veículos ou objetos saiam da cena do crime, 
identificando possíveis vítimas e suspeitos; 
c) Aproximar-se da cena cuidadosamente e verificar a possibilidade de outros 
crimes ao redor; 
d) Realizar observações iniciais (olhar, ouvir e cheirar) o ambiente e anotá-los; 
e) Observar a possibilidade de perigo de explosão e contaminação por 
materiais perigosos ou tóxicos e, se necessário, chamar policiais especializados para 
analisar a cena do crime; 
 
 
 
 
 
 
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Figura 44: Esquema de isolamento da cena do crime. 
 
 
f) Não permitir que pessoas, veículos ou animais se aproximem da cena do 
crime, evitando contaminações e perigos como explosões; 
g) Após controlar as situações de perigo e isolar a área, a próxima atenção é 
chamar socorro médico para dar assistência médica necessária aos feridos, minimizando 
ao máximo a contaminação da cena do crime; 
h) Anotar todas as etapas dos cuidados médicos, desde sua hora de chegada 
até os cuidados prestados; 
i) Assegurar que evidências como roupas, objetos e manchas encontradas no 
corpo sejam preservadas pela equipe médica; 
j) Documentar todos os comentários e testemunhos de pessoas envolvidas ou 
presentes no local do crime ou ao seu redor; 
 
 
 
 
 
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k) Um oficial da polícia deve sempre que possível acompanhar a vítima para o 
hospital para garantir a preservação das evidências ou mesmo documentar comentários 
feitos pelo paciente; 
l) Lacrar a cena do crime com faixas e adesivos; 
m) Controlar o fluxo de pessoas, inclusive peritos e outros policiais; 
n) Se possível, efetuar mensurações e tirar fotografias com escalas, para 
preservar as evidências – como pegadas, marcas de pneu no chão, etc –, presentes na 
cena do crime, caso chova, neve ou derreta (se for gelo); 
o) Não permitir que qualquer pessoa fume, masque chiclete, use o telefone ou 
banheiro, coma ou beba qualquer coisa, mexa nos vidros e janelas, mude os móveis de 
lugar, etc. Ou seja, não permitir que mexam em qualquer objeto presente na cena do 
crime ou ao seu redor; 
p) Toda a documentação e anotações feitas pelo policial devem ser entregues 
ao investigador de polícia para posterior estudo e análise. 
 
2) Documentação preliminar e avaliação da cena: 
 
a) O investigador de polícia deverá documentar todas as informações 
recolhidas pelo policial, organizá-las e identificá-las com os dados da região do crime 
(delegacia, responsável, cidade, estado, etc); 
b) Continuar a manutenção da cena do crime descrita anteriormente, 
documentando todas as pessoas que estiverem participando da investigação; 
c) Definir estratégias para a análise fotográfica e recuperação dos vestígios 
encontrados na cena do crime. 
 
3) Processando a cena: 
 
a) O investigador deverá avaliar e posteriormente solicitar a presença de 
peritos criminais, de acordo com a especialidade envolvida; 
b) O controle da contaminação deve ser extremamente rígido, evitando-se o 
contágio dos profissionais, das vítimas, da cena do crime, dos objetos, etc.; 
 
 
 
 
 
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c) Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI), como luvas (obrigatório), 
gorros e protetores de sapato (se necessário); 
d) Todo material utilizado para coleta das evidências deve estar devidamente 
limpo ou até esterilizado, caso seja para coleta de material biológico, e deve ser 
corretamente acondicionado (Figura 45); 
 
 
 
 
 Figura 45: Envelopes e sacos de papel para coleta de evidências e objetos encontrados na cena do 
crime como roupas, celulares, documentos, etc. 
 
