Aula 2 - Métodos de Estudo da Célula

Prévia do material em texto

Métodos de estudo da célula
Dimensões das 
estruturas celulares e 
subcelulares
• Célula vegetal: ± 50µm
• Célula animal: ± 10-20µm
• Bactérias: ± 1-2µm
• Vírus: ± 0,05µm• Vírus: ± 0,05µm
• Núcleo: ± 3-6µm
• Mitocôndrias: ± 0,5µm
• Ribossomos: ± 25nm
• Membrana: ± 10nm
Como visualizar células e 
diferentes estruturas celulares?diferentes estruturas celulares?
Métodos de investigação da estrutura
celular
Microscopia óptica (ou microscopia de luz)
Descobrimento da célula e formulação da teoria celular
Técnicas citoquímicasTécnicas citoquímicas
Identificação e localização de diversas moléculas
constituintes das células
Microscopia eletrônica
Grande poder de resolução; detalhes da estrutura celular
Separação de organelas celulares
Estudo celular em Microscopia Óptica
MonoMono--ocularocular BinocularBinocular Múltiplos observadoresMúltiplos observadores
Constituído de: parte mecânica + parte óptica (Lembra da prática?)
Parte Óptica� 3 sistemas de lentes
Condensador� projeta a luz sobre as células
Objetiva� recebe o cone de luz, projeta uma imagem aumentada
Ocular � recebe imagem da objetiva e amplia
Limites de Resolução
Estudo celular em Microscopia Óptica
• Exames de tecido à fresco
• Exame de tecidos mortos ou preservados
• Problemas• Problemas
– Células transparentes
– Células pequenas e complexas
• Visualização: coloração
Estudo celular em Microscopia Óptica
Exames de tecido à fresco
• Corte fino ou transparente para ser posto na
lâmina
Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Espalhamento - células de mucosa bucal
azul de metileno
Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Esfregaço – células sanguíneas
Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Esmagamento – cromossomos e núcleo em
interfase
Estudo celular em Microscopia
CORTES HISTOLÓGICOS
• Cortes extremamente finos para permitir a fixação
na lâmina
Estudo celular em Microscopia
FIXAÇÃO E PREPARAÇÃO DE CORTES
�� FIXAÇÃOFIXAÇÃO DEDE TECIDOSTECIDOS
�� Formol,Formol, GlutaraldeídoGlutaraldeído,, MisturasMisturas fixadorasfixadoras......
�� PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS�� PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS
�� CortesCortes dede tecidotecido
�� DesidrataçãoDesidratação
�� DiafanizaçãoDiafanização
�� InfiltraçãoInfiltração // ImpregnaçãoImpregnação
�� CortesCortes emem µµmm
�� ColoraçãoColoração
�� MontagemMontagem
�� VisualizaçãoVisualização
DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltraçãoFixaçãoFixação
MicrotomiaMicrotomiaColoraçãoColoraçãoMontagemMontagem
Fixação - promove a preservação das características
morfológicas e macromoléculas dos tecidos ou
células.
• Função→ impedir a autólise ou degradação
bacteriana do material biológico a ser analisado
• Facilitar os processamentos posteriores de 
coloração → muitos corantes apresentam maior
afinidade pelo substrato fixado → promover o 
enrijecimento dos orgãos e tecidos.
• Aumentar o contraste na microscopia eletrônica
Fixadores→ agentes químicos das mais diversas
funções orgânicas;
– Reagem quimicamente com os componentes
celulares, promovendo a sua estabilização.
– Principais componentes celulares que podem ser 
preservados → proteínas, ácidos nucléicos, 
polissacarídeos e lipídios → os fixadores atuam
sobre estas macromoléculas tornando-as insolúveis.
• Desidratação→ retirada lenta de água
• Bateria de álcool com concentrações crescentes: 70%, 
80%, 90% e 100% → o tempo vai depender do material 
e do material de inclusão.
