DNA Forense: Fundamentos e Aplicações

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SUMÁRIO 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
2 BREVE HISTÓRICO DO DNA FORENSE 
3 FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA MOLECULAR 
4 DNA GENÔMICO X DNA MITOCONDRIAL 34 
5 MARCADORES DE VARIAÇÃO GENÉTICA 
6 ANÁLISE DO DNA FORENSE: ASPECTOS GERAIS 
7 ESTUDO DA METODOLOGIA APLICADA À IDENTIFICAÇÃO 
HUMANA 
8 EXAME PERICIAL EM LOCAL DE CRIME 
9 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO 
10 EXTRAÇÃO DE DNA 
11 QUANTIFICAÇÃO DE DNA 
12 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO PELA POLIMERASE - PCR 
13 ELETROFORESE E DETECÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA 
14 GEL DE AGAROSE 
15 GEL DE POLIACRILAMIDA 
16 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
17 ANÁLISE DE OUTROS PERFIS GENÉTICOS 
18 CROMOSSOMO Y 
19 DNA MITOCONDRIAL 
20 CONTROLE DE QUALIDADE DOS LABORATÓRIOS 
21 CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO 
22 CONTROLE DE QUALIDADE EXTERNO: TESTES DE PROFICIÊNCIA 
EM GENÉTICA FORENSE 
 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
GLOSSÁRIO 
 
REFERÊNCIAS 
1
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
 
A identificação humana pelo estudo do perfil genético é amplamente 
utilizada em casos de caracterização de vínculo genético familiar, seja em 
processos cíveis (ex.: exclusão ou não da paternidade), como também em 
processos criminais (ex.: cadáveres e materiais biológicos encontrados na cena 
do crime). Atualmente, a mídia tem contribuído de forma significativa para a 
divulgação e popularização dessa 
tecnologia, que vem evoluindo 
sobremaneira nas últimas duas décadas. 
No entanto, algumas 
considerações sobre essa tecnologia não 
passam de mito, pois não se pode concluir 
que “o DNA resolve tudo”, mas que a 
análise do perfil genético pode auxiliar na 
identificação humana fazendo parte das 
provas periciais de um determinado caso 
criminal ou civil. 
 
Segundo Butler (2005), os testes 
de DNA para identificação humana podem 
ser utilizados para: 
 Casos forenses: análise do 
DNA do suspeito com aquele obtido da evidência biológica encontrada na cena 
do crime ou nas vítimas; 
 Teste de paternidade ou caracterização de vínculo genético 
familiar: exclusão ou não de supostos pais, filhos, mães e outros membros da 
família; 
 Desastres em massa: identificação dos fragmentos humanos e 
dos corpos encontrados em um desastre com inúmeras vítimas; 
 Investigações históricas; 
 Investigações de pessoas desaparecidas; 
2
 
 Identificação de 
militares; 
 Banco de DNA 
de criminosos ou 
de evidências 
biológicas. 
Para isso, é necessário 
que alguns conhecimentos 
sejam adquiridos para sua 
posterior realização laboratorial. 
Tais conhecimentos teóricos 
serão ensinados nesse 
conteúdo, que englobará desde 
os fundamentos básicos da 
biologia molecular até a 
elaboração de protocolos para a 
realização do estudo do DNA 
forense. 
3
 
2 BREVE HISTÓRICO DO DNA FORENSE 
 
 
Antes da utilização do DNA para identificação humana, os genes e 
suas estruturas foram estudados para outras finalidades, sendo resumidamente 
descrito a seguir: 
 1856-1863: Gregor Mendel 
 
Figura 1: Gregor Mendel 
 
 Considerado o “pai da genética moderna” 
 Estabeleceu as regras da herança genética 
 Realizou experimentos com 21.000 plantas híbridas para estabelecer o 
conceito de herança genética (Figura 2). 
 
 
4
 
 
 Figura 2: Resumo dos experimentos realizados por Mendel, com 
diversos tipos de plantas e sua herança genética, com a presença de genes 
dominantes YY e recessivos yy. 
 
 
 1900-1933: Thomas Hunt Morgan (Figura 3) 
 
 Figura 3: Thomas Hunt Morgan contribuiu para a genética moderna ao 
descobrir a herança cromossômica e a recombinação genética. 
5
 
 Descobriu a herança cromossômica (Figura 4) e a recombinação 
genética, na qual os ocorre a troca de fragmentos cromossômicos antes 
da divisão celular (Figura 5). 
 
 Figura 4: Representação esquemática dos resultados dos 
experimentos de Morgan: herança de genes ligados ao cromossomo X. 
 
 
Figura 5: Esquema ilustrativo do método de recombinação genética dos 
cromossomos. 
 1944: Avery, MacLeod e McCarty (Figura 6) 
 Atribuíram ao DNA a herança genética 
6
 
 
 Figura 6: Fotografias dos pesquisadores que estudaram a herança 
genética do DNA. 
 Grupos sanguíneos: Antes dos testes utilizando-se ácidos 
nucléicos, muitos tipos de exames sanguíneos eram utilizados para auxiliar na 
investigação de paternidade. Esses testes, baseados em diferentes sistemas 
de grupos sanguíneos ofereciam resultados de até 70 a 90%, se todos fossem 
analisados e combinados. Os grupos sanguíneos recomendados pela 
7
 
Associação Médica Americana eram os sistemas eritrocitários: ABO, Rh, MNs, 
Kell, Duffy, Kidd e o sistema sanguíneo leucocitário HLA (PAGE-BRIGHT, 
1982). 
 
 1953: James Watson e Francis Crick (Figura 7). 
 
 Descoberta da estrutura do DNA (Figuras 8 e 9) 
 
 Figura 7: Watson e Crick. 
8
 
 
 Figura 8: Fórmula química de uma cadeia simples de ácido nucléico e 
diagrama da molécula de DNA. 
 
 Figura 9: Modelo original da molécula de DNA descrita por Watson e 
Crick em 1953. 
 1985 – Alec Jeffreys (Figura 10): 
 
9
 
 
 Figura 10: Alec Jefreys em seu laboratório – a origem da análise do perfil 
de DNA. 
 
 
 DNA fingerprint ou impressão digital de DNA (Figura 10 e 11) foi 
descrito pela primeira vez por Alec Jeffreys, em 1985, e revolucionou a análise 
do DNA visando a caracterização de vínculo genético. 
A identificação das regiões polimórficas é realizada empregando-se 
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição (Restriction 
Fragment length polymorphism – RFLP), no qual o DNA é submetido à 
digestão utilizando-se enzimas de restrição específicas que cortam a dupla fita 
de DNA em regiões determinadas. Os fragmentos são separados 
eletroforeticamente, e posteriormente desnaturados, neutralizados e 
transferidos do gel de eletroforese para uma membrana de nylon, em um 
processo denominado Sourthen blotting. Mediante a presença de uma solução 
de hibridização com sondas específicas contendo fósforo radioativo, os 
fragmentos de DNA fita simples irão hibridizar e aqueles não correspondentes 
serão removidos. Após a autorradiografia, os VNTRs poderão ser visualizados 
10
 
para análise (Figura 11 e 12) (COMMITTEE ON DNA TECHNOLOGY IN 
FORENSIC SCIENCE, 1992; JEFFREYS, 1985). 
 
 
 
 Figura 11: Análise da impressão digital de DNA por Alec Jeffreys. 
11
 
 
 Figura 12: Representação esquemática da análise de Repetições 
Consecutivas de Número Variável ou VNTR. 
Desde então, algumas tecnologias foram desenvolvidas incluindo a 
análise de Repetições Consecutivas Curtas ou STRs (Edwards et al, 1991) por 
gel de poliacrilamida corados por prata (Nelleman et al, 1994) ou analisados 
por equipamentos semiautomáticos que utilizam gel de poliacrilamida e 
realizam a leitura por laser dos fragmentos amplificados pela PCR com 
iniciadores marcados com fluoróforos que emitem fluorescência (Kimpton et al, 
1993; Gill et al, 1995). 
Atualmente, a eletroforese por capilar (Pearce et al, 1993) é 
amplamente utilizada e possui o mesmo princípio que a eletroforese em gel 
analisados por laser, com a diferença de que possui capilares para a 
separação eletroforética dos fragmentos de DNA (Butler, 2005). Há também 
relatos da utilização de microchips de DNA para a análise de STRs (Radtkey et 
al, 2000; Huang et al, 2004; Divine e Allen, 2005; Bienvenue et al, 2005), 
podendo também ser um potencial para a análise futura dos STRs (Figura 13). 
12
 
 
 Figura 13: Eventos históricos no mundo e no Brasil relacionados à 
análise de DNA forense. 
 
 
O Projeto Genoma concluído agora pode identificar pelo 
sequenciamento do DNA humano a localização de genes, revelando que há 
provavelmente cerca de 20.500 genes humanos. Tal fato revelou ao mundo 
informações detalhadas sobre a estrutura, organização e funcionamento do 
conjunto completo de genes humanos. O Consórcio Internacional para 
Sequenciamento do Genoma Humano publicou o primeiro rascunhouns dos outros. Apesar de serem corridos rapidamente e 
acomodarem comparativamente grandes quantidades de DNA, géis de 
poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e 
manusear do que eletroforese capilar. Géis de poliacrilamida são corridos em 
uma configuração vertical de uma corrente elétrica constante (Sambrook et al, 
2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
95
 
 
 
 
 
 
 
14 GEL DE AGAROSE 
 
 
Géis de agarose possuem menor poder de resolução do que géis de 
poliacrilamida, mas possuem maior alcance de separação. DNAs de 50pb até 
alguns megabases em extensão podem ser separados em géis de agarose de 
diferentes concentrações e configurações. Pequenos fragmentos de DNA (50-
20000pb) são melhores resolvidos em géis de agarose corridos em 
conformação horizontal em um campo elétrico de força e direção constantes. 
Os fragmentos de DNA são comparados com marcadores de tamanho ou 
ladders ou padrões (Figura 68) (Sambrook, 2001). 
 
 
96
 
 Figura 68: Diferentes marcadores de tamanho molecular ou Ladders 
utilizados em eletroforese em gel de agarose ou até mesmo de poliacrilamida. 
 
 
No entanto, atualmente, os géis de agarose só são utilizados em DNA 
forense para a checagem do produto amplificado antes da sua eletroforese por 
capilar (Figura 69). 
 
 
 Figura 69: Gel de agarose a 2% corado por Brometo de Etídeo, 
fotografado durante exposição à luz ultravioleta, contendo um marcador de 100 
pares de bases (primeira coluna: cada banda equivale ao peso molecular de 
100 em 100 pares de bases). Os produtos de PCR de aproximadamente 220 
pares de bases são visualizados em todas as outras colunas. Na quarta coluna, 
verifica-se que não existe banda, caracterizado pela não-amplificação do 
controle negativo da PCR (que não possui DNA). 
97
 
 
De forma generalizada, cubas horizontais são utilizadas em gel de 
agarose e as verticais em gel de poliacrilamida. Sistemas para eletroforese em 
gel horizontal (Figura 70) consistem de uma caixa que é dividida em dois 
compartimentos e contém uma plataforma no meio, que servirá de suporte para 
o gel, que ficará totalmente submergido em tampão. Os eletrodos presentes em 
cada compartimento fornecerão os campos elétricos. A corrente resultante 
atravessará o gel e o tampão que circunda o gel. Com isso, a espessura do gel 
e a quantidade de tampão a ser colocada deverá ser controlada para a 
obtenção de resultados reprodutíveis. O resfriamento é promovido pelo tampão 
que circunda o gel, que fica recirculando para prevenir o desenvolvimento de 
gradiente de pH e também mantém a temperatura controlada e uniforme 
(Sambrook et al, 2001). 
 
 
 
Figura 70: Cubas de eletroforese horizontal de diferentes tamanhos. 
 
Para cada sistema de cubas e plataformas há diferentes tipos de 
pentes para a formação de poços no gel de agarose com capacidade 
volumétrica diferenciada para a deposição das amostras. De acordo com a 
quantidade de agarose colocada na plataforma, altera-se a sua altura, 
possibilitando uma maior capacidade de volume do poço (tabela 6). 
98
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 6: Capacidade de amostragem para Cuba Horizon 58 relativa à 
espessura do gel (Biometra. Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel 
Electrophoresis) 
 
 
Os cuidados para o preparo do gel de agarose estão dispostos a 
seguir: 
99
 
Protocolo de preparo do gel de agarose em cuba Horizon ® 58 (Biometra. 
Instruction Manual - Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis) 
 
1) Montar as peças do equipamento de acordo com a figura abaixo: 
 
 
Disposição dos componentes da cuba de eletroforese horizontal (Biometra. Instruction 
Manual -Horizon ® 58 Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus) 
 
 
100
 
 
 
 
2) Preparar o gel de agarose: 
 
a) Escolha a porcentagem do gel de agarose, a quantidade de solução que 
colocará na plataforma (Tabela ABAIXO); 
b) O gel de agarose 1% equivale a 1g de agarose para cada 100mL. Calcular a 
quantidade de agarose a ser pesada e volume total de tampão a ser utilizado. 
Coloque a agarose e o tampão 1x ou 0,5x em um Erlenmeyer; 
c) Pese o frasco contendo a solução e anote o valor; 
d) Dissolva a agarose em TBE por aquecimento em forno microondas ou banho 
de água quente, misturando ocasionalmente. Os cristais de agarose devem 
estar totalmente dissolvidos; 
e) Pesar o frasco novamente e acrescentar água deionizada para compensar a 
evaporação; 
f) Pipetar ou verter a quantidade desejada de solução na plataforma; 
g) Assegure que agarose foi distribuída por toda superfície e, se necessário, 
remova as bolhas; 
h) Espere que a solução esfrie até sua total solidificação. 
 
3) Eletroforese do gel de agarose: 
 
a) Adicione de 100 a 150 mL de tampão na cuba sobre o gel polimerizado; 
b) Remova cuidadosamente o pente e o vedador; 
c) Remova as bolhas que eventualmente estejam entre o tampão e o gel; 
d) Pipete as amostras cuidadosamente na parede do casulo. As amostras devem 
conter quantidade suficiente de glicerol ou sucrose para serem mais densos 
que o tampão; 
e) Feche a tampa da cuba de eletroforese; 
f) Conecte a cuba em uma fonte para eletroforese; 
g) Ligue a fonte e selecione a voltagem desejada. Pequenas bolhas formarão 
perto dos eletrodos quando a cuba está corretamente conectada; 
h) A voltagem e o tempo requeridos de acordo com o tampão utilizados estão 
dispostos na tabela abaixo. A corrente e o tempo de eletroforese variam de 
acordo com o volume de tampão, espessura do gel e voltagem aplicada. Para 
voltagens acima de 175V ocorre suficiente aquecimento do gel levando a 
desnaturar o gel de agarose. É necessário o resfriamento a 4°C da unidade 
durante a eletroforese. Géis contendo menos que 0,5 de agarose também 
devem ser resfriados durante a eletroforese por serem muito fracos. 
 
101
 
 
 
 
 
 
Tabela: Tempo de eletroforese para géis de agarose 1% a voltagem 
constante. As mensurações foram realizadas com gel submergido de 1 a 2 
mm e com corrente variando de 5 a 125mA. O tempo requerido para um 
tampão de corrida migrar 6,5cm da origem. Para o gel de 1%, o tampão 
utilizado pelo fabricante migra concomitantemente com fragmentos de DNA 
de aproximadamente 200bp em TBE 1X e 400bp em TAE 1X. 
 
4) Pós-eletroforese: 
 
a) Após desconectar os cabos da fonte de eletroforese, desconecte os 
cabos da cuba, aba a tampa e retire a plataforma contendo gel do 
tampão; 
b) Remova o gel com cuidado para a coloração; 
c) Remova o tampão da cuba e descarte-o apropriadamente, não 
reutilizando. Enxágue com água destilada; 
d) Remova qualquer tipo de resíduo de agarose das peças utilizadas e 
enxágue com água destilada. 
 
5) Coloração do gel de agarose: brometo de étídeo (Vide a seguir). 
 
102
 
Ácidos nucléicos submetidos à eletroforese através de géis de agarose 
podem ser visualizados por coloração e com luz UV a 300nm. Dois métodos 
são utilizados para essa finalidade: a coloração por brometo de etídio e por 
SYBR gold: 
O brometo de etídio é preparado como uma solução estoque de 
10mg/ml em H2O e estocado à temperatura ambiente em frascos âmbar ou 
enrolados em papel alumínio. O corante é geralmente incorporado ao gel de 
agarose e tampões eletroforéticos em concentrações de 0,5μg/ml. A vantagem 
de se acrescentar o brometo de etídio na preparação do gel é que pode-se 
examinar os fragmentos de DNA durante a corrida ou ao final dela. A 
desvantagem é a redução da mobilidade eletroforética em ~15%, além da 
maior contaminação do equipamento pelo brometo. Quando efetua-se a corrida 
na ausência do corante, DNAs com formas de platôs finos são conseguidos 
(Sharp et al. 1973; Sambrook et al, 2001). 
O brometo de etídio (Figura 71) contém grupos planares tricíclicos que 
intercalam entre as bases do DNA, com pequena ou nenhuma preferência 
sequencial. Em soluções saturadas de alta força iônica, aproximadamente uma 
molécula de etídio intercala a cada 2.5pb (Waring1965). Após inserção na 
hélice, o corante fica perpendicular ao eixo helicoidal e faz ligações de Van der 
Waals com as bases acima e abaixo (Figura 72) (Lepecq, 1966). A UV é 
absorvida pelo DNA em 254nm e transmitida para o corante; radiação a 302nm 
e 366nm é absorvida pela própria ligação ao corante. Em ambos os casos, a 
energia é retransmitida a 590nm. O brometo de etídio pode ser usado para 
detecção de RNA e DNA, mas a afinidade é maior para o DNA (Sambrook et al, 
2001). 
103
 
 
Figura 71: Estrutura molecular do brometo de etídeo com seu respectivo 
número de registro - RN. 
 
Figura 72: Estrutura molecular do DNA após intercalação do brometo de etídeo. 
 
 
O brometo de etídeo é um potente mutagênico, pode ser absorvido pela 
pele, irritante para os olhos, boca e trato respiratório superior. Deve ser 
estocado longe de agentes oxidantes em um local resfriado, seco e em 
recipiente indestrutível e fechado. Inúmeras precauções para manuseio e 
descarte devem ser realizadas para reduzir a contaminação tanto do 
pesquisador como ambiental: 
 
104
 
 
Cuidados para a manipulação e descarte do Brometo de Etídeo 
 
Equipamentos de Proteção Individual 
 
Luvas: Utilizar luvas de nitrila para prevenir contaminação das mãos. 
Luvas descartáveis (como 4, 6 ou 8 mil azul luvas de nitrila) usadas em operações 
de laboratório suprem apenas uma barreira de contato e devem ser descartadas 
imediatamente quando há suspeitas de contaminação. Luvas descartáveis não 
podem ser usadas para proteção de materiais químicos perigosos sem utilização 
de duas luvas devido ao potencial de formar buracos mínimos. Luvas de látex 
descartáveis são passíveis de apresentar defeitos e buracos mínimos e não são 
recomendadas. 
 
Óculos: Utilize óculos de proteção aos químicos com escudo lateral. 
 
Trajes de laboratório: Sempre use calças compridas, sapatos fechados e 
aventais quando manusear materiais perigosos. 
 
Procedimentos de Emergência e Primeiros Socorros: Providencie 
ajuda de primeiros socorros até que auxílio apropriado chegue ao local. 
 
Ingestão: Se a pessoa estiver consciente, lave a boca com água. Não 
induza vômito. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até que auxílio 
médico chegue. 
 
Inalação: Remova a vítima do local de exposição a um local arejado 
imediatamente. Se a respiração cessar, tenha uma pessoa qualificada que possa 
fazer respiração artificial. Mantenha a pessoa afetada aquecida e descansada até 
que auxílio médico chegue. 
 