 
 
e) Toda evidência deve ser corretamente documentada, citando-se a 
localização, identificação e condições que se encontravam, fotografada com escalas de 
referência e/ou filmadas antes de ser removida da cena do crime; 
 
f) Analisar e verificar a metodologia utilizada para a coleta da evidência. Por 
exemplo, cada método requer equipamentos e materiais diferenciados para a sua 
realização. Sendo assim, para fazer a análise de impressões digitais não se utiliza o 
mesmo equipamento para exame de marcas de mordidas, e assim por diante; 
 
 
 
 
 
 
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g) Documentar qualquer intercorrência ou dificuldade havida durante a coleta 
do material; 
h) Preservar adequadamente o material coletado com a finalidade de minimizar 
sua degradação: refrigerado, congelado, local seco, local úmido, etc.; 
i) Encaminhar para os respectivos laboratórios periciais. 
 
4) Finalizando a investigação da cena do crime: 
 
a) Determinar quais evidências foram coletadas; 
b) Discutir com toda a equipe envolvida na cena do crime as intercorrências e 
evidências. 
 
 
 
 
 
 
 
 
------------------FIM DO MÓDULO II----------------- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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65 
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MÓDULO III 
 
 
Estudo da Metodologia Aplicada à Identificação Humana (Cont.) 
 
Coleta do Material Biológico 
 
As amostras de material biológico devem ser minuciosamente colhidas, seja 
quando dispostas na cena do crime ou quando forem de indivíduos devidamente 
identificados. É importante que todas as pessoas que manipulam as amostras tenham 
conhecimentos específicos baseados na literatura especializada, e ainda possuam 
treinamento em boas práticas de manipulação em laboratórios forenses, com rígida 
formação em controle de qualidade (INTERPOL, 2001). Amostras que não estiverem 
adequadamente identificadas e documentadas podem ser questionadas; aquelas que não 
forem corretamente coletadas são passíveis de não serem analisadas; outras, se não 
forem devidamente acondicionadas podem sofrer contaminação e se não forem 
criteriosamente preservadas pode ocorrer decomposição e deterioração (FBI, 2003). 
O FBI (1999, 2001) e a INTERPOL (2001) elaboraram normas para os 
laboratórios forenses que participam da formação dos bancos de DNA internacional, 
englobando principalmente a metodologia de coleta de evidências biológicas para análise 
do DNA, assim como aspectos importantes para o treinamento de pessoal que serão 
descritas adiante. O material biológico presente na cena do crime pode aparentar invisível 
a olho nu, dessa maneira, utiliza-se reagente como o luminol que não interfere na análise 
do DNA para detecção de amostras com vestígios de sangue, sendo que reage com o 
ferro presente na hemoglobina, exibindo uma quimioluminescência (GROSS et al, 1999). 
Outros kits de reagentes são empregados: aqueles que contém antígeno próstata-
específico para sêmen (HOCHMEISTER et al, 1999) e para saliva, o teste de detecção de 
amilase por Phadebas® (WILLOTT & GRIFFITHIS, 1980) etc. Diversos cuidados devem 
ser tomados para a documentação das amostras coletadas na cena do crime: fotografar o 
local de remoção das evidências, realizar anotações da sua disposição e de 
características pertinentes (SÃO PAULO, 1999; INTERPOL, 2001 ; FBI, 2003; 
 
 
 
 
 
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BONACORSO, 2005). Amostras de sangue podem ser coletadas dos indivíduos, 
encontradas em corpos, objetos e superfícies (Figura 46). Qualquer que seja o material 
biológico a ser coletado, o manipulador deverá utilizar luvas ou pinças estéreis (Figura 46 
e 47). A coleta de sangue em indivíduos hígidos deverá ser realizada em dois tubos de 
5mL contendo EDTA como anticoagulante, devidamente identificado e a seguir 
refrigerado. 
Recomenda-se que os objetos, superfícies ou corpos que possuem as amostras 
de sangue sejam recolhidos se possível, além de realizar esfregaços nas formas líquidas 
ou, se secas, umidificar a região com água estéril, seguida de esfregaço. Em ambos os 
casos aconselha-se esperar secar os esfregaços (Figuras 48 e 49) para depois serem 
embalados em envelope de papel limpo (Figura 47), evitando que a umidade facilite o 
crescimento de bactérias e fungos. Amostras desêmen, de saliva e urina, ou de objetos 
que os contém, podem ser utilizadas e seguem a mesma metodologia descrita 
anteriormente. Tecidos, dentes, ossos e fios de cabelos também podem servir de fonte de 
células para análise de DNA (FBI, 2003). A estocagem do material deve ser em 
refrigerador a 4°C ou em freezer a -20°C, no entanto, para longos períodos, estocar a -70 
a -80°C (BUTLER, 2005). 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 46: Amostras de sangue sendo coletadas de um objeto perfuro-cortante – faca – 
frequentemente utilizado em agressões físicas e homicídios. 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 47: manipulação de material contendo amostras biológicas com luvas. 
 