• A água deve ser toda retirada por não ser missível em• A água deve ser toda retirada por não ser missível em
XILOL ou em ÓLEO DE CEDRO → diafanização→ 
clareamento do material
• Inclusão em parafina→ dar maior consistência ao
material.
• Microtomia→ corte do material em micrótomo.
Coloração para Microscopia Óptica
• Corantes básicos ou catiônicos (+) - Liga-se a moléculas com carga (-)
BASOFILIA → a estrutura corada é BASÓFILA
Ex: Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína, 
lugol, Verde-janus B, violeta de genciana
Núcleo → DNA e RNANúcleo → DNA e RNA
Citoplasma → proteínas e carboidratos
• Corantes ácidos ou aniônicos (-) - Liga-se a moléculas com carga (+)
ACIDOFILIA → a estrutura corada é ACIDÓFILA
Ex: Eosina, Ácido Periódico Schiff (PAS), ácido ósmico 
Citoplasma e núcleo → proteínas com carga (+) 
NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam
acidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.
Quanto ao papel fisiológico:
VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Ex: Verde-janus B, azul 
de metileno, vermelho neutro, Sudan III.
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, 
Coloração para Microscopia Óptica
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, 
vermelho escarlate, violeta de genciana.
Quanto às propriedades tintoriais:
ORTOCROMÁTICOS - Conferem a célula a mesma cor que apresentam in 
vitro. Exemplos: Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.
METACROMÁTICOS - Dão a célula coloração diferente da que apresentam 
in vitro. Exemplos: Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.
Coloração para Microscopia de 
Fluorescência
Envolve a aplicação de técnicas 
citoquímicas
Reação com anticorpos ou 
corantes fluorescentescorantes fluorescentes
Radiação ultravioleta como 
equivalente a fonte de luz em 
microscopia óptica
Microscópio Eletrônico
Potencial de aumento muito 
maior que o óptico
Inventado em 1932 e vem 
sendo aperfeiçoado desde 
entãoentão
Intervalo de aumento �
1.000x a 200.000x.
Poder de resolução = 1nm 
(200x maior que o MO) 
Microscópio Eletrônico
• Feixes de elétrons ao invés de luz 
(óptica) 
No microscópio eletrônico não há 
lentes de cristal e sim bobinas, 
chamadas de lentes chamadas de lentes 
eletromagnéticas;
• As lentes eletromagnéticas 
ampliam a imagem gerada pela 
passagem do feixe de elétrons no 
material e projetam-na sobre uma 
tela, onde é formada a imagem
Obtenção dos cortes para M.E.
+ solução de sais de 
urânio e chumbo
• Não é possível observar material vivo neste tipo de 
microscópio;
• O material a ser estudado passa por um complexo 
processo:
– Desidratação
– Fixação– Fixação
– Inclusão em resinas especiais (muito duras)
– Cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro-
ultramicrótomo; 
A imagem do objeto é formada simultaneamente à passagem 
do feixe de luz através dele.
Bastante difundido no estudo de materiais biológicos, permite 
definição de imagens intracelulares, permitindo estudos de 
morfologia celular, aspectos gerais das organelas e também da 
interação de parasitas com células.
•Tipos de microscópios eletrônicos:
–Transmissão – MET - usado para a observação de cortes 
ultrafinos;
–Varredura – MEV - capaz de produzir imagens de alta 
ampliação usado para a observação de superfícies;
Fagocitose
Célula animal
Célula vegetal
Cloroplasto
Mitocôndrias
Cloroplasto
Complexo de Golgi
Um feixe de elétrons 
bombardeia a superfície do 
material “varrendo-a”; 
então, elétrons secundários 
ou refletidos são utilizados 
para obter imagens 
tridimensionais.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
tridimensionais.
Capaz de produzir imagens 
de alta ampliação e 
resolução aumentos 10x a 
400.000x com grande 
profundidade de foco
Poder de resolução de 
10nm.