Contato com a pele: Remova roupas contaminadas (incluindo os sapatos) 
imediatamente. Lave o local afetado com sabão e detergente suave com grande 
quantidade de água até que nenhuma evidência de químico esteja presente (pelo 
menos 10 a 20 minutos). Chame um médico se você notar irritação nos olhos ou 
no trato respiratório. 
 
Contato com os olhos: Lave os olhos imediatamente com grande 
quantidade de água ocasionalmente levantando as pálpebras inferiores e 
105
 
 
Descontaminação de substâncias tóxicas: brometo de etídio 
 
A prática de processos referentes à biossegurança é essencial para a 
manutenção da saúde das pessoas que lidam diretamente com organismos vivos 
e substâncias tóxicas para o ser humano. No caso dos microorganismos é 
fundamental o uso de fluxos laminares ou outras técnicas de contenção (como o 
do bico de Bunsen) que impeçam a sua dispersão durante a manipulação. Outra 
prática muito importante é que todos os materiais derivados de cultivos de 
microorganismos devem ser submetidos à esterilização (por exemplo, 
autoclavagem) antes de serem descartados. Por outro lado, é também importante 
eliminar ou minimizar os riscos de contaminação do ambiente, soluções, 
bancadas, equipamentos, utensílios (pinças, espátulas, etc.) ou vidrarias por 
substâncias tóxicas para o organismo humano. 
 
O processamento de substâncias com alto potencial tóxico ou mutagênico, 
como o Brometo de Etídio (EtBr), tem sido um dos grandes problemas da maioria 
dos laboratórios. O Brometo de Etídio (EtBr) é comumente utilizado nos 
laboratórios para corar ácidos nucléicos submetidos à eletroforese em gel de 
agarose ou a gradiente de Cloreto de césio. A ação do EtBr como corante se deve 
a sua capacidade de intercalar entre as bases dos ácidos nucléicos e fluorescer 
sob luz ultravioleta. Este caráter intercalante do EtBr também é responsável pelo 
seu alto potencial mutagênico, pois pode gerar alterações na estrutura do DNA as 
quais poderão ser permutadas durante o processo de duplicação. Dessa forma, a 
leitura errada das sequências de bases do DNA pode resultar em mutação. 
106
 
 
Atualmente, existem outros tipos de alternativas que estão sendo 
incorporadas ao mercado, como o SYBR gold, que é o nome comercial para 
 
Tratamento de soluções concentradas de EtBr (até 10mg/ml) 
 
Existem várias técnicas para o tratamento de descontaminação do EtBr. A mais simples e 
fácil de ser aplicada na rotina é baseada no tratamento de soluções de EtBr com Permanganato de 
Potássio em condições de acidez. Durante esse tratamento haverá oxidação do EtBr pelo 
Permanganato resultando na formação de um precipitado marrom escuro. Posteriormente, esta 
mistura é neutralizada com NaOH e descartada (Sambrook et al., 1989). O protocolo, como descrito 
em Sambrook et al. (1989) é o seguinte: adicionar, se necessário, água na solução concentrada até 
diluir a concentração de EtBr para 0,5mg/ml. 
Em seguida adicionar KMnO4 0,5M equivalente a 1 volume da solução que será 
descontaminada. Misturar cuidadosamente e, em seguida, adicionar 1 volume de HCl 2,5M. Misturar 
com atenção e deixar descansando por várias horas à temperatura ambiente. Para finalizar, 
neutralizar essa mistura adicionando 1 volume de NaOH 2,5N. Novamente misturar e a solução 
poderá ser descartada na pia sob água corrente. 
Este método de descontaminação de soluções concentradas de EtBr (10mg/ml) é capaz de 
reduzir a atividade mutagênica em até 3.000 vezes como foi descrito por Quillardet & Hofnung 
(1988). 
Obs.: No caso da água utilizada no descoramento de géis, onde existe uma baixa 
concentração de EtBr, utilizar Hipoclorito de sódio (água sanitária comercial) na proporção de 1:2, 
antes de descartar na pia. Os resíduos sólidos (géis e papéis) são secos à temperatura ambiente e 
posteriormente incinerados em forno de alta temperatura. 
 
Referências Bibliográficas: 
QUILLARDET, P.; HOFNUNG, M. Ethidium bromide and safety – readers suggest 
alternative solutions. Letter to editors. Trends in Genetics, Amsterdam, v.4, p.89, 1988. 
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 
New York: Cold Spring Harbor, 1989. 3v. 
 
107
 
um corante ultrassensível com alta afinidade pelo DNA e uma grande ligação 
fluorescente com o ácido nucléico. Esta ligação fluorescente é >1000 vezes 
maior do que para o complexo do DNA com o Brometo de Etídio (figura 73). 
Assim, 1000 vezes maior do que para 
o complexo do DNA com o Brometo de Etídio. 
 
108
 
 
 
15 GEL DE POLIACRILAMIDA 
 
 
Os géis de poliacrilamida foram muito utilizados para a análise de 
regiões polimórficasdo DNA para o exame do perfil genético em identificação 
humana. No entanto, atualmente os laboratórios utilizam a eletroforese capilar, 
como será depois apresentado e estudado. Mas para que haja melhor 
compreensão da eletroforese capilar existe a necessidade de estudarmos a 
eletroforese em gel de poliacrilamida, pois foi primordial para a sua realização 
em equipamentos contendo capilares. 
Géis de poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos 
fragmentos de DNA (5-500pb). O poder de resolução é extremamente alto e 
fragmentos de DNA que diferem em tamanho por tão pouco quanto 1pb em 
comprimento ou 0,1% de sua massa podem ser separados uns dos outros (por 
exemplo, 1pb em 1000pb). Comparado com o gel de agarose (Figura 68), a 
separação dos fragmentos menores, como de 100 em 100 pares de bases, é 
maior (Figura 74), melhorando a análise do fragmento, principalmente se 
possuem variação de poucas bases. Outras vantagens em relação aos géis de 
agarose é que eles aceitam maiores quantidades de amostra sem que haja 
perda na resolução e o DNA recuperado dos géis de poliacrilamida são 
extremamente puros e podem ser utilizados para muitas finalidades. Géis de 
poliacrilamida possuem a desvantagem de serem mais difíceis de preparar e 
manusear do que géis de agarose (Sambrook et al, 2001). 
 
109
 
 
Figura 74: Gel de poliacrilamida a 8% corado com prata contendo 
produto de PCR, cujo tamanho varia de 270 a 280 pares de bases. 
 
 
Monômeros de acrilamida são polimerizados em longas cadeias de 
uma reação iniciada por radicais livres (Raymond et al, 1959). Na presença de 
N-N’-metilenobisacrilamida, essas cadeias formam ligações cruzadas (figura 
75). A porosidade do gel resultante é determinado pelo tamanho das cadeias e 
graus de ligações cruzadas que ocorrem durante a reação de polimerização. A 
porcentagem de monômeros de acrilamida utilizados na preparação do gel são 
determinadas pelo tamanho dos fragmentos de DNA a serem analisados 
(Chramback e Rodbard, 1971; Luney et al, 1971; Holmes et al, 1991; Sambrook 
et al, 2001). 
110
 
 
 
Figura 75: Polimerização dos monômeros de acrilamida e N-N’-
metilenobisacrilamida, em longas cadeias cruzadas em uma reação iniciada 
por radicais livres pelo persulfato de amônia, na presença de N,N,N',N'-
tetramethylethylenediamine (TEMED). 
 
 
 
A porcentagem da concentração total de acrilamida mais a bis-
acrilamida é definida por T% e porcentagem de ligações cruzadas devidas a 
bis-acrilamida, por C% (Stellwagen, 1997). O aumento do valor de T diminui o 
tamanho dos poros do gel de poliacrilamida. A relação do valor de C com o 
tamanho do poro é mais complexa. Geralmente o valor mínimo do tamanho do 
poro ocorre quando C é aproximadamente 5%, como se dá em um gel com 
porcentagens de 19:1 de acrilamida e bis-acrilamida. Diminuindo o valor de C 
há um aumento da estrutura do poro porque ocorre a diminuição de ligações 
cruzadas (Tabela 7). 
 
 
111
 
Tabela 7: Utilização do gel de poliacrilamida de acordo com a sua porcentagem 
de monômeros de acrilamida e da razão acrilamida e bis-acrilamida 
(modificado de http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_id/6). 
 
 
 
 
Há diferentes tipos de gel de poliacrilamida e cada um com suas 
indicações. Géis de poliacrilamida desnaturantes são utilizados para separação 
e purificação de fragmentos de DNA de fita única. São polimerizados na 
presença de um agente (formamida ou uréia) que suprime o pareamento de 
bases em ácidos nucléicos, saturando as pontes de hidrogênio. DNAs 
desnaturados migram através desses géis em uma razão que é praticamente 
independente da composição de bases e sequência. Entre os usos da 
poliacrilamida desnaturante estão o isolamento e análise de cada fita de DNA, 
análise de produtos de digestão por nuclease S1 e análise de produtos de 
reações de sequenciamento de DNA (Sambrook et al, 2001). 
 Géis de poliacrilamida não desnaturantes são utilizados na separação 
e purificação de fragmentos de DNA de dupla-fita, não sendo utilizados, 
atualmente, para a análise do perfil genético. Entretanto, a mobilidade 
eletroforética também é afetada pela composição de bases e sequência, de 
modo que os dúplices de DNA de mesmo tamanho podem diferir na mobilidade 
em mais do que 10%. Os géis de poliacrilamida não desnaturantes são usados 
frequentemente para preparar fragmentos de DNA altamente purificados e para 
detecção de complexos de proteína-DNA (Sambrook et al, 2001). 
Razão Acrilamida: Bis Gel % DNA / RNA 
nativo (bp) 
DNA / RNA 
desnaturado 
(bp) 
Proteína (kd) 
19: 1 4 100-1500 70-500 100-200 
 6 60-600 40-400 40-150 
 8 40-500 20-200 20-100 
 10 30-300 15-150 15-70 
 12 20-150 10-100 8-60 
20:1 5 200-2000 70-800 >150 
 6 80-800 50-500 50-200 
 8 60-400 30-300 30-125 
 10 50-300 20-200 20-100 
 12 40-200 15-125 10-70 
 20Cianol e, corridos em tampão TBE 0,5X, cruza 
aproximadamente na mesma velocidade de DNA de dupla-fita de 300pb em 
comprimento, enquanto o xileno cianol percorre aproximadamente na mesma 
velocidade do DNA de dupla-fita de 4kb em extensão. Esta relação não muda 
muito para géis de agarose de porcentagem entre 0.5% a 1.4% (Sambrook et 
al, 2001). 
 
Tabela 10: Tipos de tampão de corrida para eletroforese (Sambrook et al, 
2001) 
 
 
A eletroforese capilar é amplamente utilizada em análise de DNA 
forense, por permitir que grandes quantidades de amostras sejam analisadas 
de maneira automatizada, além de necessitar de poucas quantidades de 
amostra para o processo de injeção e podem ser facilmente reinjetadas, se 
necessário. Separação eletroforética em capilar é realizada em menos de 1 
hora, se comparado com as muitas horas necessárias para àquela realizada 
em géis de poliacrilamida para identificação humana. Além do tempo, a 
quantidade de passos para a elaboração do gel de acrilamida fazem com que 
Tipo do Tampão Tampão 6X Temperatura de Estocagem
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
40%(p/v) sucrose em água
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
15% Ficoll (tipo 400; Pharmacia) em água
0,25% azul de bromofenol
0,25% xileno cianol FF
30% glicerol em água
0,25% azul de bromofenol
40%(p/v) sucrose em água
IV
4° C
temperatura ambiente
4°C
4° C
I
II
III
115
 
possa haver uma chance maior de erro durante a manipulação. A desvantagem 
é o custo inicial para a compra dos equipamentos, sendo bem mais alta do que 
aqueles empregados na eletroforese em gel de poliacrilamida. No entanto, a 
eletroforese capilar é a mais empregada nos laboratórios de DNA forense 
(Butler, 2005) (Figura 78 e 79). 
 
 
 Figura 78: Esquema representativo de eletroforese capilar: o capilar 
é um tubo de fibra de vidro com aproximadamente 50 μm em diâmetro e é 
completado com uma solução de polímero viscoso específico para tal 
finalidade, que funciona como o gel das eletroforeses descritas anteriormente. 
As amostras são colocadas em uma bandeja e injetadas para o capilar 
aplicando-se uma voltagem de cerca de 15000 volts, que separará o DNA em 
poucos minutos. Os fragmentos de PCR com fluoróforos são analisados assim 
que passam pela janela de detecção e são excitados por um laser específico. 
Os dados são automaticamente computadorizados e permitem um 
armazenamento e rápida análise. 
116
 
 
Figura 79: Manipulação do sequenciador automático, que possui o sistema de 
eletroforese capilar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
117
 
16 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 
 
 
Após a visualização, dá-se a análise dos resultados comparando os 
fragmentos de DNA amplificados das amostras do pai, mãe e filho em caso de 
paternidade; ou das amostras encontradas na cena do crime, em corpos ou 
vítimas com as de suspeitos (INTERPOL, 2001; BUTLER, 2005). No entanto, 
durante a PCR, um grande número de artefatos pode ocorrer e interferir na 
interpretação e genotipagem dos alelos presentes na amostra de DNA, sendo 
visualizadas somente após a eletroforese. 
Entre esses artefatos (Figura 80) incluem: 
 
 os produtos stutters (WALSH et al, 1996) 
 adição de nucleotídeos não pertencentes ao DNA alvo, 
denominados picos “N” – N peaks – ou adenilação (CLARCK, 1988; 
Clayton et al, 1998). 
 
 
 
 Figura 80: Artefatos de técnica que podem prejudicar a análise dos 
alelos após a eletroforese: stutters e picos N. 
 
 
 
118
 
 Produtos de stutters (Figura 81): 
o Definição: Picos que se caracterizam pela perda de uma 
repetição consecutiva em relação ao alelo verdadeiro, 
resultante de um “deslizamento” da sequência durante a 
síntese de DNA, isto é, durante a amplificação. A enzima 
polimerase não amplifica uma sequência, aparentando 
um deslizamento. 
o Os picos de stutters dificultam a análise de misturas de 
DNA. 
 
 Adição de nucleotídeos que não fazem parte da sequência de DNA - 
Picos N ou adenilação (Figura 82): 
o Definição: A enzima Taq polimerase frequentemente 
adiciona um nucleotídeo extra no final do produto de 
PCR, sendo o mais frequente a Adenina (A), 
denominando-se ADENILAÇÃO. 
o Excesso de amostra de DNA na PCR pode resultar em 
uma incompleta adenilação. 
 
 
 
Figura 81: Definição de stutter e seus dois tipos. Verifique o “deslizamento” de 
uma sequência repetitiva. 
119
 
 
 Figura 82: Adição de nucleotídeos que não fazem parte da 
sequência de DNA: durante uma PCR, a enzima taq polimerase pode 
acrescentar uma adenina (A) na porção 5´ da dupla fita de DNA que está em 
excesso na reação. Esse artefato resulta na adenilação, que aparece no 
eletroferograma como dois picos bem próximos um do outro sendo um A- e 
outro A+, que correspondem às fitas da sequência de DNA. O eletroferograma 
em azul mostra a diferença no resultado quando se utiliza uma grande 
quantidade de DNA para a sua amplificação, resultando após a eletroforese em 
adenilação (para os STRs DES1358 e VWA) e picos fora da escala - off-scale 
(para o STR FGA). 
 
 
120
 
Outros fatores podem estar presentes na análise da STR e devem ser 
criteriosamente analisados, para serem diferenciados de artefatos. Segundo 
Butler (2005), são eles: 
 
 microvariações alélicas (Figura 83 e 84) 
 
 
 
 Figura 83: Microvariação alélica: variações da sequência repetitiva 
que não fazem parte dos alelos incorporados no marcador alélico (allelic 
ladder), sendo que eles podem ou não estar descritos na literatura. A 
eletroforese do fragmento correspondente a um STR denominado DYS635, é 
comparado pelo programa automaticamente com o marcador ou padrão alélico 
acima, que possui diversos alelos para o mesmo STR. Verifique que o alelo da 
amostra 1 não está exatamente abaixo do alelo 22, que corresponde a 258 
pares de bases e sim a 257, que significa que existe uma base a menos na 
sequência, que poderá ser analisada no encadeamento. Após o 
sequenciamento do DNA (caixa amarela), observa-se a falta de uma timina (T) 
121
 
na sequência total (vide abaixo da figura a sequência completa, sendo que 
[TCTA]4 é igual a TCTA TCTA TCTA TCTA; e assim por diante). 
 
 
 Figura 84: Quantidade de microvariações alélicas descritas para 
cada STR, sendo que existem, no total, 476 variantes descritas em todos os 
STRs dispostos no quadro. Entre parênteses encontra-se a quantidade de 
microvariações alélicas de cada STR. Exemplo: CSF1PO(19) – para o STR 
denominado CSF1PO tem-se 19 microvariações alélicas descritas 
mundialmente. Dados atualizados pelo site até 06 de outubro de 2008. 
 
 
 padrão tri-alélico (Figura 85 e 86) 
 
122
 
 
 Figura 85: Característica do trialelo das STRs D18S51 (alelos 14, 15 
e 22), TPOX (alelos 8, 10 e 11) e D21S11(alelos 29, 30 e 31). 
 
 
 
 Figura 86: Quantidade de TRIALELOS descritos para cada STR, 
sendo que existem, no total, 177 padrões trialélicos diferentes descritos em 
todos os STRs dispostos no quadro. Entre parênteses encontra-se a 
quantidade de trialelos de cada STR. Exemplo: CSF1PO(7) – para o STR 
denominado CSF1PO tem-se 7 trialelos diferentes descritos mundialmente. 
Dados atualizados pelo site até 23 de outubro de 2008 pelo site STRBase. 
 
123
 
 perda de um alelo (Figura 87 e 88): 
 
 
 
Figura 87: Perda de alelo caracterizado pela pouca quantidade de amostra de 
DNA na reação de PCR. 
 
124
 
 
 
Figura 88: Perda do alelo decorrente da presença de mutação na 
sequência do DNA, que estão localizadas em regiões que hibridizam com os 
primers durante a PCR. 
 mutações (Figura 89): 
o Ocorre aproximadamente 1 em 1000 meioses; 
o Incide mais frequentemente com o alelo paterno do que 
materno; 
o VWA, FGA eD18S51 possuem altas taxas; 
o TH01, TPOX e D16S539 possuem menores taxas. 
 
125
 
 
 
Figura 89: Mutação observada em um trio (mãe, pai e filho): observe a 
ausência do alelo paternoobrigatório do caso à direita, na qual não há o alelo 
14 ou 18 e sim um alelo diferente 13. 
 
126
 
 
 
Figura 89: Lista de STRs e taxa de mutação. A mutação dos STRs 
utilizados em identificação humana é baixa. No entanto, deverá ser analisada, 
principalmente se ocorrer em testes de paternidade, devendo ser incorporada 
ao laudo pericial a taxa de mutação. 
Havendo uma correlação entre as amostras, verifica-se a significância 
do resultado. A importância da evidência de DNA é dada por meio da 
127
 
probabilidade de que a casualidade tenha ocorrido. Para isso, tem-se 
antecipadamente a frequência dos perfis genéticos de uma população (Figura 
90). Caso o perfil genético seja extremamente raro em uma dada população, 
pode-se dizer que a evidência é extremamente forte, caso contrário, pode 
consistir em uma mera casualidade. A constância de um perfil genético em 
uma determinada população é calculada com base na multiplicação das 
frequências do genótipo de cada locus (EVETT & WEIR, 1998). 
 
 
 
 
 
 
Decidir o número 
de amostras e 
grupos étnicos - no 
mínimo 100 
pessoas distintas e 
sem vínculo familiar
Analisar o perfil 
genético das 
amostras e 
determinar a 
frequência 
alélica de cada 
locus
Realizar testes 
estatísticos para 
analisar os dados
Comparação entre 
os grupos étnicos
Utilização do 
banco de 
dados para 
estimar a 
frequência do 
perfil genético 
individual
128
 
 
 Figura 90: Quadrado de Punnett mostrando a frequencia de dois alelos 
“A” e “a”, para “p” frequência do alelo “A” e q, de “a”. Lembrando que a soma de 
p e q deve ser sempre 1. A frequência de cada combinação alélica será 
calculada pela fórmula 2pq para heterozigotos e p2, para homozigotos. 
 