 
 
 
 Figura 48: esfregaço bucal utilizado para a coleta de saliva e células descamadas da mucosa oral, 
para a extração de DNA. 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 Figura 49: Coletor estéril apropriado para coleta de materiais biológicos presentes na cena do 
crime. 
 
 
O armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no 
máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. 
Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua 
coleta e disposição individualmente descrito (Secretaria de Segurança Pública de São 
Paulo – SSP-SP, 1999; INTERPOL, 2001). A degradação do DNA de amostras biológicas, 
utilizadas em investigação criminal, pode ocorrer decorrente de um processo natural de 
exposição ao meio-ambiente. Luz, umidade, temperaturas elevadas, bem como 
contaminações bacterianas ou fúngicas levam à degradação química do DNA humano 
(SCHNEIDER et al, 2004). 
A comissão de DNA da Internacional Society For Forensic Haemogenetics – ISFH 
sugeriu algumas recomendações para a análise de DNA pela PCR, incluindo que essa 
contaminação pode ser evitada, atendendo a certos cuidados durante todo o processo de 
análise de DNA, que vão desde a coleta e armazenamento do material biológico do qual 
 
 
 
 
 
70 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
será extraído o DNA, até o próprio local de preparação da PCR. As contaminações das 
amostras pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta 
interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de 
normas de procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se 
imprescindíveis (INTERPOL, 2001). 
Visando o estabelecimento de normas para coleta e exame de materiais 
biológicos para identificação humana, a Secretaria de Segurança Pública do Estado de 
São Paulo (SSP-SP) baixou a Resolução SSP-194, em 2 de junho de 1999 (São Paulo, 
1999): 
 
“Considerando: 
a) a necessidade de normatizar os serviços periciais relativos à 
coleta de materiais biológicos para exames de identificação humana, 
tanto nos locais de crime quanto na pessoa humana, viva ou morta; 
b) que os procedimentos a serem seguidos pelos órgãos policiais e 
periciais oficiais devem estar em consonância com os ditames da 
legislação em vigor, e 
c) que é imprescindível a correta preservação das amostras para 
não haver contaminações ou outros prejuízos (p. 104)”. 
 
Continuando na mesma Resolução, em seu anexo cita os cuidados que devemos 
ter para a coleta, armazenamento e análise do material biológico para a extração de DNA. 
Os cuidados incluem utilização de luvas descartáveis; instrumentos de coleta, 
armazenamento e análise devem ser estéreis; a documentação completa do vestígio 
eleito para a coleta, incluindo-se fotografias da região, tipo de armazenamento, entre 
outros; o armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no 
máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. 
Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua 
coleta e acondicionamento individualmente descrito. 
 