As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter 
virtual;
O que é visualizado no monitor doaparelho é a 
transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao 
contrário da radiação de luz
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
contrário da radiação de luz
A topografia de objetos sólidos pode ser examinada com 
grande facilidade, as micrografias têm aspecto 
tridimensional;
Ataque de leveduras à Salmonella
Diferentes formas de grãos de pólen
MEV MET
�� CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO
�� PermitePermite isolarisolar organelasorganelas dede homogeneizadoshomogeneizados celulares,celulares, parapara
análisesanálises químicas,químicas, físicasfísicas ee biológicasbiológicas;;
SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARESSEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES
�� OO isolamentoisolamento dede umauma organelaorganela dependedepende dede::
-- seuseu coeficientecoeficiente dede sedimentaçãosedimentação;;
-- densidadedensidade ee viscosidadeviscosidade dada soluçãosolução..
�� CentrifugaçãoCentrifugação FracionadaFracionada;;
�� CentrifugaçãoCentrifugação ContraContra GradienteGradiente..
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse 
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio 
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
células
Homogeneização 
Material na 
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são 
possíveis para transformar 
células, órgãos, tecidos em 
um homogenado, ou extrato 
bruto, como mostra a figura.
tecidos
Homogeneização 
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material 
de 
partida
Centrifugação FracionadaCentrifugação Fracionada
Centrifugação Contra GradienteCentrifugação Contra Gradiente
Cromatografia
• Separação de macromoléculas, como proteínas 
e ácidos nucléicos
• “Filtragem” de um macerado celular em uma 
matriz porosa, por meio da interação das 
macromoléculas com a matrizmacromoléculas com a matriz
– Interação de Troca iônica: dependente de cargas
– Interação hidrofóbica
– Filtração em gel: dependente do tamanho e forma
– Interação por afinidade: enzima-substrato ou 
antigeno-anticorpo.
Cromatografia
Matriz 
Tubos coletores
�� CromatografiaCromatografia dede TrocaTroca IônicaIônica
-A matriz da coluna cromatográfica é
carregada + OU –
- Proteínas ligam ao suporte por
interação de carga.
�� CromatografiaCromatografia dede InteraçãoInteração HidrofóbicaHidrofóbica
- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
partículas com superfície
hidrofóbica;
- Proteínas hidrofóbicas
interagem com o suporte e
retardam sua passagem.
Cromatografia Cromatografia de Filtração em Gelde Filtração em Gel
- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
partículas porosas, atuando
como uma peneira para acomo uma peneira para a
passagem de proteínas;
CromatografiaCromatografia dede AfinidadeAfinidade
- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
antígenos (ou substratos para
enzimas) ligados;
- Proteínas ligam ao suporte
por bioafinidade e
especificidade.
Eletroforese
DeterminaDetermina oo tamanhotamanho dasdas
proteínasproteínas;;
IdentificaIdentifica fragmentosfragmentos dede
diferentesdiferentes tamanhostamanhos dede
DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..
SeparaçãoSeparação dasdas
macromoléculasmacromoléculas porpor cargacarga
(+(+ ouou --)) ee tamanhotamanho (do(do
maiormaior parapara oo menor)menor)
Proteínas de diferentes 
tamanhos e cargas
Fragmentos de DNA de 
diferentes tamanhos
-- HibridizaçãoHibridização exex situsitu
Resumindo... Existem diversas formas 
de se explorar a célula:
Ponto de vista morfológico: Microscopia
óptica fluorescência
eletrônica (transmissão e varredura)
Ponto de vista das organelas e seus constituintes:Ponto de vista das organelas e seus constituintes:
Centrifugação: isolamento de organelas
fracionada e com gradiente 
Cromatografia: isolamento de macromoléculas
Troca iônica Interação hidrofóbica
Filtração em gel Afinidade
Eletroforese: análise das macromoléculas