 
A constância do perfil genético de cada indivíduo foi calculada com 
base na razão de verossimilhança ou Likelihood Ratio (LR) (Evett & Weir 1998) 
(Figura 91). A seguir foram colocados exemplos de cálculos de perfil genético 
para treino e fixação. É conveniente lembrar que no exemplo inserimos 
somente 3 loci e não os 13 recomendados pelo FBI; somente para servir de 
exemplo, facilitar o entendimento e compreensão acerca da importância de se 
estabelecer a frequência alélica populacional. 
 
 
129
 
 
 
LR = 1/P 
 
P é frequência do perfil genético de um indivíduo, calculada a partir da multiplicação 
das constâncias alélicas de N locus: 
P= P1.P2.P3.PN, 
 
A frequência para cada locus PN, sendo “i” e “j” alelos de um genótipo cujas 
constâncias alélicas “q” que são determinadas previamente, é calculada: 
PN = qi
2, para i=j 
PN = 2qiqj, para ij 
 
 
Figura 91: Demonstração do cálculo da frequência do perfil genético 
 
130
 
EXEMPLOS DE CÁLCULOS DE PERFIL DE DNA UTILIZANDO-SE COMO 
EXEMPLO DUAS POPULAÇÕES DISTINTAS 
 
BASEADO NA FREQUENCIA ALÉLICA DE CAUCASIANOS AMERICANOS 
Perfil de DNA Frequência alélica do 
banco de dados 
Fórmula Frequência 
Locus Alelos Vezes que o 
alelo foi 
observado 
Tamanho 
do banco 
de dados 
Frequência 
D13S317 11 
14 
205 
29 
604 p = 0,34 
q = 0,05 
2pq 0,03 
TH01 6 
6 
140 604 p = 0,23 
 
p
2
 0,05 
D18S51 14 
16 
83 
84 
604 p = 0,14 
q = 0,14 
2pq 0,04 
 
Frequência do perfil para a população caucasiana = razão de verossimilhança (LR) = 1/P 
P é a multiplicação de todas as frequências alélicas = 0,03 x 0,05 x 0,04 = 0,00006 
OU 
LR = 1/0,00006 = 1 em 16666 
Pode-se dizer que o perfil genético em questão pode ser encontrado em 1 em 16666 
pessoas dentro da população de caucasianos americanos 
 
BASEADO NA FREQUENCIA ALÉLICA DE HISPÂNICOS AMERICANOS 
Perfil de DNA Frequência alélica do 
banco de dados 
Fórmula Frequência 
Locus Alelos Vezes que o 
alelo foi 
observado 
Tamanho 
do banco 
de dados 
Frequência 
D13S317 11 
14 
66 
13 
280 p = 0,24 
q = 0,05 
2pq 0,02 
TH01 6 
6 
60 280 p = 0,21 
 
p
2
 0,04 
D18S51 14 
16 
39 
38 
280 p = 0,14 
q = 0,14 
2pq 0,04 
 
Frequência do perfil para a população caucasiana = razão de verossimilhança (LR) = 1/P 
P é a multiplicação de todas as frequências alélicas = 0,02 x 0,04 x 0,04 = 0,000032 
OU 
LR = 1/0,000032= 1 em 31250 
Pode-se dizer que o perfil genético em questão pode ser encontrado em 1 em 31250 
pessoas dentro da população de hispânicos americanos 
 
 
 
Variações nos alelos dos loci mais utilizados na identificação humana 
já foram descritas nas diversas populações (RUITBERG et al, 2001; BUTLER, 
131
 
2005). Entretanto, a determinação da frequência genética em um grupo étnico 
pode estar sujeita a divergências, principalmente na população brasileira, que é 
fruto de uma grande miscigenação (MOURA-NETO & BUDOWLE et al, 1997; 
SOARES-VIEIRA et al. 2000,2001 ). 
Whittle et al (2004) analisou a frequência alélica de 19 STRs distintas 
utilizando o perfil genético de 13.000 indivíduos brasileiros. Constatou que a 
frequência da presença de perda de alelos e da taxa de mutação observada 
podem contribuir significativamente para a discriminação genética dessa 
população. 
Pimenta et al (2006) avaliaram 12 STRs de 752 indivíduos de São 
Paulo que foram divididos em categorias de cor de pele e analisando os dados 
não houve diferenciação genética significativa entre os três grupos. Esse 
resultado alerta o perigo em classificar a população brasileira pela cor de pele 
com seu ancestral geográfico (PENA, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
132
 
 
 
17 Análise de Outros Perfis Genéticos 
 
 
Dependendo do tipo e finalidade de análise do perfil genético de um 
indivíduo, além dos STRs descritos anteriormente, alguns outros marcadores 
são utilizados para a investigação do DNA forense (Figura 92): 
 DNA do cromossomo Y: linhagem paterna 
 DNA mitocondrial: linhagem materna 
 SNPs (Polimorfismos de base única): são necessários pelo 
menos 50 SNPs diferentes para a análise do perfil genético de 
uma pessoa. 
 
 
 Figura 92: Diferença entre os STRs (por exemplo, aqueles 
recomendados pelo CODIS-FBI), que são autossômicos; os STRs do 
cromossomo Y, que são herdados somente para os filhos do sexo masculino; e 
do DNA mitocondrial, que são herdados pela mãe e repassados aos filhos, 
sendo idênticos entre parentes da linhagem materna. 
133
 
 
 
 
18 CROMOSSOMO Y 
 
 
Segundo Butler (2005), os STRs do cromossomo Y são utilizados: 
 Verificação da linhagem paterna, para analisar migrações 
populacionais, pois são transmitidos de pai para filho sem alteração, a não ser 
em casos específicos de mutação; 
 Pesquisa histórica e genealógica da linhagem paterna; 
 Análise do perfil genético em testes de paternidade, aumentando 
o poder de discriminação, principalmente quando o DNA do pai biológico não é 
obtido; 
 Em casos de estupro, no qual existe vestígio biológico masculino 
para a análise de DNA em um corpo do sexo feminino; 
 Verificação de contaminação da amostra biológica por DNA do 
sexo masculino. 
 
No entanto, existem algumas considerações na sua utilização: 
 Uma combinação entre o perfil genético da evidência e do 
suspeito significará que qualquer parente do sexo masculino da linhagem 
paterna, como tios, primos, avôs, irmãos, etc possam ter contribuído com a 
amostra biológica; 
 A presença de parentes do sexo masculino em acidentes em 
massa pode ser facilmente analisada pelo cromossomo Y (Figura 93). 
134
 
 
 
 Figura 93: O DNA do cromossomo Y poderá auxiliar na identificação de 
pessoas desaparecidas que possuem parentesco de linhagem paterna. 
 
135
 
Diversos STRs do cromossomo Y já foram estudados, conforme 
demonstra a figura 94 e tabela 11. Tais STRs do Y já foram incorporados em 
dois kits comerciais: PowerPlex Y (Figura 95) e Y-filer (Figura 96). 
 
 
 
 Figura 94: Diversos STRs, segundo sua localização no cromossomo Y. 
 
136
 
Tabela 11: STRs do cromossomo Y, segundo seu acesso no GenBank , a 
sequência de repetição, seus alelos e otamanho do fragmento de PCR. Fonte: 
Butler (2005). 
 
 
Nome do 
marcador 
Acesso ao 
GenBank 
Repetição Alelos Tamanho do 
produto de PCR 
DYS19 X77751 TAGA 8-16 178-210 bp 
DYS385 Z93950 GAAA 10-22 252-300 bp 
DYS388 G09695 ATT 12-17 128-143 bp 
DYS389 I 
DYS389 II 
G09600 
G09600 
(TCTG) (TCTA) 
(TCTG) (TCTA) 
I: 7-13 
II:23-31 
239-263 bp 
353-385 bp 
DYS390 G09611 (TCTA) (TCTG) 18-27 191-227 bp 
DYS391 G09613 TCTA 8-13 275-295 bp 
DYS392 G09867 TAT 7-16 236-263 bp 
DYS393 G09601 AGAT 9-15 108-132 bp 
YCAIII AC006370 CA 19-25 192-204 bp 
DYS434 AC002992 ATCT 8-11 110-122 bp 
DYS435 AC002992 TGGA 9-13 210-228 bp 
DYS436 AC005820 GTT 10-15 128-143 bp 
DYS437 AC002992 TCTA 8-11 186-202 bp 
DYS438 AC002531 TTTTC 6-12 203-233 bp 
DYS439 AC002992 AGAT 9-14 238-258 bp 
Y-GATA-A4 G42670 AGAT 11-14 242-254 bp 
Y-GATA-A7.1 G42675 ATAG 7-12 161-181 bp 
Y-GATA-A7.2 G42671 TAGA 8-12 174-190 bp 
Y-GATA-A8 G42672 TCTA 8-14 219-244 bp 
Y-GATA-A10 G42674 TATC 11-14 160-172 bp 
Y-GATA-C4 G42673 TATC 11-16 251-271 bp 
Y-GATA-H4 G42676 TAGA 10-13 362-370 bp 
 
137
 
 
 
 Figura 95: STRs do cromossomo Y contidos no kit multiplex PowerPlex 
Y®, da Promega Corporation, segundo sua região de amplificação e cor de 
fluorescência. 
 
138
 
 
 Figura 96: STRs do cromossomo Y contidos no kit multiplex 
AmpFlSTR® Y-Filer™ da Applied Biosystems, segundo sua região de 
amplificação e cor de fluorescência. 
 
 
No Brasil, frequências alélicas dos STRs do cromossomo Y foram 
realizados para o cálculo do perfil genético. Góis et al (2007) analisou 12 STRs 
do cromossomo Y incluídos no sistema PowerPlex® Y (Promega). A 
diversidade genética dessas STRs foi de 0,6746 e a diversidade haplotípica 
0,9996. A comparação entre os resultados obtidos demonstrou que a variação 
dentro de cada grupo é maior que a variação entre os grupos. 
 
 
 
139
 
19 DNA MITOCONDRIAL 
 
 
O DNA mitocondrial teve suas características descritas no conteúdo 2 
desse conteúdo, mas será exposta a metodologia de análise da sua sequência. 
 
O DNA mitocondrial é utilizado para (Butler, 2005): 
 Verificação da linhagem materna, para analisar migrações 
populacionais, pois são transmitidos pela mãe a todos os filhos; 
 Pesquisa histórica e genealógica da linhagem materna; 
 Análise do perfil genético em testes de caracterização de vínculo 
genético, aumentando o poder de discriminação, principalmente 
quando o DNA do pai biológico não é obtido, e sim de parentes da 
linhagem materna; 
 Análise de materiais degradados e em ínfima quantidade, como 
múmias, ossadas e material arqueológico, pois o DNA mitocondrial, 
por ser circular, conserva-se melhor do que o DNA genômico. 
 
O mtDNA foi sequenciado pela primeira vez por Anderson et al (1981), 
que tornou-se a referência durante muito tempo, sendo denominada sequência 
de Anderson ou de Cambridge (Figura 97). Atualmente, utiliza-se a fita leve do 
mtDNA, que possui menor peso molecular ao ser comparado com a fita 
pesada, da sequência de Anderson ou Cambridge. A fita pesada ainda possui 
uma quantidade maior de guanina (Butler, 2005). 
140
 
 
Figura 97: Sequencia de referência das regiões HV1 e HV2 do mtDNA. 
 
 
O mtDNA possui polimorfismos de base única ou SNPs que variam de 
indivíduo para outro, sendo necessário o sequenciamento de toda a região a 
ser analisada. Para a reação de sequenciamento é necessário: 
141
 
 
 
 
Com isso, iremos abranger um pouco mais sobre a análise da 
sequência de mtDNA, após a realização da PCR. A próxima etapa é a 
purificação do produto de PCR, para a remoção de nucleotídeos não 
incorporados, primers, enzima polimerase, tampão e outros reagentes 
presentes na PCR que possam interferir na reação de sequenciamento. 
Usualmente, realizam-se purificações a base de etanol e álcool isopropílico, 
permitindo que todo produto de PCR seja precipitado e totalmente utilizado na 
reação de sequenciamento (Butler, 2005). 
A reação de sequenciamento é uma reação de amplificação de 
fragmentos de DNA que correspondem à fita sense ou antissense 
separadamente, ao contrário da PCR. Para tal finalidade, além dos dNTPs 
utilizados na PCR, utilizam-se didesoxirribonucleotídeos (ddNTPs) que não 
permitem a incorporação de outros nucleotídeos, como demonstra a figura 98: 
Extração de DNA
Quantificação do DNA
PCR
Purificação do produto de PCR
Reação de sequenciamento
Eletroforese capilar
Análise dos resultados
142
 
 
 Figura 98: processo de seqüenciamento do DNA com ddNTPs 
marcados com fluoróforos. 
 
 
As sequências posteriormente são alinhadas e analisadas em 
programas específicos, como BioEdit 
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), comparando-as com a 
sequência referência de Anderson (Figura 99). Pode também ocorrer 
heteroplasmias que é a presença de mais de um tipo de mtDNA em um único 
indivíduo (Figura 100). Duas ou mais populações de mtDNA podem estar 
presentes em um único indivíduo, seja em diferentes tecidos, regiões do corpo 
e idades. Com isso, é necessário ter cautela ao analisar uma sequência de 
mtDNA encontrada em amostra referência e evidências forenses. 
 
143
 
 
 Figura 99: Alinhamento de duas sequências de mtDNA de pessoas 
distintas (A e B) comparadas com a sequência referência, demonstrando a 
posição da variação e sua nomenclatura. 
 
 
 Figura 100: Heteroplasmia encontrada na posição 16093 contendo o 
nucleotídeo T (vermelho) e C(azul), que é representado pela letra “Y” no 
eletroferograma. 
 
 
 
144
 
20 CONTROLE DE QUALIDADE DOS LABORATÓRIOS 
 
 
O FBI acrescenta alguns itens para o controle de qualidade dos 
laboratórios que trabalham com evidências de DNA forense, que inclui além 
desses cuidados a realização de periódicos testes de proficiência (a cada 180 
dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de qualidade. O teste 
de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e para identificar tópicos 
que devem ser aperfeiçoados, e a auditoria para averiguar a qualidade das 
atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 2000). 
O grupo espanhol e português da Sociedade Internacional de Genética 
Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for Forensic 
Genetics), objetivando a padronização das metodologias aplicadas e o controle 
de qualidade, realiza testes anuais de controle e de proficiência inclusive para 
laboratórios brasileiros credenciados. Esses testes consistem na análise de 
amostras de sangue e outro fluido biológico que simulam um caso forense para 
a manutenção da qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 2000). 
No teste de vínculo genético familiar, a quantidade de amostra coletada 
normalmente é previsível e constante, não havendo muitos problemas com sua 
quantidade e qualidade. Entretanto, há materiais biológicos utilizados nestes 
testes que são coletados post-mortem oriundos de corpos exumados ou 
putrefeitos. Nesse caso, o material predominante está degradado da mesma 
maneira que as evidências de material biológico encontrado na cena do crime. 
O produto obtido de provas forenses é único e muitas vezes a garantia de sua 
qualidade só é adquirida através de alguma forma de controle independente e 
indireto (FBI, 2001, INTERPOL, 2001). 
Controles de qualidade internos e externos servem para esse 
propósito. Os laboratórios forenses podem utilizar como controle interno, 
padrões reconhecidos e devidamente testados para tal finalidade. Controles 
externos devem ser introduzidos por programas administrados por 
organizações certificadas, que, inicialmente, preparam padrões de espécimes 
conhecidas, como sangue, e envia para todos os laboratórios credenciados. A 
metodologia utilizada e os respectivos resultados devem ser informados para o 
145
 
comitê, que analisará os dados e avaliará as alterações entre os laboratórios 
(THOMPSON, 1974; KLOOSTERMAN, 2001;BLICK & PASSEY, 2003). 
21 CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO 
 
 
Ao analisar uma amostra biológica destinada à caracterização de 
vínculo genético, seja familiar ou em casos forenses, quaisquer contaminações 
com DNA estranho ou metodologias inadequadamente aplicadas podem 
resultar na impossibilidade de obter o DNA para amplificação, o não 
estabelecimento dos perfis genéticos e na inutilização da amostra. A primeira 
preocupação no estudo do perfil genético para a identificação humana é avaliar 
o quanto as metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, 
assim como seus princípios. Para assegurar resultados, um programa de 
controle de qualidade é fundamental para os laboratórios que realizam 
identificação humana pelo DNA. Todas as metodologias de análise de DNA 
forense devem ser submetidas à validação para assegurar a reprodutibilidade e 
a robustez da técnica (KLOSTERMAN, 2001). 
Procedimentos inadequados que levem à contaminação de amostras 
pelos investigadores e os profissionais do laboratório podem resultar em uma 
incorreta interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e 
cumprimento de normas e procedimentos de boas práticas de laboratórios são 
imprescindíveis, assim como treinamentos específicos para o exame de DNA 
tornaram-se obrigatórios (NEUMAYER, 1998; INTERPOL, 2001). 
Desde 1992, a ISFH faz recomendações para a análise de DNA pela 
PCR. A contaminação pode ser evitada atendendo a certos cuidados durante 
todo o processo de análise de DNA. Eles vão desde a coleta e armazenamento 
do material biológico do qual será extraído o DNA até o próprio local de 
preparação da PCR (ISFG, 1992). 
A preservação do DNA para a amplificação pela PCR também envolve 
o controle da temperatura, da umidade, o valor do pH (BENDER, 2004), a 
presença de ácido húmico e fúlvico e microorganismos. A temperatura baixa 
pode preservar o DNA, seja ele datado de milhares de anos, ou de amostras 
forenses, assim como o DNA pode ser mais bem preservado em ambientes 
secos e com o mínimo crescimento de microorganismos. A presença de ácido 
146
 
fúlvico e húmico inibe a enzima Taq DNA polimerase. O pH neutro ou 
levemente alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os 
microorganismos em grande quantidade podem degradar o DNA por completo 
(BURGER et al., 1999). 
O FBI e a INTERPOL estabeleceram normas para os laboratórios 
forenses que participam da construção dos bancos de DNA internacional. 
Relacionam-se, principalmente, com procedimentos de coleta de amostras 
biológicas para análise do DNA que podem ser consideradas evidências, assim 
como vários aspectos importantes para o treinamento técnico. No Brasil, a 
Secretaria de Segurança Pública do Estado de São Paulo e a Secretaria 
Nacional de Segurança Pública – SENASP elaboraram documentos na 
tentativa de padronizar métodos e cuidados de coleta e manutenção das 
amostras pelos peritos criminais. 
Sucintamente, a coleta do material deve ser realizada em condições 
assépticas e o indivíduo responsável pela coleta estar devidamente 
paramentado para se evitar contaminação em ambos os sentidos, como, por 
exemplo, utilização de hastes com algodão, tubos, frascos e envelopes 
plásticos ou de papel. Para a coleta de amostras biológicas umedecidas é 
aconselhável a posterior secagem em ambiente estéril para o seu 
acondicionamento. No entanto, se isso não for possível, transporta-se 
imediatamente para o laboratório e congela-se a -20°C, no mínimo (SÃO 
PAULO, 1999; FBI, 1999 e 2001; INTERPOL, 2001; SENASP, 2006). Não se 
deve descongelar e congelar as amostras repetidamente, pois causaria a 
degradação do DNA. 
A escolha de métodos de extração de DNA está relacionada ao tipo de 
material e é importante para que se obtenha sucesso no estudo das STRs. 
Dessa maneira, cada laboratório deve realizar testes e otimizações de técnicas 
específicas para cada tipo de amostra forense (FBI, 2001; INTERPOL 2001; 
BUTLER, 2005; BONACCORSO, 2005). Em 1996, a maioria dos laboratórios 
entrevistados por uma filial da Sociedade Internacional de Genética Forense 
(53%) realiza a purificação do DNA pelo método orgânico (67%) seguido por 
não orgânico (33%). 
Hoff-Olsen et al (1999) avaliaram cinco métodos de extração de DNA 
de tecidos humanos em estado de decomposição, que normalmente 
147
 
