2. ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS

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ANÁLISE DE AMINOÁCIDOS 
PI ácido 
+ 
básico 
- neutro 
-COOH -COO 
-NH3 
PI = 4.6 
PI =7.1 
 
 PI = 9.6 
H + 
+ 
- 
Princípios Básicos da Cromatografia de Troca Iônica 
Adsorção 
Eluição 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
Moléculas com a 
mesma carga, ou sem 
carga, não interagem 
com a resina 
Adição de sal ao tampão 
resulta em competição entre 
os íons em solução e as 
moléculas adsorvidas na 
resina 
H + 
-NH2 
+ Na+Cl- 
Carga em 
 pH 7.0 
+ 
_ 
+ 
Aa 
Cromatografia por troca iônica 
• Polímero (suporte) carregado 
negativamente 
– Aas positivos ligam ao 
polímero e demoram mais 
para serem eluídos da coluna 
• Polímero (suporte) carregado 
positivamente 
– Aas ligam ligam ao polímero e 
demoram mais para serem 
eluídos da coluna 
 
+ + 
0. 10 M 
0. 15 M 
0. 20 M 
Eluição NaCl 
_ 
= 
= 
_ 
+ 
+ + 
+ + 
Carboximetil~celulose 
(trocadora de cátions) 
Dietilaminoetil~celulose 
(trocadora de ânions) 
+ 
(-) 
(-) 
(-) 
+ 
+ + 
_ 
= 
= 
_ (-) 
Não retidas 
(+) 
(+) 
(+) 
(+) 
0. 10 M 
0. 15 M 
0. 20 M 
Eluição NaCl 
Não retidas 
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica 
Cromatografia de Partição 
• 
Diferença de solubilidade dos compostos em 
solventes de grau de hidrofobicidade diferentes 
• 
Moléculas Pequenas: Aminoácidos e Peptídeos 
Açúcares, Lipídeos, Outros 
- Amostra se deslocará 
acompanhando a Fase Móvel 
Amostra não se deslocará 
acompanhando a Fase Estacionária 
SUPORTE: 
PAPEL PAPEL 
• Fase Estacionária: Aquosa 
(Papel) (H 2 O na 
celulose) 
• • Fase Móvel : Fase Móvel : Suporte Orgânicos 
(Hidrofóbicos) 
SUPORTE: 
GEL DE SÍLICA GEL DE SÍLICA 
• Fase Estacionária: Hidrofóbica 
(Sílica) 
• • Fase Móvel : Fase Móvel : Aquosa 
(H 2 O) 
CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA 
AMOSTRAS AMOSTRAS 
DUAS POSSIBILIDADES 
FASE FASE 
MÓVEL MÓVEL 
(DESLOCAMENTO 
POR CAPILARIDADE ) 
FASE FASE 
ESTACIONÁRIA ESTACIONÁRIA 
(SUPORTE SÓLIDO) 
X 
ASCENDENTE DESCENDENTE 
Cuba de vidro 
Solvente 
Suporte 
Frente do 
Solvente 
Papel 
Suporte 
Poço do solvente 
Solvente 
Amostra 
Amostra 
distância de migração da substância 
distância de migração do solvente 
Para um dado sistema de Para um dado sistema de 
solvente e tipo de suporte, solvente e tipo de suporte, 
cada substância cada substância 
apresenta um valor de apresenta um valor de 
R R f f característico característico 
R f = 
Cromatografia de Partição em Papel 
ELETROFORESE ELETROFORESE 
1. pH / tampão 
2. Suporte 
- papel : corrente alta (calor) 
uso para peptídeos e aminoácidos 
- agarose : ácidos nucléicos 
Imunoeletroforese 
Proteínas nativas 
- poliacrilamida : proteínas 
ac. nucleicos 
não desnaturante ou nativa 
desnaturante e redutor 
peso molecular 
composição de subunidades 
focalização isoelétrica: PI 
bidimensional 
CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO 
SUPORTE X pH MEIO 
+ + 
+ + 
+ + 
+ + 
D T D T 
ELETROFORESE 
pH= 6,9 
aminoácidos Aminoácidos 
Os Aminoácidos 
Os Aas 
dos Aas é 
 +H3N- C -H 
COOH 
R 
 +H3N- C -H 
COO- 
R 
 H2N- C -H 
COO- 
R 
Íon Dipolar 
A  0 
pI 
Íon Positivo 
A+ 
pH < pI 
Íon Negativo 
A- 
pH > pI 
Separação dos Aas por Eletroforese 
Peptídeos e proteínas 
PEPTÍDEOS 
• União de no mínimo dois 
aminoácidos; 
• Através de ligação covalente entre o 
grupo -carboxílico de um 
aminoácido com o grupo -amino 
de outro. 
• Liberação de uma molécula de H2O 
Polipeptídeo 
>Insulina [Homo sapiens] 
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN
QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA
LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY
CN 
Ligação 
 peptídica 
 Reação de 
 condensação 
2 aminoácidos livres 
Interação para 
formação da ligação 
peptídica 
Formação da 
ligação peptídica 
com liberação de 
H2O 
Formação da ligação peptídica 
+ 
Configuração cis trans 
H3 
+ 
H3 
+ - 
 - 
Ligação peptídica 
Ligação peptídica 
 
