Labiocel 2002 - Manual de técnicas em histologia e biologia celular - USP

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LABIOCEL 1 
 
 
 
 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
 
FACULDADE DE MEDICINA 
 
 
 
 
 
MANUAL DE TÉCNICAS EM HISTOLOGIA E BIOLOGIA CELULAR DO 
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR DA FACULDADE DE MEDICINA DA 
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
 
 
 
 
 
 
 
CONSOLIDAÇÃO DOS PROCEDIMENTOS 
 
 
 
 
 
 
2002 
 
 
 
 
 
LABIOCEL 2 
ÍNDICE GERAL 
 
Apresentação 
Protocolo para obtenção e fixação de material a ser 
processado no Laboratório de Biologia Celular 
 
I. Preparo de soluções 
 1. Cálculos 
 2. Instruções gerais 
 3.Soluções mais usadas 
II. Tampões 
III. Microscopia de luz 
 1. Técnicas de Fixação 
 2. Descalcificação 
 3. Inclusão em Parafina 
 4. Microtomia 
 5. Preparação de lâminas e colagem de cortes 
 6. Digestões enzimáticas 
 7. Colorações (técnicas de uso corrente) 
IV. Métodos histoquímicos 
 1. Metais e ânions 
 2. Detecção de radicais químicos em proteínas 
 3. Lípides 
 4. Polissacarídeos 
 5. Ácidos Nucleicos 
 6. Grânulos citoplasmáticos 
 7. Fibras da matriz extracelular 
LABIOCEL 3 
V. Historesina 
VI. Processamento de Material para Microscopia Eletrônica 
de Transmissão 
VII. Uso do Microscópio Eletrônico 
VIII. Revelação e Ampliação de Micrografias 
IX. Arquivos e Registros no Laboratório de Biologia 
Celular 
X. Guia de Trabalhos Práticos 
 
 
 
LABIOCEL 4 
 
Apresentação 
 
 
 Este texto não pretende ser enciclopédico; assim reune, de forma sistemática, a descrição 
de apenas aqueles procedimentos que são utilizados rotineiramente no Laboratório de Biologia 
Celular (LIM/59) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São 
Paulo. 
 
 Levou-nos a tomar a iniciativa de redigir este manual o fato de que os muitos profissionais 
das diversas áreas de saúde que fazem estágios no nosso Laboratório utilizam grande parte do seu 
tempo para copiar nos seus cadernos pessoais as descrições dos procedimentos que utilizamos 
rotineiramente e nos quais solicitaram ser treinados. Com o objetivo de que possam aproveitar o 
estágio mais racionalmente, deliberamos que seria mais apropriado fornecer a eles um texto que 
reúna a descrição de todas as técnicas e assim lhes permita concentrar-se preferencialmente no 
desenvolvimento de habilidades em lugar de desperdiçar tempo em longas sessões de transcrição 
manuscrita de receitas. 
 
 Sugere-se ao leitor que, ao consultar o texto na busca de uma informação, tenha o cuidado 
de ler toda a seção do capítulo correspondente. No processo de redação tentou-se evitar 
repetições; assim, pode existir alguma informação essencial em itens complementares, logo acima ou 
abaixo do assunto procurado. 
 
 Esta versão preliminar certamente poderá ser aperfeiçoada com o tempo, através da 
experiência do seu uso e das sugestões que vierem, tornando-a mais sucinta e de melhor 
apresentação. Assim, esperamos contribuições para seu aprimoramento. 
 
 
 Profa. Dra. Elia Garcia Caldini 
 Chefe do Laboratório de Biologia Celular 
 
 
PROTOCOL 1 
 
PROTOCOLO PARA OBTENÇÃO E FIXAÇÃO DE MATERIAL A SER 
PROCESSADO NO LABORATÓRIO DE BIOLOGIA CELULAR 
 
CUIDADOS: 
Tanto para microscopia de luz quanto para microscopia 
eletrônica, deve-se tomar cuidado com: 
1) não deixar o material secar enquanto está sendo 
recortado. 
2) usar sempre uma gilete nova para recortar o material. 
3) o volume do fixador deve ser, pelo menos, 20 vezes 
maior que o volume do fragmento a ser fixado. 
 