encontram-se altamente degradados, para análise das STRs. Os métodos 
empregados foram: extração orgânica com fenol-clorofórmio, sílica, filtro de 
fibra de vidro, Insta Gene Matrix™ e Chelex. O método da sílica, além de ser 
mais econômico, obteve melhores resultados ao comparar com método fenol-
clorofórmio e resultou em um perfil genético completo em 90% dos casos 
contra 60%. Isso torna a sílica o método mais indicado pelos autores para a 
extração de DNA de amostras degradadas. O método de Chelex não foi 
satisfatório para dentes, demonstrando que ele deve ser indicado 
principalmente para saliva, como descreveu Sweet et al. Em casos como esse, 
emprega-se controle positivo constituído de amostra conhecida, para verificar 
se o método foi eficaz (FBI, 2001; INTERPOL, 2001). 
Kwok & Higuchi (1989) e Neumaier (1998) descreveram várias 
recomendações para assegurar a qualidade dos métodos de biologia molecular 
em diagnósticos clínicos referentes às fases pré-analíticas e analíticas, 
principalmente para a realização da PCR. Objetivando evitar a contaminação 
das amostras, recomenda-se o isolamento físico da área de preparação da 
PCR, de seus reagentes e todos os materiais descartáveis utilizados na reação 
que devem ser previamente esterilizados. Outros cuidados são fundamentais: 
os reagentes devem ser aliquotados; a utilização de luvas descartáveis é 
obrigatória e devem ser constantemente trocadas; deve-se ter cuidado ao abrir 
os tubos, pois parte do produto da PCR pode estar na sua tampa, 
possibilitando o seu desperdício; a mistura dos reagentes da PCR deve ser 
feita em um único tubo para posteriormente aliquotá-los em tubos individuais; 
deve-se adicionar o DNA individualmente em cada tubo e, finalmente, a 
inclusão obrigatória de controles negativos e positivos que auxiliam na 
detecção de contaminantes. 
Atualmente utiliza-se a linhagem de célula comercial K562 como 
controle positivo (BJERRE et al, 1997; FBI, 2001; INTERPOL, 2001) ou uma 
amostra de DNA previamente validada pelo próprio laboratório ou 
externamente, como ocorre em kits de identificação humana (LAFOUNTAIN et 
al, 2001; KRENKE et al, 2002; LEVEDAKOU et al, 2002; SCHLENK et al, 
2004). Com o intuito de unificar os loci a serem utilizados em identificação 
humana para a incorporação de perfis genéticos de criminosos em seu banco 
de dados (CODIS), o FBI indicou a utilização de 13 loci para a sua análise; a 
148
 
saber, CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, 
D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, e D21S11 (BUDOWLE & MORETTI, 
1999) (Tabela 12). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 12 – Informação das 13 STRs recomendadas pelo CODIS. 
 
Nome do 
Locus 
Localização no 
cromossomo 
Unidade 
de 
repetição 
Acesso de 
GenBank 
Variação 
dos 
alelos 
Número de 
alelos 
observados 
CSF1PO 5q33.1 
c-fms pronto-
oncogene, 
6° intron 
TAGA X14720 6-16 15 
FGA 4q31.3 
fibrinogênio 
3° intron 
CTTT M64982 15-51,2 69 
TH01 11p15.5 
Tirosina 
hidroxilase 
1° intron 
TC|AT D00269 3-14 20 
TPOX 2p25.3 
Tiróide peroxidase 
10° intron 
GAAT M68651 6-13 10 
VWA 12p13.31 
von Willebrand 
factor 
[TCTG] 
[TCTA] 
M25858 10-24 28 
149
 
40° intron 
D3S1358 3q21.31 [TCTG] 
[TCTA] 
NT_00599
7 
9-20 20 
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10 
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22 
D8S1179 8q24.13 [TCTA] 
[TCTG] 
G08710 8-19 13 
D13S317 13q31.1 TATC G09017 5-15 14 
D16S539 16q24.1 GATA G07925 5-15 10 
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43 
D21S11 21q21.1 [TCTA] 
[TCTG] 
complexo 
AP000433 24-38 70Esse conjunto de loci tornou-se referência para todos os países no que 
se refere à ciência forense (SUN et al, 2003). Essa normatização permitiu 
estudos de frequências alélicas populacionais comparativas mais adequadas, 
possibilitando a universalização dos dados genéticos com critérios 
homogêneos. Com o objetivo futuro de implantar um banco de perfis genéticos 
de criminosos como o CODIS, o governo federal brasileiro já adotou as STRs 
sugeridas pelo CODIS como referência em seu Manual de Padronização de 
Exames de DNA em Perícias Criminais (SECRETARIA NACIONAL DE 
SEGURANÇA PÚBLICA - SENASP, 2005). 
Esses loci contêm repetições bem caracterizadas que podem ser 
facilmente determinados com uso de uma referência de tamanho de fragmento 
de DNA. As vantagens da utilização de marcadores de tamanho em análise de 
DNA têm sido observadas desde o início das análises de VNTRs (WYMAN & 
WHITE, 1980). 
A reprodutibilidade do método de detecção é confirmada observando a 
intensidade dos fragmentos do marcador podendo fornecer informações 
relativas à possível variação linha a linha na migração eletroforética de um 
mesmo material. O marcador é aplicado em linhas dispostas em regiões 
distintas, destinado a abranger uma maior região do gel. A separação 
150
 
eletroforética depende não somente do tamanho dos fragmentos, mas também 
da sequência do nucleotídeo (FRANK & KOSTER, 1979). Dessa maneira, os 
marcadores de tamanho só garantem a eficácia da leitura do comprimento do 
DNA quando o marcador e o fragmento de DNA desconhecido têm a mesma 
continuação e o mesmo tamanho. 
Se as sequências do marcador e dos fragmentos das amostras não 
são os mesmos, a migração das amostras em relação os fragmentos do 
marcador podem ser diferentes. Isso se deve a parâmetros ambientais como 
porcentagem de agarose ou poliacrilamida, a quantidade de sais no tampão de 
corrida, a voltagem da eletroforese (BUDOWLE et al, 1995; MISCICKA-
SLIWKA, 1997; SULLIVAN, 1992) ou mesmo a detecção da emissão de 
fluorescência presente no fragmento amplificado, como ocorre na utilização de 
iniciadores marcados com fluorescência (GRIFFITHS et al; 1998; WATSON et 
al, 2001). 
Inúmeros marcadores de tamanho de fragmentos de DNA para 
eletroforese são disponibilizados comercialmente: 10, 50, 100 bp e 1Kb 
(INVITROGEN, 2007), ILS600 CXR presente no PowerPlex®16 (PROMEGA, 
2007) e GS500 LIZ, no AmpFlSTRS® Identifilier™ (APPLIED BIOSYSTEMS, 
2005); marcadores de peso molecular, como o Low DNA Mass Ladder 
(INVITROGEN, 2005-2); marcadores ou padrões alélicos que possuem os 
diversos alelos de um determinado locus (PUERS et al, 1993; SULLIVAN et al, 
1992). 
O marcador alélico é uma mistura artificial de alelos presentes em uma 
população de uma determinada STR (SAJANTILLA et al, 1992, SULLIVAN et 
al, 1992). Esses marcadores alélicos servem como padrão de migração para 
cada STR. Eles devem ser ajustados para os diferentes tamanhos de 
mensuração presente em instrumentos e condições de cada laboratório 
(BUTLER, 2005) (Figura 101). 
 
151
 
 
 
 Figura 101: Marcador alélico presente no Kit AmpSlTR® Identifiler™, 
da Applied Biosystems. Verifique a presença de diversos alelos em uma 
mesma amostra e a sua separação eletrofóretica. Os marcadores são 
utilizados para a comparação com os produtos de amplificação. 
Liu et al (1997) sugeriu a importância da análise do polimorfismo 
populacional que encontraram após o estudo da frequência alélica na 
população japonesa e chinesa e a construção do respectivo marcador alélico 
para a STR ACTBP2. Além de observarem alelos raros dentro de cada 
população, analisaram dois alelos que só foram encontrados na população 
japonesa, enquanto outros dois, somente na chinesa. Esse fato demonstra a 
variação dos polimorfismos em populações diferentes. Os autores encontraram 
também algumas microvariações alélicas raras. Todas essas variações foram 
incorporadas no marcador alélico construído pelos autores, possibilitando uma 
maior discriminação alélica. 
Uma mistura de diversos marcadores alélicos foi desenvolvida para a 
sua utilização em sistemas multiplex, e possuíam as seguintes STRs: 
HUMTH01, D21S11, D18S51, D8S1179, HUMVWA, HUMFIBRA/FGA e 
152
 
amelogenina. Os produtos da PCR possuindo os alelos amplificados foram 
sequenciados e posteriormente agrupados para a sua análise em um sistema 
automático (GRIFFITHS et al; 1998; WATSON et al, 2001). Outro marcador 
alélico multiplex foi desenvolvido por Fujii et al (2000) para as STRs HUMTH01, 
D9S304 e D3S1744, e também homogeneizaram os produtos da PCR. 
Outro fator que pode interferir na caracterização dos alelos é a 
quantidade de DNA utilizada na PCR, podendo ser um fator crucial para sua 
amplificação correta. Kobayashi et al (2004) ao analisar os produtos de DNA 
obtidos pela PCR da STR TH01 de amostras de DNA de diferentes 
concentrações constataram a perda de um alelo com quantidades de DNA 
muito baixas. De 100pg a 10ng, o DNA foi corretamente amplificado, mas 
quando analisou utilizou 10pg ou 1pg de DNA houve a perda de um dos alelos 
ou não foi possível detectá-los, sendo que o indivíduo era heterozigoto. Esse 
dado nos fornece justificativas para analisar cuidadosamente a quantidade de 
DNA a ser colocada para PCR, evitando a amplificação errônea dos 
fragmentos. 
 
 
 
 
 
 
 
22 CONTROLE DE QUALIDADE EXTERNO: TESTES DE 
PROFICIÊNCIA EM GENÉTICA FORENSE 
 
 
Atualmente são realizados diversos testes de proficiência: o Serviço 
Cooperativo de Testes (Collaborative Testing Services), o Colégio Americano 
de Patologistas (College of American Pathologists), o Instituto de Pesquisas 
Sorológicas (Serological Research Institute), Grupo de Diagnóstico Cellmark 
(Cellmark Diagnostic´s Internacional Quality Assurance Survey) a Associação 
Americana de Bancos de Sangue (AABB), a Sociedade Americana de Diretores 
de Laboratórios Criminais (ASCLD/LAB), o Grupo Europeu de Perfil de DNA 
153
 
(EDNAP) e o Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional de 
Genética Forense (GEP-ISFG) (PETERSON et al, 2003). 
O primeiro teste de proficiência em análises clínicas relatado foi 
realizado em 1946 quando Belk e Sunderman distribuíram espécies anônimas 
para laboratórios de hospitais para avaliar o desempenho e padronizar os 
resultados, que variaram entre os laboratórios, avaliando-se a causa das 
discrepâncias dos resultados e a qualidade do trabalho realizado (BELK, 
SUNDERMAN, 1988). 
Em 1974, a Fundação de Ciência Forense (Forensic Science 
Foundation) conduziu um estudo que trouxe diversos problemas na análise e 
interpretação dos resultados. Uma combinação de grandes esforços dos 
laboratórios resultou no aperfeiçoamento na educação e nas oportunidades de 
treinamento, implementação de programas de certificação e creditação, bem 
como a realização de testes de proficiência e implementação de programas de 
controle de qualidade (PETERSON & MARKHAM, 1995 a e b). 
A AABB publicou, em 1991, um conjunto de controle de qualidade em 
teste de DNA utilizando-se RFLP. O Grupo de Trabalho Técnico em Métodos 
Baseados em Análise de DNA (TWGDAM) foi criado nos Estados Unidos em 
1988 e realizou sua primeira publicação de 1991 (PETERSON et al, 2003). 
Estabeleceu-se, nos EUA, um conjunto de padrões em controle de qualidade e 
testes de proficiência para aplicação em laboratórios forenses. Em 1994, criou-
se o Conselho de DNA (DAB) cujos membros reportam-se diretamente ao 
diretor do FBI (ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA, 1994). 
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense 
(ISHF), que atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética 
Forense (ISFG), publica recomendações sobre análise de polimorfismos de 
DNA descrevendo e discutindo procedimentos para melhoria na 
reprodutibilidade e exatidão das metodologias utilizadas. O FBI recomenda 
outros detalhes sobre o controle de qualidade doslaboratórios que trabalham 
com evidências de DNA forense, que inclui além desses cuidados, a realização 
de testes periódicos de proficiência (a cada 180 dias) e auditorias anuais, para 
a manutenção da garantia de qualidade. O teste de proficiência é utilizado para 
monitorar o rendimento e para identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados, 
154
 
e a auditoria para averiguar a qualidade das atividades realizadas pelo 
laboratório (DNA ADVISORY BOARD, 2000). 
O Instituto Nacional de Padronização e Tecnologia (NIST) desenvolve 
e certifica padrões físicos e químicos para comercialização, manufatura e 
utilização em pesquisas, incluindo os utilizados em análise de ácidos nucléicos. 
Entre eles, aqueles utilizados em diagnóstico molecular de doenças 
infecciosas, genéticas, câncer e, também, vínculo genético. O NIST também 
conduz um abrangente teste de validação interlaboratorial para análises 
forenses e identificação genética humana (BARKER, 2002). 
A conduta de avaliação proposta para laboratórios que realizam vínculo 
genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de indivíduos 
mãe, filho e suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias utilizadas, 
seus protocolos metodológicos, assim como os resultados obtidos entre os 
participantes (BJERRE et al, 1997; HALLENGERG & MORLING; 2001). 
A avaliação do DNA degradado por diversas condições foi realizada 
por vários laboratórios europeus. Inicialmente, células foram degradadas em 
condições específicas (BENDER, 2004) e encaminhadas para 50 laboratórios 
europeus, com o objetivo de melhorar o entendimento sobre os diferentes 
parâmetros que influenciam a tipagem pelas STRs de DNA degradado. 
Abrange ainda a tentativa de otimização para minimizar problemas. Após a 
análise dos resultados de 38 laboratórios participantes concluíram que para 
superar os efeitos da degradação do DNA, protocolos da PCR devem ser 
otimizados para todos os parâmetros. Protocolos flexíveis para a interpretação 
dos perfis alélicos devem ser desenvolvidos e, se necessário, elaborados 
softwares para auxiliar na análise (SCHNEIDER et al, 2004). 
Em 2004, O NIST (KLINE et al, 2005) realizou estudo de quantificação 
de DNA entre 80 laboratórios que participaram do 14° Simpósio Internacional 
de Identificação Humana que foi realizado em Phoenix, AZ, EUA. Oito 
amostras de DNA extraídas foram liofilizadas e entregues aos laboratórios 
objetivando: examinar os resultados avaliando a performance dos laboratórios 
quando se utiliza concentrações baixas de DNA, fato frequente em casos 
forenses, e examinar a consistência das diversas metodologias utilizadas entre 
os laboratórios. Ao final do estudo houve uma variabilidade de 20% nos 
resultados utilizando-se 19 metodologias. Desses, 65% derivaram de técnicas 
155
 
abrangendo hibridização Slot Blot e 21% da PCR em tempo real. Comparando-
se os resultados de todos os laboratórios houve uma variação de 20% com 
emprego de técnicas diferentes. Com isso, estabeleceu-se que o controle 
positivo externo que foi gerado deveria ter os seus resultados comparados 
dentro de cada metodologia utilizada, quando o material fosse aproveitado em 
testes de proficiência. 
Um exercício colaborativo foi realizado em 1989 por 12 laboratórios 
Europeus utilizando-se VNTR pYNH24. Os resultados demonstraram que a 
correlação entre os perfis genéticos adquiridos podem ser alcançados tanto 
intra como entre os laboratórios, sob condições mínimas de padronização 
(SCHNEIDER et al, 1991). Um dos primeiros estudos em controle de qualidade 
das STRs foi realizado entre laboratórios participantes de um encontro do 
TWGDAM em 1995. Empregou-se, inicialmente, um triplex que amplificava as 
STRs CSF1PO, TPOX, TH01 e posteriormente foi acrescentado vWA, 
tornando-se um quadruplex. Mesmo utilizando-se protocolos idênticos, 
inúmeros fatores contribuíram para a variabilidade de tamanho dos alelos 
identificados que chegaram a uma diferença de acima de 4bp. Entre todos os 
fatores discutidos, a instabilidade eletroforética dos equipamentos pode ser 
considerado como primordial (MICKA et al, 1999). 
A análise das STRs não substituiu de imediato os VNTRs. Em 1995 e 
1996, um grupo filiado à Sociedade Internacional de Genética Forense 
(BJERRE, 1997) observou que as VNTRs eram analisadas por RFLP e seus 
fragmentos identificados utilizando-se sistema de câmera de detecção (57%) e 
14% ainda empregavam réguas para mensuração. Um estudo semelhante foi 
realizado em 1997, 1998 e 1999 pelo mesmo grupo, no qual houve uma 
diminuição na análise de VNTR por de sondas de locus e RFLP de 83% em 
1997 a 66% em 1999, enquanto mais de 90% dos laboratórios já utilizavam 
sistemas baseados na PCR. O coeficiente de variação foi de 1,3% na análise 
de VNTRs e de menos de 0,3% na análise das STRs. Segundo os autores, 
esse baixo valor se deu pela incorporação de conjuntos comerciais para 
análise de STR, melhorando a qualidade da mesma (HALLENBERG & 
MORLING 2001). 
No Brasil, os exercícios de controle de qualidade em identificação 
humana pelo DNA são realizados pelo GEP-ISFG e pela SLAGF, não havendo 
156
 
um grupo brasileiro específico que realize testes de proficiência. Desde 1992, o 
GEP-ISFG realiza um programa de controle de qualidade, sendo relatados 
como membros: 324 geneticistas forenses de 118 laboratórios de 19 países. 
Espanha, Portugal, Brasil, Argentina e Colômbia são os países mais 
representativos do grupo. A maioria dos laboratórios está relacionada com 
testes de paternidade, sendo 58% envolvidos com casos criminais (GOMÉZ et 
al, 2004). 
As amostras incluídas nos testes de proficiência realizados pelo GEP-
ISFG de 2002 a 2005 (GARCIA-HIRSCHFELD et al, 2005; GÓMEZ et al, 
2004), variaram de cinco a seis amostras diversificando entre: 100µL de 
sangue, incluindo casos de teste de paternidade; um fio de cabelo de 2 cm, 
realizado desde 2000; e amostras forenses incluindo saliva, em 1997; amostras 
mistas, em 1998, 2000, 2003, 2004 e 2005; sêmen, em 2002 e não humanas 
em 2001. O número total de erros variou de 0,6% a 2,3% em diferentes anos, 
sendo que esse valor está concentrado principalmente em laboratórios que 
utilizaram sistemas manuais de eletroforese e marcadores alélicos construídos 
internamente. 
A SLSGF observou que a porcentagem dos laboratórios participantes 
que estão obtendo resultados de análise corretos vem crescendo 
progressivamente, variando de 48% em 1998 até 84% em 2004-2005 
(PENACINO et al, 2005). Isso demonstra uma crescente melhoria da análise e 
de formação de recursos humanos mais adequados. Também já foram 
realizados testes de proficiência para a análise de DNA mitocondrial 
(SCHNEIDER et al, 1999) e DNA do cromossomo Y (CARRACEDO et al, 1998; 
CARRACEDO et al, 2001), observando-se a importância e a crescente 
incorporação de programas de controle de qualidade e testes de proficiência 
em identificação humana pelo DNA pelos laboratórios. 
 