 A ligação peptídica é 10% mais curta que 
uma ligação C-N comum devido ao 
caráter de ressonância que passa a 
existir na ligação 
 
 A ligação peptídica é muito rígida o que 
contribui para a redução dos graus de 
liberdade da cadeia polipeptídica 
+ 
Configuração cis trans 
H3 
+ 
H3 
+ - 
 - 
Ressonância da ligação peptídica 
Componentes dos peptídeos 
• Espinha dorsal - formada pela união dos aminoácidos 
 - presença da ligação peptídica 
•Grupamento N-terminal (NH3+ livre) 
 C- terminal (COO- livre) 
•Resíduos de aminoácidos 
•Radicais dos aminoácidos - ligados a espinha dorsal 
 - radicais são responsáveis pelas 
 propriedades dos peptídios 
 O 
• 2 aminoácidos.....................dipeptídios 
• 3 aminoácidos.....................tripeptídios 
• 4 aminoácidos................tetrapeptídios 
• + de 10 aminoácidos........polipeptídios 
Nomenclatura 
 Glicina 
Nomenclatura dos peptídeos 
GLICIL – ASPARTIL - LISINA 
+H3N - CH - CO - HN - CH - CO - HN - CH – COO
-
_ 
H 
 COOH 
 
 CH2 
 
 NH2 
 
(CH2)4 
Aspartato Lisina 
• Glutationa 
• Vasopressina 
• Ocitocina 
• Glucagon 
Peptídeos de 
importância biológica 
Peptídeos de importância biológica 
 Glutationa 
-glutamil cistenil glicina 
•Ação antioxidante 
•Proteção contra efeitos tóxicos 
 dos radicais livres 
H2O22H2O 
Glutationa 
peroxidase 
Reação envolvendo a glutationa 
H H 
Peptídeos de importância biológica 
Vasopressina Ocitocina 
 
Cys 
 
 
 
 Cys 
 
 
 Phe 
 
 Arg 
 
 
 
 
Cys 
Cys 
 
 
Ile 
 
 
 Leu 
Peptídeos de importância biológica 
•Vasopressina- hormônio antidiurético 
•Ocitocina- hormônio que atua no sistema 
reprodutor feminino 
Receptores V1 -leito vascular - vasoconstritor 
Receptores V2- túbulos renais - antidiurético 
Estimula a freqüência e a amplitude das contrações da 
musculatura uterina no fim da gestação 
Desempenha um papel durante a lactação 
Peptídios de importância biológica 
Glucagon 
•hormônio peptídico - 29 Aa 
•produzido pela células  das ilhotas do pâncreas 
EFEITOS FISIOLÓGICOS  Visam  a glicemia 
Degradar o glicogênio 
Sintetizar glicose 
Estimular a liberação de ác. graxos do tecido adiposo 
ESTRUTURA 
 
 PRIMÁRIA 
 
 DA 
 
 INSULINA 
Peptídeos tbm são ionizáveis 
• Ou seja, em 
determinadas 
faixas de pH, tem 
sua estrutura 
“modulada”  
reflete em sua 
atividade biológica