1. MICROSCOPIA DE LUZ 
 
O material deverá ser fixado em paraformaldeído a 4% em 
tampão fosfato. Este fixador poderá ser obtido no 
Laboratório de Biologia Celular. 
O material deverá ter, pelo menos um dos lados, com, no 
máximo, 3 mm de espessura, podendo ter a forma de um 
paralelepípedo. Assim, o fixador poderá penetrar no 
interior do fragmento. 
O material deve ser deixado no fixador por, no mínimo, 24 
horas e, no máximo, 48 horas, devendo ser então colocado 
no álcool 70 ou ser trazido para o Laboratório de Biologia 
Celular para ser processado. 
 
PROTOCOL 2 
2. MICROSCOPIA ELETRÔNICA 
 
O material deverá ser fixado em glutaraldeído a 2% em 
tampão fosfato 0,15M em dois frascos, sendo que, em um 
deles, deve-se dissolver ácido tânico 0,1% no 
glutaraldeído. 
O glutaraldeído deve ser guardado congelado até a hora da 
cirurgia. Na hora de usar, em um dos frascos colocar o 
ácido tânico pesado na quantidade apropriada e, antes de 
colocar o glutaraldeído, etiquetar os frascos 
GLUTARALDEÍDO e GLUTARALDEÍDO COM ÁCIDO TÂNICO. 
Pouco antes de usar, descongelar o glutaraldeído apenas 
com o calor da mão e colocá-lo, na quantidade apropriada 
nos frascos. 
O material deve ter, pelo menos um dos lados, com, no 
máximo, 1 mm de espessura. Aconselha-se a fazer com forma 
de um paralelepípedo de 10 mm x 1 mm x 1 mm. 
A fixação deve durar 2 horas. Deve-se anotar a hora em que 
o material foi colocado no fixador e entregá-lo no 
Laboratório de Biologia Celular antes de completar o tempo 
de fixação; se isto não for possível, deixar o material na 
geladeira (não no congelador) e entregá-lo ao Laboratório 
o quanto antes. Isto é essencial, pois cada minuto a mais 
no fixador contribui para piorar a qualidade do material. 
 
Entrar em contato conosco pelo telefone (852.2188 ou 
851.4011 ramal 241) para combinar horário de entrega. 
PROTOCOL 3 
 
PREP-SOL 1 
I. PREPARO DE SOLUÇÕES 
 
1. CÁLCULOS 
 
1.1. CÁLCULO DA NORMALIDADE DE UM LÍQUIDO (ml/l) 
 
 
 PESO MOLECULAR 
1N= ------------------------------------- 
 VALÊNCIA x PESO ESPECÍFICO x concent. 
 (densidade) (%) 
 
Ex.: Ac. Sulfúrico: 
 98,078 
 1N = ------------------ = 28,032 ml/litro 
 2 x 1,83 x 0,96 
 
 
 
1.2. CÁLCULO DA MOLARIDADE 
 
 1M = 1 mol/l = P.M./1 litro 
 
 
1.3. CÁLCULO PARA DILUIÇÃO DE SOLUÇÕES 
 
Ex: para obterem-se 100 ml de solução 0.15M a partir de 
uma solução estoque 1M. 
 Deve-se, primeiro, dividir a molaridade da solução 
estoque pela molaridade da solução desejada. O resultado 
representa o número de diluições. 
 
 1M/0.15M = 6.66 
 
Em seguida, deve-se dividir o volume desejado pelo número 
de diluições. 
 
 100 ml/6.66 = 15,01 
 
Portanto, necessita-se de 15,01 ml da solução estoque 1M e 
84,99 ml de água para obter-se 100 ml da solução a 0.15M. 
PREP-SOL 2 
2. INSTRUÇÕES GERAIS 
 
- Em qualquer solução que envolva a mistura de ácido e 
água, deve-se sempre ter o cuidado de jogar o ácido na 
água. 
 
- As diluições não alteram o pH de uma solução; o que se 
altera quando se dilui uma solução é a sua molaridade. 
 
 
3. SOLUÇÕES MAIS USADAS: 
 
3.1. SOLUÇÃO SULFOCRÔMICA (PARA LIMPAR VIDRARIA) 
 
Bicromato de Potássio......... 50 g 
Água destilada................500 ml 
Ácido sulfúrico conc......... 150 ml 
 
Dissolver o bicromato de potássio na água destilada 
quente. Resfriar. Colocar o balão dentro da pia cheia de 
água e adicionar lentamente o ácido sulfúrico. 
Deixar o material a ser limpo mergulhado na solução por 
algumas horas ou de um dia para outro. 
 