 
 
 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
 
157
 
Os exames de DNA para caracterização de vínculo genético familiar ou 
análise de evidências forenses têm evoluído de forma rápida e constante nos 
últimos 10 anos. No entanto, apesar da incorporação de tecnologias para a 
análise de SNPs com microchips (Figura 102), por exemplo, a análise do perfil 
genético dos STRs após eletroforese capilar é a mais utilizada no mundo 
inteiro. 
 
 
Figura 102: Microchip para análise de SNPs, que pode ser utilizado para 
DNA forense. 
 
 
Pode-se dizer que, mesmo com o desenvolvimento da tecnologia, os 
princípios básicos da análise de DNA serão os mesmos, com a diferença que o 
equipamento, os reagentes ou os métodos podem diferenciar no nome ou no 
modelo. Por exemplo, podemos citar a extração de DNA que possui sempre a 
mesma “regra” básica: lise celular, precipitação de proteínas e isolamento do 
158
 
DNA. A lise celular sempre existirá, mas poderáser feita com diversos 
reagentes e diversos métodos, que vão depender do tipo de amostra a ser 
analisada, de suas condições físico-químicas ou biológicas e do recurso 
tecnológico que possuir no laboratório. 
O investimento para construir um laboratório de DNA forense é 
bastante alto, impossibilitando a troca imediata da tecnologia de análise de 
STRs, mtDNA, Y STRs, SNPs e miniSTRs. Para se ter uma idéia, somente o 
equipamento de eletroforese capilar novo – que realiza a análise de fragmentos 
de STR e de sequências – custa cerca de R$ 400.000,00 sem contar os 
reagentes, os kits e todos os outros equipamentos básicos para a sua 
realização, podendo chegar a quase R$ 1.000.000,00 de investimento 
(informações baseadas no ano de 2008). 
 
 
 
GLOSSÁRIO 
 
ABI 310 Genetic 
Analyzer 
Instrumento de eletroforese capilar produzido pela Applied 
Biosystems, introduzido na comunidade científica em 1995. 
Muitos laboratórios adotam, atualmente, o ABI 3100 ou ABI3130 
ou ABI3130XL. 
ABI 3100 Genetic 
Analyzer 
Instrumento de eletroforese capilar produzido pela Applied 
Biosystems, que possui todo o sistema computadorizado, 
inclusive de injeção de polímero. 
ABI (Applied Biosystems 
Incorporation) 
Companhia que produz e comercializa instrumentos e reagentes 
utilizados em Biologia Molecular, localizado em Foster City, 
Califórnia. 
Ácido 
desoxirribonucléico 
(DNA) 
Material genético de organismos, usualmente dupla fita, fazendo 
parte da classe de ácidos nucléicos identificados pela presença 
de desoxirribose, um açúcar e quatro nucleobases. 
Alelo (frequência) 
A proporção quantitativa de um determinado alelo entre os 
cromossomos dos indivíduos de uma mesma população. 
Alelo 
Uma forma alternativa de um gene ou de uma parte do DNA 
localizado em uma determinada região genética (locus). Os 
marcadores de STRs frequentemente possuem múltiplos alelos. 
Amelogenina 
Um marcador utilizado para tipagem sexual, cujo gene codifica 
o esmalte dentário, ocorre em ambos os cromossomos X e Y. 
159
 
Amostra de referência 
Uma amostra (normalmente sangue ou saliva) obtida de uma 
pessoa conhecida que é utilizada para comparação com a 
evidência. 
Amplicon 
O produto de amplificação do DNA pela Reação em Cadeia pela 
Polimerase (PCR). 
Amplificação 
Um aumento no número de cópias de um fragmento específico 
de DNA, podendo ser in vitro ou in vivo. 
Artefato 
Qualquer produto não relacionado ao alelo que pode ocorrer 
durante o processo de amplificação do DNA. EX: stutters e 
adenilação 
Autossômico 
Um cromossomo não envolvido em determinação do sexo, 
como os 23 pares de cromossomos que possuímos, sendo que 
os outros dois cromossomos X e Y são sexuais. 
Ciência forense 
A aplicação de conhecimento científico para questões civis e 
criminais, tipicamente através da apresentação de resultados de 
evidências. 
CODIS 
Abreviação de Combined DNA Index System ou Sistema de 
Indexação de DNA Combinado, que é um banco nacional de 
dados de perfis genéticos dirigido pelo FBI, Estados Unidos. 
Cromossomo 
A estrutura no qual a informação hereditária é fisicamente 
transmitida de uma geração a outra. 
Cromossomos sexuais 
Cromossomos que são diferentes nos dois sexos e estão 
envolvidos na determinação do sexo: cromossomo X e Y. 
Degradação 
A fragmentação, ou a quebra da molécula de DNA, devido a 
agentes químicos ou físicos. 
DNA mitocondrial 
(mtDNA) 
Molécula de DNA pequena, circular, de herança materna, 
localizada na mitocôndria e contém aproximadamente 16.500 
nucleotídeos. A abundância das mitocôndrias em uma única 
célula facilita a sua amplificação pela PCR, mesmo em 
amostras degradadas ou limitadas. 
Eletroforese capilar 
Uma técnica de eletroforese para separação de moléculas de 
DNA pelo seu tamanho e baseia-se na migração através de um 
tubo capilar preenchido com um polímero viscoso. 
Eletroforese 
É uma técnica na qual as moléculas são separadas pela sua 
velocidade em um campo elétrico. 
Eucarioto Organismo cujas células contêm núcleo. 
Evidência biológica 
Amostra biológica coletada na cena do crime, de pessoas ou de 
objetos associados ao crime. 
160
 
Exclusão 
O teste de DNA indica que um indivíduo é excluído (não ocorre 
combinação de alelos em determinados loci), como a fonte da 
evidência de DNA. Em casos criminais, “exclusão” não equivale 
a “inocente”, pois existem outras provas que são analisadas. 
Fluorescência 
A emissão de luz de uma molécula consequente da sua 
excitação por uma fonte de energia de luz. Na análise de DNA, 
marcadores fluorescentes permitem a detecção simultânea de 
tamanhos similares de produtos de PCR através da emissão 
fluorescente em diferentes cores. 
Gene 
Unidade básica de hereditariedade, uma sequência de DNA em 
um cromossomo. 
Genoma 
Todo material genético em um cromossomo de um organismo 
particular. 
Genótipo 
Constituição genética de um organismo, que é caracterizado por 
particularidades físicas ou fenótipo. 
Hereditariedade A transmissão de características de uma geração para outra. 
Heterozigoto 
Indivíduo que possui diferentes alelos em um locus, em 
cromossomos homólogos. 
Homozigoto 
Indivíduo que possui alelos maternos e paternos idênticos em 
um locus em cromossomos homólogos. 
Identifiler 
Um kit de PCR multiplex da Applied Biosystems que amplifica 
simultaneamente 15 STRs, incluindo os 13 STRs 
recomendados pelo CODIS e o marcador sexual amelogenina. 
In vitro Procedimento realizado fora de organismo. 
In vivo Procedimento realizado dentro de organismo. 
Inconclusivo 
Situação na qual nenhuma conclusão poderá ser dada em um 
teste sendo resultante de uma entre muitas razões: resultados 
não foram obtidos, resultados não-interpretáveis ou falta de 
amostra de referência para confronto. 
Loci de CODIS 
Um conjunto de 13 STRs recomendados para a inclusão de um 
perfil de DNA no banco de dados do CODIS/FBI. Esse conjunto 
tornou-se referência mundial para a análise de perfil genético de 
seres humanos visando a identificação humana, sendo que os 
laboratórios utilizam no mínimo essas 13 STRs. 
Loci Plural de Locus (vide Locus). 
Locus Localização física específica de um gene em um cromossomo. 
161
 
Marcador 
Um gene ou sequência específica de DNA de uma região 
conhecida em um cromossomo utilizado como um ponto de 
referência em um mapeamento de outro loci. 
Mutação 
Qualquer mudança não hereditária na sequência do DNA. Uma 
alteração ou troca de um alelo em um locus genético resultando 
em uma inconsistência entre o familiar biológico ou evidências. 
Pode ser considerada também qualquer alteração genética com 
frequência menor que 1% em uma população humana. Mas 
nesse conteúdo adotamos o primeiro conceito. 
Núcleo Organela celular em eucariotos que contém o material genético. 
Nucleotídeo 
Uma unidade de acido nucléico composto por fostato, ribose ou 
desoxirribose e uma base purina ou piridina. 
Par de base 
Dois nucleotídeos complementares ligados por ponte de 
hidrogênio. Ex: adenina-timina; citosina-guanina. 
PCR multiplex 
Co-amplificação de múltiplas regiões do genoma com mais de 
um conjunto de primers (ou iniciadores) em uma única PCR, 
diminuindo a quantidade de DNA e reagentes a ser empregado 
em uma PCR singular (que possui somente um par de primers 
para amplificar somente um locus. 
Perfil genético 
A análise completa de no mínimo 13 loci de um único indivíduo 
pode determinar o perfil genético. No entanto, esse perfil poderá 
estar incompleto, principalmente em amostras degradadas. 
Poder de discriminação 
O potencial de um marcador genético ou conjunto de 
marcadores em diferenciar duas pessoas escolhidas por acaso. 
Polimorfismo 
Diferença na sequência de DNA entre indivíduos. Variação 
genética que ocorre em mais de 1% da população pode ser 
considerada polimorfismo na análise de ligação. 
População 
Um grupo de indivíduos que residem em uma mesma área em 
um mesmo período. 
Power Plex 16 
Kit multiplex da Promega Corporation que co-amplificado 
genoma humano na revista Nature, em fevereiro de 2001, com a sequência de 
todo o genoma de três milhões de pares de bases, cerca de 90% completo. A 
surpreendente conclusão desta primeira versão era de que o número de genes 
humanos pareceu ser significativamente menor do que estimativas anteriores, 
a qual variou de 50.000 genes a 140.000 (NATIONAL HUMAN GENOME 
RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
A sequência completa foi concluída e publicada em abril de 2003. Após 
a publicação da maioria do genoma, em fevereiro de 2001, Francis Collins, 
diretor do Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Human 
Genome Research Institute – NHGRI), observou que o genoma poderia ser 
13
 
pensado em termos de um livro com várias utilizações: “Trata-se de um livro de 
história, uma narrativa da viagem da nossa espécie através do tempo. É um 
trabalho manual, com um projeto para construção incrivelmente detalhado de 
cada célula humana. E é um livro-texto transformador da medicina, com 
informações que darão aos profissionais da saúde novos poderes para tratar, 
prevenir e curar as doenças” (NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH 
INSTITUTE, 2008). 
As ferramentas criadas através do Projeto Genoma também estão 
sendo utilizadas para caracterizar o genoma de outros organismos usados 
extensivamente em pesquisa biológica como ratos, moscas e frutas. Tal 
pesquisa é importante porque a maioria dos organismos tem genes muito 
semelhantes ou “homólogos”, possuindo funções similares. Estes objetivos são 
necessários e continuarão a exigir uma variedade de novas tecnologias que 
tornarão possível e relativamente rápido construir um primeiro esboço do 
genoma humano, assim como aperfeiçoar este projeto (NATIONAL HUMAN 
GENOME RESEARCH INSTITUTE, 2008). 
 
As técnicas utilizadas no projeto genoma incluem: 
 Sequenciamento de DNA; 
 O emprego da técnica de análise de Fragmentos de 
Restrição dos Polimorfismos de Comprimento (RFLP); 
 Cromossomos artificiais em levedura (YAC); 
 Cromossomos artificiais em bactéria (TAS); 
 A reação em cadeia da polimerase (PCR); 
 Eletroforese. 
Fonte: An Overview of the Human Genome Project. 
 Disponível em http://www.genome.gov/12011238 
14
 
3 FUNDAMENTOS DE BIOLOGIA MOLECULAR 
 
 
O DNA (ácido desoxirribonucléico) armazena toda a informação 
genética, sendo encontrado nos cromossomos do núcleo e nas mitocôndrias, a 
maior parte localizada no primeiro (Figuras 14 e 15). 
 
 
 
 Figura 14: A célula é a unidade básica de todos os indivíduos vivos. 
 
15
 
 
 Figura 15: DNA a molécula da vida: do cromossomo a cadeia dupla 
de DNA. 
 
 
O DNA pode ser extraído de amostras de sangue, de esfregaços 
bucais, de saliva, de osso, de dente, de tecidos e órgãos, de fios de cabelos, 
de sêmen, entre outros materiais biológicos (Brettell et al, 2005) (Figura 16). 
16
 
 
 Figura 16: Amostras biológicas para análise do DNA forense. 
 
As moléculas de DNA caracterizam-se por polímeros de alto peso 
molecular, compostos de unidades básicas de nucleotídeos contendo 2-
desoxirribose ligados entre as posições 3’ e 5’ de carbonos por ligações 
fosfodiéster. A estrutura do DNA é uma dupla hélice de cadeias 
complementares opostas, na qual as duas moléculas são mantidas juntas por 
fracas pontes de hidrogênio (Figuras 17 e 18) (Watson & Crick, 1953). 
17
 
A) 
 
 
18
 
 
B) 
 
 Figura 17: A) Representação esquemática da dupla hélice da molécula 
de DNA segundo Watson & Crick, 1953; B). Estrutura química da molécula de 
DNA, com sua natureza antiparalela com o carbono 3’ com o carbono 5’. As 
bases C e G são ligadas por três pontes de hidrogênio e as A e T, por duas. 
 
19
 
 
 Figura 18: Representação esquemática da molécula de DNA. 
 
 
A base adenina liga-se com timina e citosina com a guanina através de 
duas ou três uniões de hidrogênio respectivamente. Essas bases nitrogenadas 
(adenina - A, timina - T, citosina - C e guanina – G ou g) (Figura 19), ao se 
ligarem com o açúcar, constituem o nucleosídeo; sendo que o último ligado 
com um grupamento fosfato, constitui o nucleotídeo, que é a unidade básica de 
repetição na fita de DNA (Watson & Crick, 1953) (Figura 20). 
 
20
 
 
 Figura 19: Estrutura química das bases nitrogenadas e suas 
respectivas pontes de hidrogênio. 
 
21
 
 
 
 Figura 20: O nucleotídeo e par de bases (“base pair” - bp) 
 
 
Determinados fragmentos de DNA especificam a síntese de RNA em 
um processo denominado transcrição. O ácido ribonucléico (RNA) é um 
polímero linear composto de cadeia de unidades de ribose ligadas pelas 
posições 3’ e 5’ por intermédio de grupamentos fosfodiéster, tendo como 
função a síntese protéica e também pode constituir o genoma de alguns vírus. 
O gene é uma unidade de transcrição que consiste de um segmento de DNA 
específico que se estende do início do sítio de transcrição ao sítio de término 
de transcrição. O RNA especifica a síntese de polinucleotídeos que formarão 
as proteínas, sendo tal processo denominado tradução, ocorrendo nos 
ribossomos, nas mitocôndrias e cloroplastos (Figuras 21, 22 e 23) (Beard & 
Armentrout, 1967; Srinivasan & Yathindra, 1977). 
 
22
 
 
 Figura 21: Fluxograma da transcrição e tradução. 
 
23
 
 
 Figura 22: Mecanismo de produção de aminoácidos pelas células. 
 
 
 
24
 
 
 Figura 23: Ilustração da transcrição e tradução. 
 
 
As regiões de um gene que codificam proteínas são denominadas 
éxons e aquelas que não a realizam, íntrons. Cada éxon codifica uma porção 
específica da proteína completa. Em algumas espécies, incluindo a humana, os 
éxons são separados por longas regiões de DNA denominadas íntrons ou DNA 
“lixo”, que aparentemente não estão associadas à codificação de proteínas 
(National Human Genome Research Institute, 2008) (Figura 24 e 25). 
 
 
25
 
 
 Figura 24: Diferenças entre os éxons e íntrons. Observe a remoção da 
parte amarela, correspondente ao íntron. 
 
26
 
 
 Figura 25: Diferenças entre os éxons e íntrons. 
 
 
27
 
Os alelos constituem as variantes de um gene em uma região 
particular, ou lócus, em um cromossomo. Diferentes alelos produzem variações 
nas características individuais como, por exemplo, cor do cabelo ou tipo 
sanguíneo (National Human Genome Research Institute, 2008) (Figura 26). 
 
 
 
 Figura 26: Alelos correspondentes à cor dos olhos, ligados ao 
cromossomo X. 
 
 
28
 
A duplicação celular ocorre através da mitose (Figura 27) e a formação 
de gametas masculinos e femininos ocorre através da meiose (Figura 28). 
 
 Figura 27: A mitose é responsável pelo crescimento e desenvolvimento 
dos indivíduos, bem como a reposição de células injuriadas ou destruídas do 
corpo. 
29
 
 
 
 Figura 28: A meiose é um processo de divisão celular pelo qual uma 
célula diplóide (pares de cromossomos, sendo um materno e outro paterno) 
30
 
origina quatro células haplóides (um cromossomo), reduzindo à metade o 
número de cromossomos constante de uma espécie. 
 
A transferência das informações genéticas de uma geração a outra 
ocorre através da replicação do DNA, catalisada por enzimas denominadas 
DNA polimerases. Essas enzimas mediam a síntese da nova fita de DNA in 
vivo, utilizando como molde (template) a fita complementar da molécula 
existente. Inicialmente, a molécula de DNA tem as suas fitas separadas pelo 
rompimento das ligações de hidrogênio que mantêm a dupla hélice, em um 
processo denominado desnaturação, que ocorre in vivo em pH alcalino. Além 
da fita molde, é necessária a presença de um oligonucleotídeo iniciador ou 
primer, ou seja, um pequeno fragmento de DNA simples, complementar a fita 
molde, desoxinucleotídeos trifosfatados (dATP, dCTP, dGTC, dTTP), que serão 
incorporados à fita duplicada. A replicação do DNA ocorre em regiões 
específicas denominadas origem de replicação15 STRs, 
sendo que 13 recomendados pelo CODIS-FBI, e mais o 
marcador sexual amelogenina. 
Primer (ou iniciador) 
Uma cadeia polinucleotídica curta sintetizada artificialmente que 
possui normalmente de 18 a 30 bases, que se hibridiza em uma 
região específica do DNA e permite que a enzima DNA 
polimerase inicie a síntese da fita complementar. 
Probabilidade de 
exclusão (PE) 
Uma porcentagem da população que pode ser excluída como 
potencial contribuidor em um resultado de mistura de DNA. 
162
 
Reação em Cadeia pela 
Polimerase (ou da 
Polimerase) – PCR 
Processo in vitro que permite a amplificação de milhões de 
cópias de um DNA específico através de repetidos ciclos 
envolvendo a enzima DNA polimerase. 
Sequências 
complementares 
As sequências de ácidos nucléicos formam uma estrutura de 
dupla fita por pareamento de bases, como adenina-timina, 
citosina-guanina. Por exemplo, a sequência complementar de 
GTACCG é CATGGC. 
SNP 
Polimorfismo de base única. Qualquer variação polimórfica de 
um nucleotídeo. A maioria dos SNPs apresenta-se bialélicos 
com a frequência do menor alelo a menos de 1%. 
STR 
Repetições Consecutivas Curtas. Sequência de DNA arranjada 
em sucessão direta ou consecutivas na qual a unidade de 
repetição varia de 2 a 6 pares de bases. Os STRs normalmente 
ocorrem em regiões não-codificadoras e o número de unidades 
repetitivas pode variar de indivíduo para indivíduo. 
Teste de proficiência 
Medidas que visam assegurar a qualidade utilizada para 
monitorar a performance de um analista e identificar áreas nos 
quais melhorias são necessárias. Pode ser interno (produzidos 
pelo próprio laboratório) ou externo (produzidos por outros 
grupos). 
Zigoto 
Célula formada quando um DNA nuclear do espermatozóide 
combina com o DNA nuclear do óvulo, resultando em uma 
célula diplóide. 
 