 
 
 
 
 
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EXTRAÇÃO DE DNA 
 
 
 
 
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores, 
podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para a sua extração. Após a 
coleta do material biológico, o DNA da amostra deverá ser separado de outras 
substâncias celulares antes de ser examinado. Proteínas celulares, contaminações 
químicas e microbiológicas diminuem o poder discriminatório das análises utilizando o 
DNA (BUTLER, 2005; HOFF-OLSEN et al, 1999; JUNG et al, 1991). 
A escolha do uso de diferentes métodos de extração de DNA está relacionada ao 
tipo de material envolvido e influencia diretamente o sucesso da análise dos STRs. A 
maioria dos procedimentos de extração de DNA compreende a lise celular, seguida da 
remoção das proteínas celulares precipitadas e por fim a precipitação do DNA com sua 
final eluição. Existem diversos métodos para obtenção de DNA: a extração orgânica, que 
é a mais tradicional, empregando-se a proteinase K para lise celular e fenol clorofórmio 
 
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73 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SALIVA PELO MÉTODO 
ORGÂNICO (Anzai et al.; 2001). 
 
A amostra de saliva coletada e colocada em tubo estéril é submetida à 
centrifugação para a separação das células de sua parte aquosa, removendo-
a. As pontas contendo o algodão dos swabs – que contém a saliva coletada 
sobre a pele – foram colocadas em um tubo estéril, sendo imediatamente 
iniciado o processo de extração, sem nenhum preparo prévio. Em seguida, 
adiciona-se 700μL do tampão de lise para saliva (10mM TRIS pH8,0; 10mM 
EDTA; 0,1 M NaCl; 2% SDS) e posteriormente 35μl de Proteinase K 20mg/mL. 
Após agitação, a tampa do tubo deve ser vedada com Parafilm® e incubada 
por uma noite a 56oC. 
A seguir, a Proteinase K é inativada a 95oC por 10 minutos, 
adicionando-se 700μL de fenol tamponado com pH 8,0 e homogeneizando-se 
com movimentos manuais leves por 5 minutos. Centrifuga-se e o 
sobrenadante é transferido para outro tubo, utilizando uma micropipeta com 
ponteira estéril. Acrescenta-se fenol/ clorofôrmio/ álcool isoamílico (25:24:1) 
na mesma quantidadedo sobrenadante removido, homogeneiza-se, 
centrifuga-se e remove-se o sobrenadante novamente para outro tubo. 
Adiciona-se ao sobrenadante cerca de 2 ou 3 vezes o volume recuperado, 
álcool 100% e 10% do volume em acetato de sódio 5M. Incuba-se durante 
uma noite a -20oC. 
No terceiro dia de extração, centrifuga-se a mistura. Dispensa-se o 
etanol, e ao precipitado adiciona-se 1mL de etanol 70%, homogeneizando-se 
cuidadosamente. Centrifuga-se e novamente é removido o álcool. Seca-se 
totalmente o "pellet". Ressuspende-se o "pellet" com 100μL de T.E. (Tris-base 
100mM, pH 7,6; EDTA 10mM, pH 8,0). 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
A técnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira fase, a lise 
celular, seguida de desnaturação ou inativação de proteínas. Com solventes orgânicos o 
DNA é posteriormente separado de macromoléculas, como as proteínas através de 
solubilização em água, e em seguida precipitado com etanol. Outras metodologias com o 
mesmo princípio, inclusive kits comerciais, podem ser utilizadas para cada tipo de 
amostra biológica. Há diferentes metodologias para a extração de DNA de sangue total 
(Salazar et al., 1998; Schneider, 1998), de esfregaços vaginais e de amostras de sêmen 
(Schneider, 1998), de saliva total e de materiais contendo saliva (Walsh D et al., 1992; 
Sweet et al., 1996; Hochmeister et al., 1998; Anzai et al., 2001, Anzai-Kanto, 2005); de 
dente humano (Oliveira, 2000), de osso (Hagelberg et al., 1991; Alves, 2000) (Figura 53); 
de material parafinado (Mesquita et al., 2001), tecidos removidos de cadáveres 
(Hochmeister, 1998) (Figura 51), entre outros. 
 