3.2. PREPARO DO COLÓDIO A 1% 
 
Álcool Absoluto..............50 ml 
Éter Etílico.................50 ml 
Celoidina em pó...............1 g 
 
 
3.3. NaOH 1 NORMAL 
 
NaOH pastilhas....................40 g 
Água destilada..................1000 ml 
 
 
3.4. HCL 1 NORMAL 
 
Ácido clorídrico comercial................82 ml 
Água destilada..........................1000 ml 
 
 
3.5. ÁLCOOL-ÁCIDO 
 
Ácido clorídrico....................1 ml 
Álcool 70°.........................99 ml 
 
 
 
TAMPÃO 1 
II. TAMPÕES 
 
1. PBS (SOLUÇÃO SALINA TAMPONADA)Cloreto de sódio............................9 g 
Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,2 a 7,3).......100 ml 
Água destilada............completar para 1000 ml 
 
 
2. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,1M a diferentes pHs. 
 
Solução A: solução 0,2M de fosfato de sódio monobásico 
(NaH2PO4H20; PM = 138,01): 
27,6 g/1000 ml de água destilada. 
Solução B: solução 0,2M de fosfato de sódio bibásico 
(Na2HPO4; PM = 141,98): 
28,4 g/1000 ml de água destilada. 
 
Misturando-se os volumes indicados na tabela abaixo e 
completando-se para 200 ml com água destilada pode-se 
fazer tampão fosfato 0,1M a diferentes pHs. 
 
ml A ml B pH 
92,0 8,0 5,8 
90,0 10,0 5,9 
87,7 12,3 6,0 
85,0 15,0 6,1 
81,5 19,5 6,2 
77,5 22,5 6,3 
73,5 26,5 6,4 
68,5 31,5 6,5 
62,5 37,5 6,6 
56,5 43,5 6,7 
51,0 49,0 6,8 
45,0 55,0 6,9 
39,0 61,0 7,0 
33,0 67,0 7,1 
28,0 72,0 7,2 
23,0 77,0 7,3 
19,0 81,0 7,4 
16,0 84,0 7,5 
13,0 87,0 7,6 
10,5 89,5 7,7 
8,5 91,5 7,8 
 
 
TAMPÃO 2 
3. TAMPÃO VERONAL HCl 
 
Solução A: ácido dietil barbitúrico (sal disódico) 0,2M 
(PM= 206). 
Para obter-se a solução A, pesar 2,06 g do ácido e 
dissolver em 30 ml de água destilada. Completar para 50 ml 
com água destilada. 
Observação: deve-se usar sempre o ácido dietil barbitúrico 
e não o barbiturato de sódio, pois este não dissolve em 
água. 
 
Solução B: 0,2N de HCl (1,65 ml de HCl em 100 ml de água). 
 
Para pH 8,8 misturar: 
50 ml de A 
4 ml de B 
146 ml de água destilada 
A molaridade final do tampão é 0,05M. 
 
 
4. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,02M, pH 4,7 (para digestão 
com papaína) 
 
Solução A: solução 0,02M de NaH2PO4.H2O (PM= 138,01) pH 
4,0: 
0,276g/100 ml de água destilada 
 
Solução B: solução 0,02M de Na2HPO4.7H2O (PM= 267,98) pH 
8,0: 
0,536g/100 ml de água destilada 
ou 
solução 0,02M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) pH 8,0: 
0,356g/100 ml 
 
Titular uma solução com a outra até que o pH seja 4,7. 
 
 
5. TAMPÃO FOSFATO DE SÓDIO 0,05M pH 8,9 (para digestão com 
tripsina) 
 
Solução A: fosfato de sódio monobásico 1M 
Solução B: fosfato de sódio bibásico 1M 
Misturar 0,25 ml da solução A com 9,75 ml da solução B e 
completar para 200 ml com água destilada. 
 