 
 
 
 
 
 
 
163
 
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167(Marmur & Doty, 1959). 
Sucintamente, a replicação ocorre com a adição de um nucleotídeo à 
fita de DNA pela ligação de seu grupo fosfórico, presente no carbono 5' da 
desoxirribose, com a hidroxila do carbono 3' da desoxirribose do último 
nucleotídeo presente na cadeia replicada. Por esse motivo, descreve-se que a 
síntese de DNA ocorre no sentido 5´-> 3´ (Figura 29) (Marmur & Doty, 1959;). 
Todo o processo descrito acima será a base do princípio da amplificação do 
DNA in vitro denominada reação em cadeia pela polimerase (Polymerase 
Chain Reaction – PCR), que será estudado nos tópicos adiante. 
 
31
 
 
 Figura 29: Posição 5´- 3´das fitas de DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A = 
TG  
T = 
A
A = 
T
C  
T 
C 
C 
A 
G 
G 
T 
A 
G C 
T = 
T = 
C 
A = 
A = 
G 
5
’
3
’5
’
3
’
5 3
3 5
Fitas 
desnaturadas 
Fitas 
hibridizadas 
Pontes de 
hidrogênio 
C 
C 
G 
Adaptado de J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2
nd
 Edition © 2005 
Elsevier Academic Press 
32
 
 
4 DNA GENÔMICO X DNA MITOCONDRIAL 
 
 
O conjunto completo de sequências no material genético de um 
organismo é denominado genoma, incluindo todos os cromossomos mais 
qualquer DNA presente nas organelas. O genoma nuclear humano possui 
cerca de 3300 Mb, distribuídos em 22 cromossomos autossômicos e 2 sexuais 
(Figura 30 e 31), compostos de 30 a 35 mil genes, caracterizando por 1,5% a 
2% de DNA codificante de proteínas, sendo que 46% do total constitui-se de 
sequências de DNA repetitivas (Wiemann, 2001; Szymasky, 2005). 
 
 
 Figura 30: Cromossomos humanos. 
 
33
 
 
 Figura 31: Cariótipo de um humano do sexo masculino. 
 
 
A finalização do sequenciamento do DNA humano (Tabela 1) trouxe 
alguns dados que alteraram os valores esperados pela comunidade científica, 
como por exemplo, a quantidade de genes. Estimava-se que o genoma 
humano possuía mais de 80.000 genes, mas após o Projeto Genoma, estima-
se que existam de 20.000 a 25.000 genes (Figura 32). 
 
34
 
 
 
Tabela 1: Quantidade de nucleotídeos em cada cromossomo humano. 
35
 
 
 Figura 32: Resumo das características básicas do genoma humano. 
O genoma mitocondrial possui particularidades que o diferenciam do 
genoma cromossômico, sendo sua herança materna. Sua estrutura circular de 
16,5Kb lhe fornece maior resistência à digestão enzimática de uma única célula 
há a presença de milhares de mitocôndrias, cada qual com uma cópia de DNA 
36
 
mitocondrial, sendo que 93% do seu genoma é codificante, não possuindo 
íntrons e com poucas regiões repetitivas (Anderson et al, 1981). Dentro de uma 
única célula há inúmeras cópias do genoma mitocondrial, ao contrário do 
genoma nuclear, que possui uma cópia por célula (Budowle et al, 2003) (Figura 
33, 34 e 35). 
 
 
Adaptado de http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/july1999/dnaf1.htm
 Figura 33: Diferenças básicas entre o DNA genômico ou nuclear e 
mitocondrial.
 
 
37
 
 
Figura 34: Representação esquemática do DNA genômico ou nuclear e 
do DNA mitocondrial (mtDNA). 
 
 
38
 
 
Figura 35: Representação esquemática do DNA mitocondrial (mtDNA), de 
acordo com as suas regiões hipervariáveis. 
 
 
 
 
 
39
 
5 MARCADORES DE VARIAÇÃO GENÉTICA 
 
 
A variabilidade do DNA humano confere a diferença entre cada ser 
vivo, sendo que pode ser denominada por polimorfismo se a variação genética 
possuir frequência acima de 1% em determinada população e mutação abaixo 
desse valor (Beiguelman, 2006). Jeffreys et al. (1985) foi um dos primeiros a 
analisar as regiões de minissatélites do DNA humano, possibilitando a 
investigação de paternidade e a identificação em casos criminais. O 
polimorfismo dos minissatélites permite que ocorra a diferenciação dos 
indivíduos, aumentando a possibilidade de termos uma quantidade maior de 
alelos na população, desde que não sejam gêmeos idênticos, posto que terão o 
mesmo perfil genético. Para a análise do minissatélite, Jeffrey et al. 
desenvolveram o DNA fingerprint (impressão digital de DNA). Ao utilizar a 
tecnologia de Southern blot, obtiveram um padrão de bandas específico para 
cada indivíduo, como se fosse uma impressão digital. 
Os Single Sequence Length Polymorphism (SSLP) ou polimorfismo de 
comprimento de sequência única englobam os VNTR (Variable Number of 
Tandem Repeats) ou repetições consecutivas de número variável (Wyman e 
White, 1980; Jeffreys et al,1985; Wolff et al,1989) ou minissatélites descritos no 
parágrafo anterior, e também os STR (Short Tandem Repeats) ou repetições 
consecutivas curtas ou microssatélites (Edward et al, 1991; Edward et al, 1992) 
(Figuras 36, 37 e 38). 
A diferença entre eles é o tamanho da sequência que se repete, sendo 
que nos microssatélites essa estrutura é menor, pois possuem repetições 
constituídas de 2 a 9 pares de bases, e o minissatélite, de 10 a 64 pares de 
bases. Esse DNA satélite na maioria das vezes não é transcrito, 
consequentemente não está associado com a expressão da informação 
genética (Nelleman et al, 1994; Hamond et al, 1994; Gill et al, 1994; Urquart et 
al, 1994; Chakraborty et al, 1999). 
 
40
 
 
Figura 36: Representação esquemática comparando as VNTRs das 
STRs, segundo sua unidade de repetição. 
 
 
Figura 37: Representação esquemática das repetições consecutivas do 
STR TPOX e seus respectivos alelos. 
 
Os Single Nucleotide Polymorphism (SNP) ou polimorfismo de 
nucleotídeo único é uma variação na sequência de DNA que ocorre quando um 
nucleotídeo é alterado por outro em sequências de DNA que podem ou não 
codificar genes (Delahunty, 1996; Sobrino et al, 2005; Butler, 2005) (Figuras 38 
e 39). 
41
 
 
 
Figura 38: Representação esquemática comparando os polimorfismos de 
sequência com os de comprimento. 
 
42
 
 
Figura 39: Representação esquemática de sequências de DNA de três 
indivíduos distintos com a presença de um SNP (polimorfismo de sequência) e 
um STR (polimorfismo de comprimento), mostrando suas diferenças. 
 
 
Atualmente, os STRs e SNPs são empregados amplamente para a 
identificação humana e possuem diferenças relevantes (Gill et al, 2004; Butler, 
2005) (Quadro 1). 
 
43
 
Quadro 1: Comparação entre os STRs e SNPs (adaptado de Butler, 2005). 
STR SNP 
Variam de 2 a 9 nucleotídeos 
que se repetem consecutivamente 
Troca de bases A/T, A/G, A/C, 
C/T, C/G, T/G. 
Apresentam-se em diversos 
alelos, normalmente mais de 5 
Normalmente 2 
Detectado por separação 
eletroforética em gel ou capilar 
Análise por sequenciamento ou 
hibridização em microchip. 
O FBI preconiza 13 STRs Estima-se que mais de 50 SNPs 
seriam necessários para a análise 
(Gill et al, 2004) 
Vantagens: 
 Banco de dados 
populacionais realizado no 
mundo todo 
 A presença de vários alelos 
facilita a identificação de 
mutações e misturas de DNA. 
Vantagens: 
 Os produtos de PCR podem 
ser menores, resultado em 
maior chance de 
amplificação, principalmente 
em amostras biológicas 
degradadas. 
 Após devidamente 
otimizados e estudados, 
pode-se analisar mais de 
1000 SNPs em um mesmo 
microchip, mas essa 
tecnologia ainda não é 
amplamente empregada. 
 
 
 
A análise dos SNPs também pode estar associada aos fenótipos 
individuais, havendo uma possibilidade futura de identificação de traços físicos 
44
 
como, por exemplo, a cor da íris (Frudakis et al, 2003). Sua grande aplicação 
na atualidade se dá nas pesquisas de farmacogenética e na indústria 
farmacêutica, na caracterização de doenças de origem genética e bioquímica 
(Wang et al, 1998). 
Jobim et al. (2006) relata que os melhores STRs utilizados na 
identificação humana são aqueles com maior polimorfismo (maior número de 
alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado índice de 
discriminação e heterozigose, e baixa frequência de mutações. Para isso, há a 
necessidade dos laboratóriosrealizarem a frequência genética em pelo menos 
100 indivíduos não relacionados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
45
 
6 ANÁLISE DO DNA FORENSE: ASPECTOS GERAIS 
 
 
Para analisar uma amostra de material biológico visando 
caracterização de vínculo genético, seja familiar ou em casos criminais, 
qualquer contaminação de DNA estranho, ou mesmo a inadequação das 
metodologias aplicadas, pode resultar tanto na impossibilidade de estabelecer 
os perfis genéticos como na inutilização da amostra, posto que principalmente 
em casos forenses a amostra pode ser única. A primeira preocupação no 
estudo do perfil genético, visando à identificação humana, é avaliar o quanto as 
metodologias de detecção utilizadas pelos laboratórios são válidas, assim 
como seus princípios moleculares e genéticos. 
Tendo em vista assegurar uma geração de dados corretos e 
tecnologias adequadas, um apropriado programa de controle de qualidade é 
essencial para os laboratórios de análises clínicas que realizam identificação 
humana pelo DNA. Todas as metodologias de análise de DNA forense devem 
ser submetidas a um programa de validação visando assegurar a segurança, a 
reprodutibilidade e robustez da técnica (Klosterman, 2001). Resumidamente, a 
análise de DNA forense ocorre da seguinte maneira (Figura 40): 
46
 
 
Figura 40: Esquema da sequência dos métodos a serem utilizados para 
o estudo do DNA forense, englobando os estudos da Biologia, da Tecnologia 
envolvida e da Genética aplicada. 
 
 
Desde 1989, a Sociedade Internacional de Hemogenética Forense 
(ISFG), que atualmente é denominada de Sociedade Internacional de Genética 
Forense (ISFG), publica recomendações envolvendo polimorfismos de DNA, 
demonstrando o interesse em avaliar a reprodutibilidade e exatidão das 
metodologias utilizadas. O FBI acrescenta alguns itens para o controle de 
qualidade dos laboratórios que trabalham com evidências de DNA forense, que 
inclui, além desses cuidados, a realização de periódicos testes de proficiência 
(a cada 180 dias) e auditorias anuais, para a manutenção da garantia de 
qualidade. O teste de proficiência é utilizado para monitorar o rendimento e 
identificar tópicos que devem ser aperfeiçoados e a auditoria para averiguar a 
47
 
qualidade das atividades realizadas pelo laboratório (DNA Advisory Board, 
2000). 
Os exercícios propostos para laboratórios que realizam caracterização 
de vínculo genético normalmente são constituídos de amostras biológicas de 
indivíduos mãe, filho e suposto pai, com o intuito de comparar as estratégias 
utilizadas, seus protocolos metodológicos, assim como os resultados obtidos 
entre os participantes (Bjerre et al, 1997; Hallengerb e Morling; 2001). 
No Brasil, tais testes de proficiência em identificação humana pelo DNA 
são realizados pelo Grupo Espanhol e Português da Sociedade Internacional 
de Genética Forense (Grupo Español Y Portugués - International Society for 
Forensic Genetics), não havendo um grupo específico que realize testes de 
proficiência no país. Esses testes consistem na análise de amostras de sangue 
e outro fluido biológico que simulam um caso forense para a manutenção da 
qualidade na análise do DNA de amostras (ISFG, 2000). 
As contaminações das amostras pelos investigadores e pessoas do 
laboratório podem resultar em uma incorreta interpretação do perfil genético. 
Dessa maneira, o desenvolvimento e cumprimento de normas de 
procedimentos e treinamentos específicos para o exame de DNA tornaram-se 
imprescindíveis (Neumayer, 1998; INTERPOL, 2001). Nos EUA o FBI 
implantou o CODIS - Combined DNA Index System, que tornou-se operacional 
em 1998, e combina a ciência forense com a tecnologia eletrônica, formando 
um banco de dados de perfis genéticos de DNA extraído de evidências 
biológicas coletadas na cena do crime e DNA de criminosos condenados por 
agressão sexual e outros tipos de violência física (Figura 41). Todos os estados 
americanos podem ter acesso a esse banco de DNA e, dessa maneira, há a 
possibilidade de comparar os perfis genéticos de um suspeito em um crime 
com os perfis contidos no CODIS, averiguando se o mesmo cometeu 
anteriormente outra infração (FBI, 2002). 
 
 
48
 
 
 
Figura 41: Inspeção visual de evidência forense. 
 
 
O CODIS selecionou 13 STRs para a análise do perfil genético: 
CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, 
D13S317, D16S539, D18S51, e D21S11 (Budowle & Moretti, 1999) (Figura 42 
e Tabela 2). Esse conjunto de loci transformou-se uma referência para outros 
países do mundo, no que se refere à ciência forense (Sun et al, 2003). 
 
 
49
 
 
 
Figura 42: STRs recomendados pelo Banco de DNA, vinculado ao FBI 
(CODIS), segundo a sua distribuição nos cromossomos humanos. 
 
 
 
50
 
Tabela 2 – Informação dos 13 STRs recomendados pelo CODIS. 
 
Nome 
do 
Lócus 
Localização do 
cromossomo 
Unidade 
de 
repetição 
Acesso 
GenBank 
http://www.
ncbi.nih.go
v/Genbank
/index.html 
Variação 
dos 
alelos 
Número de alelos 
observados 
CSF1PO 5q33.1 
c-fms pronto-
oncogene, 
6° intron 
TAGA X14720 6-16 15 
FGA 4q31.3 
-fibrinogênio 
3° intron 
CTTT M64982 15-51,2 69 
TH01 11p15.5 
Tirosina 
hidroxilase 
1° intron 
TC|AT D00269 3-14 20 
TPOX 2p25.3 
Tiroide peroxidade 
10° intron 
GAAT M68651 6-13 10 
VWA 12p13.31 
von Willebrand 
factor 
40° intron 
[TCTG] 
[TCTA] 
M25858 10-24 28 
D3S135
8 
3q21.31 [TCTG] 
[TCTA] 
NT_00599
7 
9-20 20 
D5S818 5q23.2 AGAT G08446 7-16 10 
D7S820 7q21.11 GATA G08616 6-15 22 
D8S117
9 
8q24.13 [TCTA] 
[TCTG] 
G08710 8-19 13 
D13S31 13q31.1 TATC G09017 5-15 14 
51
 
7 
D16S53
9 
16q24.1 GATA G07925 5-15 10 
D18S51 18q21.33 AGAA L18333 7-27 43 
D21S11 21q21.1 [TCTA] 
[TCTG] 
complexo 
AP000433 24-38 70 
Adaptado de Butler et al, 2005 
 
 
O DNA working group of the European Network of Forensic Science 
Institutes (ENFSI) e Scientific Working Group on DNA Analysis Methods 
(SWGDAM) (Gill et al, 2004) levantam a possibilidade futura da substituição do 
banco de dados de DNA atualmente contendo os 13 STRs indicados pelo 
CODIS do FBI por um banco de dados de DNA contendo informações de 
SNPs. Entretanto, os autores citam que a curto e médio prazo não haverá a 
substituição dos bancos de dados, inclusive das tecnologias utilizadas, e sim a 
incorporação dos mesmos em estudos forenses visando à padronização do seu 
uso assim como de sua análise. 
Essa normatização possibilita maior facilidade em comparar tanto as 
frequências alélicas populacionais como os resultados dos perfis genéticos, 
mesmo que seja realizada em outros países. Visando futuramente implantar 
um banco de perfis genéticos de criminosos como o CODIS, o governo federal 
brasileiro já adotou os STRs sugeridos pelo CODIS como referência em 
perícias criminais em seu Manual de Padronização de Exames de DNA em 
Perícias Criminais (Secretaria Nacional de Segurança Pública - SENASP, 
2006), que está sendo utilizado como referência para os laboratórios que 
trabalham com identificação humana. 
 
 
 
 
52
 
7 ESTUDO DA METODOLOGIA APLICADA À IDENTIFICAÇÃO 
HUMANA 
 
 
A análise do DNA em caracterização do vínculo genético engloba 
desde o domínio da metodologia de coleta do material biológico até a 
interpretação dos resultados obtidos (Butler, 2004) (Figura 43). Cada qual 
possui sua particularidade e cuidados inerentes à técnica que podem oferecer 
vantagens e desvantagens, de acordo com o objetivo almejado. 
 
 
 Figura 43: Esquema de todos os procedimentos envolvidos em 
caracterização do vínculo genético. 
53
 
A análise do DNA compreende diversas etapas, independente da 
metodologia a ser empregada e do tipo de amostra que será analisada 
(COMMITTEE ON DNA TECHNOLOGY IN FORENSIC SCIENCE, 1992; 
BONACCORSO, 2005). O processo inclui: 1) coleta de amostras; 2) extração,purificação e quantificação do DNA de todas as amostras; 3) análise dos loci; 
4) visualização dos fragmentos e caracterização; 5) interpretação e análise 
comparativa dos resultados (INTERPOL, 2001). 
No entanto, para fins didáticos, os tópicos serão divididos em: 
 
 
 
 
 
 
 
Exame pericial em local de crime
Coleta do material biológico
Extração de DNA
Quantificação de DNA
Reação de amplificação pela polimerase - PCR
Eletroforese e detecção dos fragmentos de DNA
Interpretação dos resultados
Controle de qualidade
54
 
8 EXAME PERICIAL NO LOCAL DO CRIME 
 
 
Em 2000, a Agência Federal de Investigação dos Estados Unidos 
(EUA), mais conhecida como FBI (Federal Bureau of Investigation), elaborou 
um guia para a investigação da cena do crime (TWGCSI – Grupo de trabalho 
técnico da investigação da cena do crime, 2000). Esse manual visa à 
padronização das práticas adotadas para a investigação da cena do crime dos 
policiais e peritos americanos, tornando-se referência em investigação da cena 
do crime, seja para o exame de DNA forense ou não. Eles elaboraram esse 
manual dividindo em cinco sessões distintas: chegada à cena do crime, 
documentação preliminar, avaliação da cena, processando a cena, finalizando 
a investigação da cena do crime. 
 
1) Chegada à cena do crime: Um dos cuidados mais importantes da 
perícia criminal é a manutenção das evidências físicas e a preservação da 
cena do crime, que deve ser realizada imediatamente após sua constatação, e 
é realizado normalmente pela polícia local (Figura 44). 
 
a) Anotar o local, a data, o tipo de ocorrência, casas, veículos, 
eventos ocorridos e elementos envolvidos; 
b) Não permitir que pessoas, veículos ou objetos saiam da cena do 
crime, identificando possíveis vítimas e suspeitos; 
c) Aproximar-se da cena cuidadosamente e verificar a possibilidade 
de outros crimes ao redor; 
d) Realizar observações iniciais (olhar, ouvir e cheirar) o ambiente e 
anotá-los; 
e) Observar a possibilidade de perigo de explosão e contaminação 
por materiais perigosos ou tóxicos e, se necessário, chamar policiais 
especializados para analisar a cena do crime; 
 
55
 
 
 
Figura 44: Esquema de isolamento da cena do crime. 
 
 
f) Não permitir que pessoas, veículos ou animais se aproximem da 
cena do crime, evitando contaminações e perigos como explosões; 
g) Após controlar as situações de perigo e isolar a área, a próxima 
atenção é chamar socorro médico para dar assistência médica necessária aos 
feridos, minimizando ao máximo a contaminação da cena do crime; 
h) Anotar todas as etapas dos cuidados médicos, desde sua hora de 
chegada até os cuidados prestados; 
i) Assegurar que evidências como roupas, objetos e manchas 
encontradas no corpo sejam preservadas pela equipe médica; 
j) Documentar todos os comentários e testemunhos de pessoas 
envolvidas ou presentes no local do crime ou ao seu redor; 
k) Um oficial da polícia deve sempre que possível acompanhar a 
vítima para o hospital para garantir a preservação das evidências ou mesmo 
documentar comentários feitos pelo paciente; 
56
 
l) Lacrar a cena do crime com faixas e adesivos; 
m) Controlar o fluxo de pessoas, inclusive peritos e outros policiais; 
n) Se possível, efetuar mensurações e tirar fotografias com escalas, 
para preservar as evidências – como pegadas, marcas de pneu no chão, etc –, 
presentes na cena do crime, caso chova, neve ou derreta (se for gelo); 
o) Não permitir que qualquer pessoa fume, masque chiclete, use o 
telefone ou banheiro, coma ou beba qualquer coisa, mexa nos vidros e janelas, 
mude os móveis de lugar, etc. Ou seja, não permitir que mexam em qualquer 
objeto presente na cena do crime ou ao seu redor; 
p) Toda a documentação e anotações feitas pelo policial devem ser 
entregues ao investigador de polícia para posterior estudo e análise. 
 