 
 Figura 53: Cadáver em avançado estado de putrefação, submergido em mar por 
aproximadamente 1 mês. O material biológico coletado para a extração de DNA foi a cabeça do fêmur e 
tecido da parte interna do tórax, utilizando a porção interna da amostra para evitar a contaminação do DNA 
externo. 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 
 
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários fatores como 
condições da amostra e da conservação, sendo necessário utilizar critérios para escolha 
da metodologia de extração para cada tipo de amostra (HAGELBERG et al., 1991; 
HOCHMEISTER, 1998; SALAZAR et al., 1998; SCHNEIDER, 1998; ALVES, 2000; ANZAI 
et al., 2001; MESQUITA et al, 2001; OLIVEIRA et al, 2002). 
O DNA pode ser obtido inclusive de células únicas, como as bucais. O isolamento 
de DNA micromanipulado de cada uma das 226 células utilizadas, a alteração da 
concentração de iniciadores, a utilização de AmpliTaqGold® e reação de PCR com 34 
ciclos, possibilitou que Findlay et al. (1997) obtivessem sucesso ao amplificar o DNA de 
cada uma dessas células. AmpliTaqGold tem uma estabilidade à temperatura maior do 
que outras taqs, como a taq polimerase comum. Ao amplificarem individualmente o DNA 
de cada célula, obtiveram amplificação em 91% (206), sendo que em 50% (114) o perfil 
genético (7 loci) foi completo, em 64% (144) amplificou-se 4 a 6 loci. Os autores insistem 
no rigoroso controle da contaminação, posto que mesmo tomando esse cuidado em sua 
Extração de DNA Do Sangue (Salazar et al, 1998) 
 
 As amostras de sangue foram submetidas à lise celular com 1000µL 
do tampão Tris-1 (Tris HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl2 10mM EDTA 2mM 
pH 8,0) contendo Triton X-100 a 2.5%. Após a centrifugação, os núcleos 
celulares foram lisados com 220µL do tampão Tris-2 (Tris-HCl 10mM pH8,0, 
KCl 10 mM, Mg Cl2 10mM, EDTA 2mM pH 8,0, NaCl 0,4 M) contendo SDS a 
1%. As proteínas foram removidas por precipitação salina com 100% seguindo 
de lavagem etanol 70%, por 3 vezes. Posteriormente o DNA foi ressuspendido 
em 100µL do tampão TE (Tris-HCl 10 mM e 1mM EDTA, pH 8,0) e mantidos a 
–20oC.
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
pesquisa obtiveram 28% com alelos adicionais aos verdadeiros alelos, e 11% somente 
com alelos adicionais. 
 
Quantificação de DNA 
 
A quantificação do DNA após a sua extração é importante para o aperfeiçoamento 
da qualidade do produto de DNA resultante da PCR (Internacional Society for Forensic 
Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA em uma amostra de PCR poderá saturar a 
reação, fazendo com que apareça artefatos de técnica e amplificações inespecíficas que 
podem dificultar a sua análise. Já a sua falta poderá acarretar a perda de um dos alelos, 
quando o indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos mesmos (Butler, 
2005). 
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas após a extração, além 
de verificar a possibilidade de degradação (JUNG et al, 1991; HOFF-OLSEN et al, 1999). 
O DNA pode ser quantificado por espectrofotometria em espectrofotômetro (Figura 54 e 
55) a 260 nm, sua pureza pela relação 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada 
em géis de agarose. No entanto, esses métodos avaliam a quantidade geral de DNA, seja 
ele humano ou de outro tipo. Quando se refere às amostras utilizadas em investigação 
criminal ou passíveis de degradação e contaminação, recomenda-se a utilização da 
quantificação de DNA de humano (INTERNACIONAL SOCIETY FOR FORENSIC 
HAEMOGENETICS - ISFH, 1992). 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 Figura 54: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de ácidos nucléicos. 
 