 
TAMPÃO 3 
6. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 
 
Solução A: solução 1M de KH2PO4 (PM = 136,09): 
13,6 g/100 ml de água destilada 
34,0 g/250 ml de água destilada 
 
Solução B: 
solução 1M de Na2HPO4.2H2O (PM = 177,98) 
17,8 g/100 ml de água destilada 
44,5 g/250 ml de água destilada 
ou 
solução 1M de Na24PO4.7H2O (PM = 267,98) 
26,8 g/100 ml de água destilada 
67,0 g/250 ml de água destilada 
ou 
solução 1M de Na2HPO4.12H2O (PM = 357,98) 
35,8 g/100 ml de água destilada 
89,5 g/250 ml de água destilada 
 
 
6.1. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,1M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
 
28,5 ml 71,5 ml 1000 ml 
14,25 ml 35,75 ml 500 ml 
2,85 ml 7,15 ml 100 ml 
 
 
6.2. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,15M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
 
28,5 ml 71,5 ml 660 ml 
14,25 ml 35.75 ml 330 ml 
04,75 ml 11,91 ml 110 ml 
 
 
TAMPÃO 4 
6.3. TAMPÃO FOSFATO SÓDIO-POTÁSSIO 0,2M; pH = 7,0 a 7,2 
 
Solução A Solução B Completar com H2O para 
 
57,0 ml 143,0 ml 1000 ml 
28,5 ml 71,5 ml 500 ml 
14,25 ml 35,75 ml 250 ml 
5,7 ml 14,3 ml 100 ml 
 
 
7. TAMPÃO TRIS-HCl pH 7,4 (para digestão com colagenase) 
 
Solução A: TRIS 0,2M 
2,42 g/100 ml de água destilada 
 
Solução B: HCl 0,1N: 
0,8 ml/100 ml de água destilada 
 
Para pH 7,4 misturar: 
25 ml da solução A 
42 ml da solução B 
33 ml de água destilada 
 
TRIS = hidroxi methyl-aminomethan (PM = 121,14) 
 
 
8. TAMPÃO ACETATO 0,2M, pH 5,8 (para Alcian Blue + 
concentração eletrolítica crítica) 
 
Solução A: ácido acético 0,2M: 
1,2 ml/100 ml de água destilada 
 
Solução B: acetato de sódio 0,2M 
1,64 g de acetato de sódio anidro (PM = 82)/100 ml de água 
ou 
2,72 g de acetato de sódio trihidratado (PM = 136)/100 ml 
de água destilada. 
 
Medir o pH da solução B e ir pingar nesta a solução A, até 
atingir o pH desejado. 
 
 
TAMPÃO 5 
9. TAMPÃO SORENSEN pH 6,4 
 
Solução A: solução 0,06M de KH2PO4 
0,816 g/100 ml de água 
 
Solução B: solução 0,06M de Na2HPO4.12H2O 
1,074 g/50 ml de água. 
 
Para 100 ml de tampão, misturar 70 ml da solução A e 30 ml 
da solução B. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 III. MICROSCOPIA DE LUZ
FIXAÇÃO 1 
1. TÉCNICAS DE FIXAÇÃO 
 
O volume do fixador deve ser sempre 20 vezes maior do que 
aquele da peça a ser fixada. 
A peça deve ter, pelo menos um dos lados, medindo 3 mm de 
espessura para que o fixador possa penetrar. 
 
 
1.1. ACETONA-METANOL 
 
Partes iguais de acetona e metanol. 
 
 
1.2. BOUIN 
 
Solução saturada aquosa de ácido pícrico......750 ml 
Formol 36-40%.................................250 ml 
Ácido Acético Glacial..........................50 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar pedaços de até 0,5 cm de espessura em Bouin durante 
24 horas (5 horas no mínimo). 
Lavar de um dia para o outro, em água corrente, dentro do 
próprio frasco onde foi fixado. Para isto, cobrir o 
frasco com uma gaze (amarrada ou presa com um elástico na 
borda do frasco) e colocá-lo sob a água corrente. Cuidado 
com a intensidade do jato de água para não danificar o 
material. 
Após a lavagem, passar para álcool 70, onde pode ser 
deixado por muito tempo, se a peça não for ser emblocada. 
 