2) Documentação preliminar e avaliação da cena: 
 
a) O investigador de polícia deverá documentar todas as 
informações recolhidas pelo policial, organizá-las e identificá-las com os dados 
da região do crime (delegacia, responsável, cidade, estado, etc); 
b) Continuar a manutenção da cena do crime descrita anteriormente, 
documentando todas as pessoas que estiverem participando da investigação; 
c) Definir estratégias para a análise fotográfica e recuperação dos 
vestígios encontrados na cena do crime. 
 
3) Processando a cena: 
 
a) O investigador deverá avaliar e posteriormente solicitar a 
presença de peritos criminais, de acordo com a especialidade envolvida; 
b) O controle da contaminação deve ser extremamente rígido, 
evitando-se o contágio dos profissionais, das vítimas, da cena do crime, dos 
objetos, etc.; 
c) Utilizar equipamentos de proteção individual (EPI), como luvas 
(obrigatório), gorros e protetores de sapato (se necessário); 
d) Todo material utilizado para coleta das evidências deve estar 
devidamente limpo ou até esterilizado, caso seja para coleta de material 
biológico, e deve ser corretamente acondicionado (Figura 45); 
57
 
 
 
 
 
 Figura 45: Envelopes e sacos de papel para coleta de evidências e 
objetos encontrados na cena do crime como roupas, celulares, documentos, 
etc. 
 
 
 
e) Toda evidência deve ser corretamente documentada, citando-se a 
localização, identificação e condições que se encontravam, fotografada com 
escalas de referência e/ou filmadas antes de ser removida da cena do crime; 
 
f) Analisar e verificar a metodologia utilizada para a coleta da 
evidência. Por exemplo, cada método requer equipamentos e materiais 
diferenciados para a sua realização. Sendo assim, para fazer a análise de 
impressões digitais não se utiliza o mesmo equipamento para exame de 
marcas de mordidas, e assim por diante; 
 
g) Documentar qualquer intercorrência ou dificuldade havida durante 
a coleta do material; 
58
 
h) Preservar adequadamente o material coletado com a finalidade de 
minimizar sua degradação: refrigerado, congelado, local seco, local úmido, etc.; 
i) Encaminhar para os respectivos laboratórios periciais. 
 
4) Finalizando a investigação da cena do crime: 
 
a) Determinar quais evidências foram coletadas; 
b) Discutir com toda a equipe envolvida na cena do crime as 
intercorrências e evidências. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
59
 
 
 
 
9 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO 
 
 
As amostras de material biológico devem ser minuciosamente colhidas, 
seja quando dispostas na cena do crime ou quando forem de indivíduos 
devidamente identificados. É importante que todas as pessoas que manipulam 
as amostras tenham conhecimentos específicos baseados na literatura 
especializada, e ainda possuam treinamento em boas práticas de manipulação 
em laboratórios forenses, com rígida formação em controle de qualidade 
(INTERPOL, 2001). Amostras que não estiverem adequadamente identificadas 
e documentadas podem ser questionadas; aquelas que não forem 
corretamente coletadas são passíveis de não serem analisadas; outras, se não 
forem devidamente acondicionadas podem sofrer contaminação e se não forem 
criteriosamente preservadas pode ocorrer decomposição e deterioração (FBI, 
2003). 
O FBI (1999, 2001) e a INTERPOL (2001) elaboraram normas para os 
laboratórios forenses que participam da formação dos bancos de DNA 
internacional, englobando principalmente a metodologia de coleta de 
evidências biológicas para análise do DNA, assim como aspectos importantes 
para o treinamento de pessoal que serão descritas adiante. O material 
biológico presente na cena do crime pode aparentar invisível a olho nu, dessa 
maneira, utiliza-se reagente como o luminol que não interfere na análise do 
DNA para detecção de amostras com vestígios de sangue, sendo que reage 
com o ferro presente na hemoglobina, exibindo uma quimioluminescência 
(GROSS et al, 1999). 
Outros kits de reagentes são empregados: aquelesque contém 
antígeno próstata-específico para sêmen (HOCHMEISTER et al, 1999) e para 
saliva, o teste de detecção de amilase por Phadebas® (WILLOTT & 
GRIFFITHIS, 1980) etc. Diversos cuidados devem ser tomados para a 
documentação das amostras coletadas na cena do crime: fotografar o local de 
remoção das evidências, realizar anotações da sua disposição e de 
60
 
características pertinentes (SÃO PAULO, 1999; INTERPOL, 2001 ; FBI, 2003; 
BONACORSO, 2005). Amostras de sangue podem ser coletadas dos 
indivíduos, encontradas em corpos, objetos e superfícies (Figura 46). Qualquer 
que seja o material biológico a ser coletado, o manipulador deverá utilizar luvas 
ou pinças estéreis (Figura 46 e 47). A coleta de sangue em indivíduos hígidos 
deverá ser realizada em dois tubos de 5mL contendo EDTA como 
anticoagulante, devidamente identificado e a seguir refrigerado. 
Recomenda-se que os objetos, superfícies ou corpos que possuem as 
amostras de sangue sejam recolhidos se possível, além de realizar esfregaços 
nas formas líquidas ou, se secas, umidificar a região com água estéril, seguida 
de esfregaço. Em ambos os casos aconselha-se esperar secar os esfregaços 
(Figuras 48 e 49) para depois serem embalados em envelope de papel limpo 
(Figura 47), evitando que a umidade facilite o crescimento de bactérias e 
fungos. Amostras de sêmen, de saliva e urina, ou de objetos que os contém, 
podem ser utilizadas e seguem a mesma metodologia descrita anteriormente. 
Tecidos, dentes, ossos e fios de cabelos também podem servir de fonte de 
células para análise de DNA (FBI, 2003). A estocagem do material deve ser em 
refrigerador a 4°C ou em freezer a -20°C, no entanto, para longos períodos, 
estocar a -70 a -80°C (BUTLER, 2005). 
61
 
 
 Figura 46: Amostras de sangue sendo coletadas de um objeto perfuro-
cortante – faca – frequentemente utilizado em agressões físicas e homicídios. 
 
62
 
 
 Figura 47: manipulação de material contendo amostras biológicas com 
luvas. 
 
 
 
 Figura 48: esfregaço bucal utilizado para a coleta de saliva e células 
descamadas da mucosa oral, para a extração de DNA. 
 
63
 
 
 
 Figura 49: Coletor estéril apropriado para coleta de materiais biológicos 
presentes na cena do crime. 
 
 
O armazenamento do material biológico úmido em sacos plásticos 
deve ser de no máximo 2 horas ou, quando possível, permitir que seque antes 
do acondicionamento final. Cada tipo de amostra de material biológico (sangue, 
saliva, osso, dente, etc.) deve ter sua coleta e disposição individualmente 
descrito (Secretaria de Segurança Pública de São Paulo – SSP-SP, 1999; 
INTERPOL, 2001). A degradação do DNA de amostras biológicas, utilizadas 
em investigação criminal, pode ocorrer decorrente de um processo natural de 
exposição ao meio-ambiente. Luz, umidade, temperaturas elevadas, bem como 
contaminações bacterianas ou fúngicas levam à degradação química do DNA 
humano (SCHNEIDER et al, 2004). 
A comissão de DNA da Internacional Society For Forensic 
Haemogenetics – ISFH sugeriu algumas recomendações para a análise de 
DNA pela PCR, incluindo que essa contaminação pode ser evitada, atendendo 
a certos cuidados durante todo o processo de análise de DNA, que vão desde 
64
 
a coleta e armazenamento do material biológico do qual será extraído o DNA, 
até o próprio local de preparação da PCR. As contaminações das amostras 
pelos investigadores e pessoas do laboratório podem resultar em uma incorreta 
interpretação do perfil genético. Dessa maneira, o desenvolvimento e 
cumprimento de normas de procedimentos e treinamentos específicos para o 
exame de DNA tornaram-se imprescindíveis (INTERPOL, 2001). 
Visando o estabelecimento de normas para coleta e exame de 
materiais biológicos para identificação humana, a Secretaria de Segurança 
Pública do Estado de São Paulo (SSP-SP) baixou a Resolução SSP-194, em 2 
de junho de 1999 (São Paulo, 1999): 
 
“Considerando: 
a) a necessidade de normatizar os serviços periciais 
relativos à coleta de materiais biológicos para exames de 
identificação humana, tanto nos locais de crime quanto na 
pessoa humana, viva ou morta; 
b) que os procedimentos a serem seguidos pelos órgãos 
policiais e periciais oficiais devem estar em consonância 
com os ditames da legislação em vigor, e 
c) que é imprescindível a correta preservação das 
amostras para não haver contaminações ou outros 
prejuízos (p. 104)”. 
 
Continuando na mesma Resolução, em seu anexo cita os cuidados que 
devemos ter para a coleta, armazenamento e análise do material biológico para 
a extração de DNA. Os cuidados incluem utilização de luvas descartáveis; 
instrumentos de coleta, armazenamento e análise devem ser estéreis; a 
documentação completa do vestígio eleito para a coleta, incluindo-se 
fotografias da região, tipo de armazenamento, entre outros; o armazenamento 
do material biológico úmido em sacos plásticos deve ser de no máximo 2 horas 
ou, quando possível, permitir que seque antes do acondicionamento final. Cada 
tipo de amostra de material biológico (sangue, saliva, osso, dente, etc.) deve 
ter sua coleta e acondicionamento individualmente descrito. 
 
65
 
10 EXTRAÇÃO DE DNA 
 
 
 
 
 
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários 
fatores, podendo ser influenciados pelas metodologias aplicadas para a sua 
extração. Após a coleta do material biológico, o DNA da amostra deverá ser 
separado de outras substâncias celulares antes de ser examinado. Proteínas 
celulares, contaminações químicas e microbiológicas diminuem o poder 
discriminatório das análises utilizando o DNA (BUTLER, 2005; HOFF-OLSEN 
et al, 1999; JUNG et al, 1991). 
A escolha do uso de diferentes métodos de extração de DNA está 
relacionada ao tipo de material envolvido e influencia diretamente o sucesso da 
análise dos STRs. A maioria dos procedimentos de extração de DNA 
compreende a lise celular, seguida da remoção das proteínas celulares 
precipitadas e por fim a precipitação do DNA com sua final eluição. Existem 
diversos métodos para obtenção de DNA: a extração orgânica, que é a mais 
66
 
tradicional, empregando-se a proteinase K para lise celular e fenol clorofórmio 
para a precipitação das proteínas (Figura 50); a extração pela resina Chelex 
(Figura 51); por FTA (Figura 52); pela sílica; por precipitação salina; e por 
tiocianato de guanidina. Cada uma delas possui suas indicações, vantagens e 
desvantagens (BONACCORSO, 2005; BUTLER, 2005; RAND et al, 1991; 
SALAZAR et al, 1998; HIRATA, 2002). 
 
67
 
 
Figura 50: Esquema da extração de DNA pelo método orgânico. 
68
 
 
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SALIVA PELO MÉTODO 
ORGÂNICO (Anzai et al.; 2001). 
 
A amostra de saliva coletada e colocada em tubo estéril é submetida à 
centrifugação para a separação das células de sua parte aquosa, removendo-
a. As pontas contendo o algodão dos swabs – que contém a saliva coletada 
sobre a pele – foram colocadas em um tubo estéril, sendo imediatamente 
iniciado o processo de extração, sem nenhum preparo prévio. Em seguida, 
adiciona-se 700L do tampão de lise para saliva (10mM TRIS pH8,0; 10mM 
EDTA; 0,1 M NaCl; 2% SDS) e posteriormente 35l de Proteinase K 20mg/mL. 
Após agitação, a tampa do tubo deve ser vedada com Parafilm® e incubada 
por uma noite a 56oC. 
A seguir, a Proteinase K é inativada a 95oC por 10 minutos, 
adicionando-se 700L de fenol tamponado com pH 8,0 e homogeneizando-se 
com movimentos manuais leves por 5 minutos. Centrifuga-se e o 
sobrenadante é transferido para outro tubo, utilizando uma micropipeta com 
ponteira estéril. Acrescenta-se fenol/ clorofôrmio/ álcool isoamílico (25:24:1) 
na mesma quantidade do sobrenadante removido, homogeneiza-se, 
centrifuga-se e remove-se o sobrenadante novamente para outro tubo. 
Adiciona-se ao sobrenadante cerca de 2 ou 3 vezes o volume recuperado, 
álcool 100% e 10% do volume em acetato desódio 5M. Incuba-se durante 
uma noite a -20oC. 
No terceiro dia de extração, centrifuga-se a mistura. Dispensa-se o 
etanol, e ao precipitado adiciona-se 1mL de etanol 70%, homogeneizando-se 
cuidadosamente. Centrifuga-se e novamente é removido o álcool. Seca-se 
totalmente o "pellet". Ressuspende-se o "pellet" com 100L de T.E. (Tris-base 
100mM, pH 7,6; EDTA 10mM, pH 8,0). 
69
 
 
Figura 51: Esquema da extração de DNA pelo Chelex 100®. 
 
70
 
 
 
Figura 52: Esquema da extração de DNA de amostra biológica depositada 
em papel FTA®. 
 
 
71
 
A técnica mais amplamente empregada envolve, em sua primeira fase, 
a lise celular, seguida de desnaturação ou inativação de proteínas. Com 
solventes orgânicos o DNA é posteriormente separado de macromoléculas, 
como as proteínas através de solubilização em água, e em seguida precipitado 
com etanol. Outras metodologias com o mesmo princípio, inclusive kits 
comerciais, podem ser utilizadas para cada tipo de amostra biológica. Há 
diferentes metodologias para a extração de DNA de sangue total (Salazar et 
al., 1998; Schneider, 1998), de esfregaços vaginais e de amostras de sêmen 
(Schneider, 1998), de saliva total e de materiais contendo saliva (Walsh D et 
al., 1992; Sweet et al., 1996; Hochmeister et al., 1998; Anzai et al., 2001, 
Anzai-Kanto, 2005); de dente humano (Oliveira, 2000), de osso (Hagelberg et 
al., 1991; Alves, 2000) (Figura 53); de material parafinado (Mesquita et al., 
2001), tecidos removidos de cadáveres (Hochmeister, 1998) (Figura 51), entre 
outros. 
 
 
 Figura 53: Cadáver em avançado estado de putrefação, submergido 
em mar por aproximadamente 1 mês. O material biológico coletado para a 
extração de DNA foi a cabeça do fêmur e tecido da parte interna do tórax, 
72
 
utilizando a porção interna da amostra para evitar a contaminação do DNA 
externo. 
 
 
 
 
A quantidade, a pureza e a integridade do DNA dependem de vários 
fatores como condições da amostra e da conservação, sendo necessário 
utilizar critérios para escolha da metodologia de extração para cada tipo de 
amostra (HAGELBERG et al., 1991; HOCHMEISTER, 1998; SALAZAR et al., 
1998; SCHNEIDER, 1998; ALVES, 2000; ANZAI et al., 2001; MESQUITA et al, 
2001; OLIVEIRA et al, 2002). 
O DNA pode ser obtido inclusive de células únicas, como as bucais. O 
isolamento de DNA micromanipulado de cada uma das 226 células utilizadas, a 
alteração da concentração de iniciadores, a utilização de AmpliTaqGold® e 
reação de PCR com 34 ciclos, possibilitou que Findlay et al. (1997) obtivessem 
sucesso ao amplificar o DNA de cada uma dessas células. AmpliTaqGold tem 
uma estabilidade à temperatura maior do que outras taqs, como a taq 
polimerase comum. Ao amplificarem individualmente o DNA de cada célula, 
obtiveram amplificação em 91% (206), sendo que em 50% (114) o perfil 
genético (7 loci) foi completo, em 64% (144) amplificou-se 4 a 6 loci. Os 
Extração de DNA Do Sangue (Salazar et al, 1998) 
 
 As amostras de sangue foram submetidas à lise celular com 1000µL 
do tampão Tris-1 (Tris HCl 10mM pH 8,0, KCl 10mM, MgCl2 10mM EDTA 2mM 
pH 8,0) contendo Triton X-100 a 2.5%. Após a centrifugação, os núcleos 
celulares foram lisados com 220µL do tampão Tris-2 (Tris-HCl 10mM pH8,0, 
KCl 10 mM, Mg Cl2 10mM, EDTA 2mM pH 8,0, NaCl 0,4 M) contendo SDS a 
1%. As proteínas foram removidas por precipitação salina com 100% seguindo 
de lavagem etanol 70%, por 3 vezes. Posteriormente o DNA foi ressuspendido 
em 100µL do tampão TE (Tris-HCl 10 mM e 1mM EDTA, pH 8,0) e mantidos a 
–20oC. 
73
 
autores insistem no rigoroso controle da contaminação, posto que mesmo 
tomando esse cuidado em sua pesquisa obtiveram 28% com alelos adicionais 
aos verdadeiros alelos, e 11% somente com alelos adicionais. 
 
 
11 QUANTIFICAÇÃO DE DNA 
 
A quantificação do DNA após a sua extração é importante para o 
aperfeiçoamento da qualidade do produto de DNA resultante da PCR 
(Internacional Society for Forensic Haemogenetics, 1992). O excesso de DNA 
em uma amostra de PCR poderá saturar a reação, fazendo com que apareça 
artefatos de técnica e amplificações inespecíficas que podem dificultar a sua 
análise. Já a sua falta poderá acarretar a perda de um dos alelos, quando o 
indivíduo é heterozigoto, ou mesmo na não amplificação dos mesmos (Butler, 
2005). 
A qualidade e quantidade de DNA devem ser examinadas após a 
extração, além de verificar a possibilidade de degradação (JUNG et al, 1991; 
HOFF-OLSEN et al, 1999). O DNA pode ser quantificado por 
espectrofotometria em espectrofotômetro (Figura 54 e 55) a 260 nm, sua 
pureza pela relação 260/280 nm e a sua integridade pode ser avaliada em géis 
de agarose. No entanto, esses métodos avaliam a quantidade geral de DNA, 
seja ele humano ou de outro tipo. Quando se refere às amostras utilizadas em 
investigação criminal ou passíveis de degradação e contaminação, recomenda-
se a utilização da quantificação de DNA de humano (INTERNACIONAL 
SOCIETY FOR FORENSIC HAEMOGENETICS - ISFH, 1992). 
 
74
 
 
 Figura 54: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de ácidos 
nucléicos. 
 
 Figura 55: Espectrofotômetro utilizado para quantificação de DNA 
que utiliza apenas 1μL de produto de extração de DNA. 
 