 
 Figura 55: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de DNA que utiliza apenas 1μL de 
produto de extração de DNA. 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Essa quantificação pode ser realizada por hibridização de uma sonda utilizando-
se um determinado lócus (D17Z1) em uma amostra de DNA imobilizada de uma 
membrana de náilon – dot blot (WALSH et al., 1992; ANDERSEN, 1998), e por kits 
comerciais como, por exemplo, o AluQuant™ human DNA quantitation system (WAYE et 
al, 1989; HOFF-OLSEN et al, 1999; MANDREKAR et al., 2001; SCHNEIDER et al, 2004; 
BUTLER, 2005). Apesar dessas técnicas serem mais complexas e caras que a 
espectrofotometria, elas quantificam somente o DNA humano, pois possuem sondas 
específicas para o mesmo. Tal característica pode ser imprescindível em casos forenses 
que haja a possibilidade de contaminação de DNA externo. No entanto, muitas vezes não 
é utilizada, pois há a necessidade de 5 a 10μL de produto de DNA, o que muitas vezes 
não é obtido. 
Uma metodologia que está substituindo as outras técnicas de quantificação por 
utilizar pouca quantidade de DNA, serespecífico para DNA e inclusive possibilitando 
verificar a presença de inibidores da enzima polimerase é a quantificação de DNA por 
PCR em tempo real. Principalmente em casos forenses que existe ínfima quantidade de 
DNA, está sendo altamente recomendada. Consiste no emprego de marcadores 
específicos marcados com fluorescência que são utilizados para a amplificação de 
regiões do genoma humano. No entanto, para fins didáticos, será explicado após a 
explicação da reação em cadeia pela polimerase (PCR), pois envolve a amplificação do 
DNA. A amostra biológica sendo preservada adequadamente e realizada em ótimas 
condições de extração e quantificação obtém-se quantidades maiores ou menores de 
DNA (Tabela 3). 
 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
Tabela 3: Quantidade de DNA extraído de diversos tipos de material biológico (Butler, 
2005). 
 
Tipo de amostra Quantidade de DNA 
Sangue total 20000 ~ 40000 ng/mL 
Mancha de sangue 250 ~500 ng/cm3 
Líquido seminal 150000 ~ 300000 ng/mL 
Esfregaço de material vaginal pós-coito 10 ~3000 ng/esfregaço 
Fio de cabelo com bulbo 1 ~750 ng/fio 
Pêlo com bulbo 1 ~10 ng/pêlo 
Saliva total 1000 ~10000 ng/mL 
Esfregaço bucal 100 ~1500 ng/esfregaço 
Urina 1 ~20 ng/mL 
Osso 3 ~10 ng/mg 
Tecido 50 ~500 ng/mg 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Reação de Amplificação pela Polimerase - PCR 
 
Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi a PCR, tendo 
como seu inventor Kary Mullis (Figura 56), recebendo o Prêmio Nobel por essa 
descoberta (INTERPOL, 2001). A PCR consiste na amplificação seletiva de uma 
sequência-alvo de DNA específica a partir de uma coleção heterogênea de DNA, 
empregando-se um par de oligonucleotídeos iniciadores que são complementares a uma 
certa extensão em ambas as fitas do DNA a ser amplificado (Saiki et al, 1985). Várias 
sequências de iniciadores de diversas regiões do DNA humano já foram estabelecidas 
possibilitando a amplificação de seus respectivos STRs nas reações de PCR 
(Polymeropoulos et al., 1991; Polymeropoulos et al., 1992; Nishimura & Murray, 1992; Li 
et al., 1993; Moller et al., 1994; Urquhart et al., 1994; Urquhart et al., 1995; Jin et al., 
1997). A sequência-alvo de DNA, cuja continuação é originalmente conhecida, é 
denominada DNA molde. 
 