Observações: 
a) Ácido Pícrico Saturado: solução aquosa de ácido pícrico 
com concentração de 1,4%. 
b) Formol 36-40% é o formaldeído líquido (como vem). 
c) Extração do Ácido Pícrico de peças fixadas em Bouin: se 
a peça fixada pelo Bouin ainda ficar muito amarela, após 
ser lavada em água corrente a noite inteira, deixá-la por 
3 horas na solução saturada de carbonato de lítio em 
álcool 50o. Em seguida, passar para álcool 70o, desidratar 
e emblocar. Da mesma forma, se o corte histológico ainda 
estiver amarelado depois da hidratação, deixá-la alguns 
minutos numa solução saturada de carbonato de lítio em 
álcool 50o. 
 
 
1.3. CARNOY II (Carnoy dos patologistas) 
 
Etanol absoluto..............60 ml 
Clorofórmio..................30 ml 
Ácido acético...............10 ml 
 
Técnica de fixação: 
FIXAÇÃO 2 
Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100 
de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão. 
 
 
1.4. ETANOL-ACÉTICO 
 
Álcool 95...............75 ml 
Ácido acético...........25 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar por duas horas, lavar em dois banhos de álcool 100 
de uma hora cada e prosseguir a rotina de inclusão. 
 
 
1.5. SOLUÇÃO SALINA DE FORMOL 10% 
 
Formol 36-40%.....................100 ml 
NaCl................................9 g 
Água destilada....................900 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar por 24 horas. 
 
 
1.6. SOLUÇÃO NEUTRA FOSFATO TAMPONADA DE FORMOL 
 
Formaldeído 37-40%.........................100 ml 
Água destilada.............................900 ml 
Fosfato de Na monobásico (NaH2PO4.H2O).......4,0 g 
Fosfato de Na dibásico anidro (Na2HPO4)......6,5 g 
 
Técnica de Fixação: 
Fixar durante 6 a 24 horas, dependendo do tamanho da peça. 
 
 
1.7. PARAFORMALDEÍDO A 4% EM PBS (pH 7.0) 
 
Tampão fosfato 0,1M...............100 ml 
NaCl.................................9 g 
paraformaldeído.....................40 g 
 
Colocar 800 ml de água destilada para aquecer (não deixar 
ferver). Colocar o NaCl e o tampão. Por último, dissolver 
o paraformaldeído. Completar para 1000 ml com água 
destilada. 
 
Técnica de fixação: 
Fixar o material de 6 a 24 hs. 
 
 
1.8. METHACARN 
 
Álcool metílico............60 ml 
Clorofórmio................30 ml 
FIXAÇÃO 3 
Acético acético............10 ml 
 
Técnica de fixação: Fixar por 24 horas. 
 
 
1.9. GENDRE 
 
Soluçãosaturada de ácido pícrico em álcool 90.......85 ml 
Formol 40%...........................................10 ml 
Ácido acético.........................................5 ml 
 
Técnica de fixação: 
Fixar por 4 horas. 
 
O líquido de Gendre é um fixador para glicogênio 
 
 
1.10. SOLUÇÃO DE FORMOL COM CÁLCIO 
 
Formol 40%.........................10 ml 
Água destilada.....................90 ml 
Cloreto de cálcio anidro............1 g 
 
Este é um fixador ideal para estudar lípides. 
 
 
1.11. CLARKE-CARNOY (Carnoy dos citologistas) 
 
Álcool 100....................... 75 ml 
Ácido acético.....................25 ml 
 
Fixador ideal para demonstração de proteínas. 
 
 
1.12. HIDRATO DE CLORAL 
 
25 g de hidrato de cloral 
100 ml de álcool 50 
 
Fixar por 24 a 48 horas. 
 
Fixador ideal para método de Nonidez para demonstração de 
terminações nervosas. 
 
 
1.13. FORMOL BROMETADO 
 
140 ml de formol 40% 
20 g de brometo de amônia 
1000 ml de água destilada 
 
Fixador ideal para tecido nervoso que será submetido a 
algum método de impregnação pela prata. 
 
FIXAÇÃO 4 
 
 
 
DESCALC 1 
2. TÉCNICAS DE DESCALCIFICAÇÃO 
 
 
2.1. DESCALCIFICAÇÃO PELO EDTA 
 
Deixar o fragmento em solução de EDTA a 5% em solução 
salina (5 g de EDTA em 100 ml de solução salina) até que a 
descalcificação esteja completa. Testar para verificar a 
descalcificação. 
Lavar abundantemente em água corrente antes de iniciar-se 
a desidratação. 
 