Essa quantificação pode ser realizada por hibridização de uma sonda 
utilizando-se um determinado lócus (D17Z1) em uma amostra de DNA 
75
 
imobilizada de uma membrana de náilon – dot blot (WALSH et al., 1992; 
ANDERSEN, 1998), e por kits comerciais como, por exemplo, o AluQuant™ 
human DNA quantitation system (WAYE et al, 1989; HOFF-OLSEN et al, 1999; 
MANDREKAR et al., 2001; SCHNEIDER et al, 2004; BUTLER, 2005). Apesar 
dessas técnicas serem mais complexas e caras que a espectrofotometria, elas 
quantificam somente o DNA humano, pois possuem sondas específicas para o 
mesmo. Tal característica pode ser imprescindível em casos forenses que haja 
a possibilidade de contaminação de DNA externo. No entanto, muitas vezes 
não é utilizada, pois há a necessidade de 5 a 10μL de produto de DNA, o que 
muitas vezes não é obtido. 
Uma metodologia que está substituindo as outras técnicas de 
quantificação por utilizar pouca quantidade de DNA, ser específico para DNA e 
inclusive possibilitando verificar a presença de inibidores da enzima polimerase 
é a quantificação de DNA por PCR em tempo real. Principalmente em casos 
forenses que existe ínfima quantidade de DNA, está sendo altamente 
recomendada. Consiste no emprego de marcadores específicos marcados com 
fluorescência que são utilizados para a amplificação de regiões do genoma 
humano. No entanto, para fins didáticos, será explicado após a explicação da 
reação em cadeia pela polimerase (PCR), pois envolve a amplificação do DNA. 
A amostra biológica sendo preservada adequadamente e realizada em ótimas 
condições de extração e quantificação obtém-se quantidades maiores ou 
menores de DNA (Tabela 3). 
Tabela 3: Quantidade de DNA extraído de diversos tipos de material biológico 
(Butler, 2005). 
 
Tipo de amostra Quantidade de DNA 
Sangue total 20000 ~ 40000 ng/mL 
Mancha de sangue 250 ~500 ng/cm3 
Líquido seminal 150000 ~ 300000 ng/mL 
Esfregaço de material vaginal pós-
coito 
10 ~3000 ng/esfregaço 
Fio de cabelo com bulbo 1 ~750 ng/fio 
Pêlo com bulbo 1 ~10 ng/pêlo 
76
 
Saliva total 1000 ~10000 ng/mL 
Esfregaço bucal 100 ~1500 ng/esfregaço 
Urina 1 ~20 ng/mL 
Osso 3 ~10 ng/mg 
Tecido 50 ~500 ng/mg 
 
 
 
 
 
77
 
12 REAÇÃO DE AMPLIFICAÇÃO PELA POLIMERASE - PCR 
 
 
Uma tecnologia que revolucionou o campo da biologia molecular foi a 
PCR, tendo como seu inventor Kary Mullis (Figura 56), recebendo o Prêmio 
Nobel por essa descoberta (INTERPOL, 2001). A PCR consiste na 
amplificação seletiva de uma sequência-alvo de DNA específica a partir de uma 
coleção heterogênea de DNA, empregando-se um par de oligonucleotídeos 
iniciadores que são complementaresa uma certa extensão em ambas as fitas 
do DNA a ser amplificado (Saiki et al, 1985). Várias sequências de iniciadores 
de diversas regiões do DNA humano já foram estabelecidas possibilitando a 
amplificação de seus respectivos STRs nas reações de PCR (Polymeropoulos 
et al., 1991; Polymeropoulos et al., 1992; Nishimura & Murray, 1992; Li et al., 
1993; Moller et al., 1994; Urquhart et al., 1994; Urquhart et al., 1995; Jin et al., 
1997). A sequência-alvo de DNA, cuja continuação é originalmente conhecida, 
é denominada DNA molde. 
 
 
 Figura 56: Kary Mullis inventou a PCR, permitindo que sejam 
amplificados in vitro 
fragmentos de moléculas 
de DNA. 
 
78
 
A PCR envolve três etapas: desnaturação, hibridização e extensão. A 
desnaturação ocorre quando a molécula de DNA é aquecida acima da 
temperatura de 90°C, na qual as pontes de hidrogênio da dupla hélice se 
rompem, ocorrendo a separação das cadeias complementares. Os iniciadores 
se ligam especificamente às sequências de DNA complementares no processo 
de hibridização, mediante uma temperatura que pode variar de 45 a 72°C e 
deve ser previamente otimizada, estando relacionada à temperatura de melting 
(Tm), que é medida através de uma fórmula específica que envolve a 
quantidade de C e G em sua sequência. 
A prevalência de ligação dos iniciadores ocorre pela sua alta 
concentração no meio da reação. A enzima termoestável denominada DNA 
polimerase direciona o posicionamento dos precursores do DNA – dNTP – 
iniciando a síntese de novas fitas de DNA. Com um novo aumento de 
temperatura, a enzima DNA polimerase catalisa a reação, incorporando o 
nucleotídeo na posição terminal do iniciador, complementando as bases do 
DNA molde, promovendo a extensão da fita (Saiki, 1985, Sambrook et al, 2001) 
(Figura 57, 58 e 59). 
 
 
79
 
 
 Figura 57: Esquema da reação de PCR, com visualização dos 
fragmentos. 
80
 
 
 
 Figura 58: Representação esquemática da PCR com detalhamentos 
dos reagentes que a envolvem. 
 
 
81
 
 
 
 Figura 59: Esquema representativo de exemplo de ciclagem para 
uma PCR convencional. 
 
 
A PCR é realizada em equipamentos denominados termocicladores 
que controlam e variam a temperatura automaticamente para cada programa 
pré-estabelecido pelo pesquisador (Figura 60). 
 
82
 
 
 
 Figura 60: Exemplo de termociclador utilizado para a PCR. 
 
 
A reação de PCR é preparada utilizando-se diversos reagentes que 
devem possuir concentrações específicas para cada tipo de análise. 
Atualmente, existem diversos kits de PCR contendo todos os reagentes pré-
padronizados que facilitam a utilização da PCR em laboratórios forenses. No 
entanto, é de grande importância que o pesquisador entenda todo o processo 
de amplificação e seus reagentes. O reagente que vai direcionar a otimização 
de cada reação será o primer ou iniciador, que flanqueará a região do DNA a 
ser copiada, sendo um oligonucleotídeo sintetizado quimicamente e é 
adicionado à reação em altas concentrações (Butler, 2005). 
 
 
83
 
Tabela 4: reagentes utilizados em uma PCR com a respectiva concentração 
ótima. 
Reagente Concentração ótima 
Tris-HCl, pH 8,3 (25°C) 10 a 50 mM 
Cloreto de Magnésio 1,2 a 2,5 mM 
Cloreto de Potássio 50 mM 
Desoxirribonucleotídeos 
trifosfatados (dNTPs) 
200 μM de cada 
nucleotídeo(dATP, dTTP, 
dCTP, dGTP) 
DNA polimerase termoestável 0,5 a 5 U 
Soro de Albumina Bovina (BSA)* 100 μg/mL 
Primers ou Iniciadores 0,1 a 1,0 μM 
DNA 1 a 10 ng de DNA 
* Não é utilizado em todas as reações 
 
 
As ciclagens da PCR variam de acordo com os reagentes empregados, 
principalmente com a enzima polimerase, que altera a temperatura de 
extensão, os primers, que muda a temperatura de hibridização; e com a 
amostra de DNA, pois apresenta-se em pouca quantidade, podendo aumentar 
o número de ciclos. Só para ter uma idéia da variação das condições de 
ciclagem para kits diferentes utilizados em DNA forense foram colocados na 
tabela 5 exemplos de parâmetros de duas empresas distintas. 
 
 
84
 
Tabela 5: Parâmetros utilizados para a ciclagem da PCR em kits de PCR 
multiplex comercialmente disponíveis no mercado, e que são os mais utilizados 
mundialmente. 
Passo do protocolo AmpFlSTR® kits 
(Applied 
Biosystems) 
GenePrint® STR Kits 
(Promega Corporation) 
Desnaturação inicial 95°C / 11 
minutos 
95°C / 11 minutos 
Quantidade de ciclos 28 ciclos 30 ciclos 
Desnaturação 94°C / 1 minuto 94°C / 30 segundos 
(ciclo 1 a 10) 
90°C / 30 segundos 
(ciclo 11 a 30) 
Hibridização 59°C / 1 minuto 60°C / 1 minuto 
Extensão 72°C / 1 minuto 70°C / 1 minuto 
Extensão final 60°C / 60 
minutos 
60°C / 30 minutos 
Final 10°C até sua 
remoção do 
equipamento 
4°C até sua remoção 
do equipamento 
 
 
As vantagens da utilização da PCR na ciência forense são a sua 
sensibilidade, pois é capaz de amplificar sequências a partir de quantidades 
ínfimas da sequência-alvo de DNA e até mesmo do DNA de uma única célula; 
e sua robustez, permitindo a amplificação de sequências específicas a partir de 
material biológico degradado (ISFH, 1992, INTERPOL, 2001; Sambrook, 2001). 
No entanto, tal eficiência e sensibilidade implicam também na atenção aos 
cuidados para evitar-se a contaminação de DNA externo, que pode ocorrer 
durante todo o processo de análise do DNA (Internacional Society For Forensic 
Haemogenetics – ISFH, 1992). 
Kwok & Higuchi (1989) elucidaram vários cuidados pertinentes à 
preparação do material para a PCR, objetivando evitar a contaminação das 
amostras: 
85
 
 
 
 
 
 
 
A preservação do DNA forense para a amplificação pela PCR também 
envolve o controle da temperatura, da umidade, o valor do pH, a presença de 
ácido húmico e fúlvico e microorganismos. A temperatura baixa pode preservar 
o DNA, seja ele datado de milhares de anos, ou de amostras forenses, assim 
como o DNA pode ser mais bem preservado em ambientes secos e com o 
mínimo crescimento de microorganismos (Figura 61). A presença de ácido 
fúlvico e húmico pode comprometer a amplificação pela PCR pelo fato de inibir 
os efeitos da enzima polimerase utilizada na reação. O pH neutro ou levemente 
alcalino na amostra também ajuda na preservação do DNA. Os 
 
 o isolamento físico da área de preparação da PCR e de seus produtos 
utilizados; 
 não levar para a sala de PCR qualquer tipo de material biológico ou produto 
de DNA. 
 autoclavar a água deionizada e outras soluções, com exceção dos iniciadores, 
dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), tampão comercial e Taq DNA 
polimerase; 
 aliquotar reagentes; 
 utilização de luvas descartáveis que devem ser constantemente trocadas; 
 ter cuidado ao abrir os tubos pois parte do produto da PCR pode estar na sua 
tampa, possibilitando o seu desperdício; 
 misturar os reagentes da PCR em um único tubo, aliquotá-los em tubos 
individuais e por último adicionar o DNA individualmente em cada tubo; 
 e finalmente a escolha correta de controles negativos e positivos, que podem 
auxiliar na detecção de contaminantes. 
Kwok & Higuchi (1989) 
86
 
microorganismos podem metabolizar o DNA por completo, se em grande 
quantidade (Burger et al., 1999). 
 
 
 
 Figura 61: Esqueletos encontrados em uma vala e que foram utilizados 
na Herzegovina para a identificação humana de indivíduos mortos durante a 2° 
Guerra Mundial. 
 
 
Regiões específicas de amplificação são escolhidas de acordo com o 
objetivo da análise. Atualmente, as regiões mais utilizadas são as STRs para a 
identificação humana. Edwards et al (1991) relata que as melhores STRs 
empregadas na identificação humana são aquelas com maior polimorfismo 
(maior número de alelos), menor tamanho (100 a 200 pares de bases), elevado 
índice de discriminação e heterozigose e baixa frequência de mutações. Esses 
dados são levantados por estudos populacionais de regiões distintas, que 
serão descritosposteriormente. 
A PCR permite que mais de uma região possa ser copiada 
simultaneamente se adicionado mais de um iniciador sense e antissense em 
87
 
uma única reação. A amplificação simultânea de duas ou mais regiões de DNA 
é conhecida por PCR multiplex (Figura 62). Para essa reação a temperatura de 
hibridização dos iniciadores deve ser compatível e a complementaridade 
excessiva das regiões deve ser criteriosamente analisada, para prevenir a 
formação de dímeros de iniciadores que não hibridização com o DNA 
(EDWARDS & GIBBS, 1994). 
 
 
 
Figura 62: Kit Multiplex de duas empresas distintas comercialmente 
disponíveis para a realização de PCR em uma única reação. 
 
 
Há diversas vantagens da PCR multiplex para DNA forense: 1) diminui 
o tempo de preparo e a quantidade de reagentes utilizados; 2) diversos loci 
podem ser amplificados em uma única reação, empregando-se pouca 
quantidade de DNA, aumentando a chance de sua amplificação. Atualmente há 
88
 
diversos conjuntos multiplex disponíveis no comércio, facilitando a 
padronização e comparação dos resultados entre os laboratórios forenses 
(LEVEDAKOU et al., 2002; WALLIN et al., 2002; KRENKE et al, 2002; 
COLLINS et al, 2004) (Quadro 1). 
 
Quadro 1 - Os loci mais utilizados no FBI e INTERPOL distribuídos 
segundo os kits comerciais multiplex: 
Fornecedor 
Applied Biosystems 
http://home.appliedbiosystems.com 
Promega 
http://www.prome
ga.com 
 
PRODUTO 
 
LÓCUS 
AmpFLSTR® Power
-Plex® 
Power-
Plex® 16 
SGM 
Plus 
Profiler Profiler 
Plus 
Cofiler Identifier 
D21S11 (1)(2) X X X X 
FGA (1)(2) X X X X X 
VWA (1)(2) X X X X X X 
THO1 (1)(2) X X X X X X 
D3S1358 
(1)(2) 
X X X X X X 
D8S1179 
(1)(2) 
X X X X 
D18S51 (1)(2) X X X X 
D16S539 (2) X X X X X 
TPOX (2) X X X X X 
CSF1P0 (2) X X X X X 
D13S317 (2) X X X X X 
D7S820 (2) X X X X X X 
D5S818 (2) X X X X X 
D19S433 (3) X X 
D2S1338 (3) X X 
Penta D (3) X 
Penta E (3) X 
Amelogenina 
(1) 
X X X X X X X 
(1) ISSOL – Conjunto Padrão de Loci da INTERPOL, idêntico Conjunto 
89
 
Padrão Europeu - ESS, com uma exceção: para o ISSOL a amelogenina é 
opcional 
(2) Os 13 lócus do Sintema de índice de Combinação de DNA - CODIS do FBI 
(3) Lócus que fazem parte do grupo dos mais utilizados mundialmente 
segundo a INTERPOL 
 
Fonte: . 
 Outra técnica que deve ser comentada seria a utilização da PCR em 
tempo real, que, no momento, está sendo aproveitada em ciência forense para 
determinar a quantidade de DNA humano viável para a amplificação. A PCR 
em tempo real amplia regiões específicas de DNA. Diferencia-se da PCR 
tradicional, pois possui sondas marcadas com fluoróforos proporcionando 
detecção em tempo real dos fragmentos amplificados, sendo simultaneamente 
quantificados (Figura 63). Dessa maneira, não há necessidade da utilização de 
géis e análise por Southern Blot
 
como nas outras técnicas quantitativas 
descritas anteriormente (ANDREASON, 2003). 
 Entretanto, para a realização da PCR em tempo real é necessário 
equipamento específico e sondas adequadas. O DNA humano pode ser 
especificamente quantificado para posterior análise do perfil genético pelas 
STRs, assim como verificar a presença ou não de
 
inibidores da enzima 
polimerase (APPLIED BIOSYSTEMS, 2006).
 
 
 
 
 Figura 63: Esquema representativo da PCR em tempo real, na qual 
sondas com fluorescências são utilizadas para a amplificação de uma região 
90
 
específica de DNA. Após a hibridização da sonda com a molécula de DNA, a 
enzima taq polimerase atua amplificando a região alvo, liberando um fluoróforo 
que será analisado em tempo real pelo equipamento termociclador, sendo 
conectado a um computador que através de programas específicos realiza a 
interpretação dos dados. 
 
 
 
 
 
 
13 ELETROFORESE E DETECÇÃO DOS FRAGMENTOS DE DNA 
 
 
Os fragmentos de DNA amplificados por PCR são identificados após a 
eletroforese em gel de poliacrilamida, seguido da coloracão com prata, ou pela 
detecção de sinal fluorescente, na qual os iniciadores utilizados no PCR são 
marcados com fluorocromos, possibilitando a análise por sequenciador 
automático (Gill, 1992; Sullivan et al, 1992; Frégeau e Fourney, 1993). 
A eletroforese é uma metodologia amplamente empregada para a 
separação, isolamento, análise e manipulação dos ácidos nucléicos. Os ácidos 
nucléicos possuem uma carga geral total negativa, devido aos seus 
grupamentos fosfato do arcabouço, consequentemente, quando aplicados em 
um gel de agarose ou poliacrilamida, eles migrarão em direção ao ânodo em 
um campo elétrico (Aaji e Borst, 1972; Southern, 1979). Em condições 
apropriadas de tampão, voltagem e miliamperagem, os fragmentos pequenos 
migrarão mais facilmente do que os maiores (Figura 64 e 65). 
91
 
 
 Figura 64: Fragmentos de DNA carregados negativamente migram 
ao pólo positivo mediante a presença de um campo elétrico específico. 
 
92
 
 
 Figura 65: Esquema da corrida de eletroforese com visualização dos 
fragmentos de DNA e das partículas de gel e dos poros, seguida de imagem 
dos fragmentos de DNA corados com brometo de etídeo exposto a luz 
ultravioleta. 
 
 
 A variação do tipo e concentração do gel propicia diferentes 
características de separação, permitindo distintas resoluções e análises. Em 
caracterização de vínculo genético utiliza-se eletroforese em gel de 
poliacrilamida ou eletroforese capilar para a análise das imagens. Em inclusão 
ou exclusão de paternidade, compara-se os alelos presentes no filho com o do 
suposto pai, sendo que um seria o alelo obrigatório materno e o outro paterno 
(Figura 66). O mesmo acontece em inclusão de suspeitos de um crime, no qual 
compara-se o DNA encontrado na vítima, como ocorre com marcas de mordida 
ou presença de sêmen, ou na cena de um crime. Pode ocorrer uma mistura de 
amostras biológicas contendo DNA da vítima e do agressor. Dessa maneira, 
confronta-se o DNA da vítima com o dos suspeitos e, sucessivamente, com o 
DNA das amostras presentes na cena do crime (Figura 67). Tais análises são 
93
 
realizadas em pelo menos 13 STRs distintos (Jobim et al, 2006; Budowle & 
Moretti, 1999; INTERPOL, 2001; Secretaria Nacional de Segurança Pública - 
SENASP, 2006). 
 
 Figura 66: Esquema representativo da análise de uma eletroforese 
em gel de poliacrilamida corado com prata contendo DNA de amostras 
biológicas da mãe, do filho e do suposto pai, de um STR amplificado pela PCR 
analisados juntamente com marcadores alélicos. 
 
 Figura 67: Esquema representativo da análise de uma eletroforese 
em gel de poliacrilamida corado com prata contendo DNA de amostras 
biológicas da vítima, do material biológico coletado de uma marca de mordida, 
94
 
e de três suspeitos distintos de um STR amplificado pela PCR, analisados 
juntamente com marcadores alélicos. 
 
Diversos tipos de equipamentos podem ser utilizados para a sua 
realização, podendo ser horizontais e verticais, grande e pequenos, sendo sua 
indicação própria para cada tipo de procedimento que queira realizar. 
Generaliza-se da seguinte maneira: 
 
- Cubas horizontais: gel de agarose 
- Cubas verticais: gel de poliacrilamida 
 
Géis de agarose e poliacrilamida podem ser feitos de uma variedade 
de formas, tamanhos e porosidades e podem ser corridos em um número 
diferente de configurações. As escolhas desses parâmetros dependem 
primeiramente no tamanho dos fragmentos a ser separados. Géis de 
poliacrilamida são mais eficientes em separações de pequenos fragmentos de 
DNA (5-500pb), que é o caso da análise do DNA forense. O poder de resolução 
é extremamente alto, e fragmentos de DNA que diferem em tamanho por pouco 
tão pouco quanto 1pb (par de base) em comprimento ou 0,1% de sua massa 
podem ser separados