 
 Figura 56: Kary Mullis inventou a PCR, permitindo que sejam amplificados in vitro fragmentos 
de moléculas de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
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A PCR envolve três etapas: desnaturação, hibridização e extensão. A 
desnaturação ocorre quando a molécula de DNA é aquecida acima da temperatura de 
90°C, na qual as pontes de hidrogênio da dupla hélice se rompem, ocorrendo a separação 
das cadeias complementares. Os iniciadores se ligam especificamente às sequências de 
DNA complementares no processo de hibridização, mediante uma temperatura que pode 
variar de 45 a 72°C e deve ser previamente otimizada, estando relacionada à temperatura 
de melting (Tm), que é medida através de uma fórmula específica que envolve a 
quantidade de C e G em sua sequência. 
A prevalência de ligação dos iniciadores ocorre pela sua alta concentração no 
meio da reação. A enzima termoestável denominada DNA polimerase direciona o 
posicionamento dos precursores do DNA – dNTP – iniciando a síntese de novas fitas de 
DNA. Com um novo aumento de temperatura, a enzima DNA polimerase catalisa a 
reação, incorporando o nucleotídeo na posição terminal do iniciador, complementando as 
bases do DNA molde, promovendo a extensão da fita (Saiki, 1985, Sambrook et al, 2001) 
(Figura 57, 58 e 59). 
 
 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 Figura 57: Esquema da reação de PCR, com visualização dos fragmentos. 
 
 
 
 
 
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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores
 
 
 Figura 58: Representação esquemática da PCR com detalhamentos dos reagentes que a 
envolvem. 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 59: Esquema representativo de exemplo de ciclagem para uma PCR convencional. 
 
 
A PCR é realizada em equipamentos denominados termocicladores que 
controlam e variam a temperatura automaticamente para cada programa pré-estabelecido 
pelo pesquisador (Figura 60). 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 60: Exemplo de termociclador utilizado para a PCR. 
 
 
A reação de PCR é preparada utilizando-se diversos reagentes que devem 
possuir concentrações específicas para cada tipo de análise. Atualmente, existem 
diversos kits de PCR contendo todos os reagentes pré-padronizados que facilitam a 
utilização da PCR em laboratórios forenses. No entanto, é de grande importância que o 
pesquisador entenda todo o processo de amplificação e seus reagentes. O reagente que 
vai direcionar a otimização de cada reação será o primer ou iniciador, que flanqueará a 
região do DNA a ser copiada, sendo um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente e é 
adicionado à reação em altas concentrações (Butler, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 4: reagentes utilizados em uma PCR com a respectiva concentração ótima. 
Reagente Concentração ótima 
Tris-HCl, pH 8,3 (25°C) 10 a 50 mM 
Cloreto de Magnésio 1,2 a 2,5 mM 
Cloreto de Potássio 50 mM 
Desoxirribonucleotídeos trifosfatados 
(dNTPs) 
200 μM de cada 
nucleotídeo(dATP, dTTP, dCTP, 
dGTP) 
DNA polimerase termoestável 0,5 a 5 U 
Soro de Albumina Bovina (BSA)* 100 μg/mL 
Primers ou Iniciadores 0,1 a 1,0 μM 
DNA 1 a 10 ng de DNA 
* Não é utilizado em todas as reações 
 
 
As ciclagens da PCR variam de acordo com os reagentes empregados, 
principalmente com a enzima polimerase, que altera a temperatura de extensão, os 
primers, que muda a temperatura de hibridização; e com a amostra de DNA, pois 
apresenta-se em pouca quantidade, podendo aumentar o número de ciclos. Só para ter 
uma idéia da variação das condições de ciclagem para kits diferentes utilizados em DNA 
forense foram colocados na tabela 5 exemplos de parâmetros de duas empresas 
distintas. 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabela 5: Parâmetros utilizados para a ciclagem da PCR em kits de PCR multiplex 
comercialmente disponíveis no mercado, e que são os mais utilizados mundialmente. 
Passo do protocolo AmpFlSTR® kits 
(Applied 
Biosystems) 
GenePrint® STR Kits 
(Promega 
Corporation) 
Desnaturação inicial 95°C / 11 
minutos 
95°C / 11 minutos 
Quantidade de ciclos 28 ciclos 30 ciclos 
Desnaturação 94°C / 1 minuto