EDTA = Ac. Etilediamino Tetracético Sal Bisódico; PM = 
372,24 
 
 
2.2. DESCALCIFICAÇÃO PELO ACÍDO FÓRMICO 
 
Solução A: solução de citrato de sódio a 20% 
Citrato de Sódio 20% ......50 g 
Água destilada.............250 ml 
 
Solução B: solução de ácido fórmico 1:1 
Ácido fórmico a 50%.........125 ml 
Água destilada..............125 ml 
 
Misturar partes iguais das soluções A e B. Colocar nesta 
mistura o fragmento ósseo já fixado. Renovar a solução a 
cada 48 horas e testar periodicamente para verificar-se a 
descalcificação. 
Após a descalcificação lave o tecido em água corrente 
durante 24 horas, pelo menos (para eliminar totalmente o 
ácido), antes de iniciar-se a desidratação. 
Usando-se este método, a descalcificação é lenta, porém 
preserva melhor as estruturas. 
 
 
2.3. TESTE PARA VERIFICAR A DESCALCIFICAÇÃO 
 
5 ml da solução descalcificante usada (que esteve em 
contato com a peça durante pelo menos seis horas) 
5 ml de solução de oxalato de amônia a 5% 
5 ml de hidróxido de amônia 
 
DESCALC 2 
Agitar. Esperar 30 minutos. Se ficar turvo é porque a 
descalcificação da peça não está completa ainda. 
Caso esteja pronta, lavar a peça abundantemente antes de 
iniciar-se da desidratação. 
 
 
2.4. DESCALCIFICAÇÃO PELO ÁCIDO NÍTRICO 
 
Colocar a peça em solução aquosa de ácido nítrico a 4%. 
 
É um método muito drástico. Deve-se verificar o 
amolecimento da peça várias vezes. 
 
 
INCLUSÃO 1 
3. INCLUSÃO EM PARAFINA 
 
 
3.1. TÉCNICA DE INCLUSÃO EM PARAFINA 
 
Depois de completa a fixação, o material deve ser lavado, 
se for o caso, e deixado em álcool 70° durante duas horas, 
no mínimo. 
Fazer 3 passagens de duas horas cada uma em álcool 96°. 
Fazer 3 passagens de 2 horas cada uma em álcool 100° (na 
última pode deixar de um dia para outro). 
Fazer 3 passagens de 30 minutos cada uma em xilol. 
Dar um primeiro banho de parafina na estufa 60°C durante 
uma hora. 
Dar um segundo banho de parafina na estufa (à vácuo, de 
preferência) durante uma hora. 
Incluir o material. 
 
Observações: 
a) A parafina usada nos banhos deve ser filtrada antes de 
ser reutilizada. 
b) Para amolecer peças muito duras usar banhos de benzol 
em vez de xilol. 
c) Para diafanizar peças muito grandes ou muito pequenas 
calcular o tempo de diafanização da seguinte maneira: 
deixar no primeiro banho de xilol até a peça ficar 
diafanizada (como que transparente). Os outros dois banhos 
de xilol que se seguem devem ter a mesma duração deste 
primeiro. 
d) Para peças muito fibrosas: depois dos banhos de álcool 
100, dar 2 banhos com acetato amila ou éter. Em seguida, 
parafina + éter (1:1) a 38°C e depois parafina pura a 
60°C. 
 
 
3.2. PREPARAÇÃO DA PARAFINA 
 
3.2.1. PARAFINA PURA 
 
Derreter a parafina Petrobrás na estufa, colocar para 
ferver, levantar a fervura três vezes, recolocar na estufa 
e pronto. 
 
3.2.2. FÓRMULA DR. CARDOSO DE ALMEIDA 
 
Parafina Petrobrás 145o ....1000 ml ou 780 g 
Estearina.....................25 ml ou 21 g 
Cera de abelha...............130 ml ou 104 g 
Vaselina líquida...............2 ml 
 
 
3.2.3. FÓRMULA DO BENIGNO ARROYO (ICB-USP) 
 
parafina pura..............................800 g 
INCLUSÃO 2 
cera purificada............................150 g 
ácido esteárico (ou estearina)..............50 g 
MICROTOM 1 
4. MICROTOMIA EM PARAFINA 
 
4.1. PREPARAÇÃO DAS LÂMINAS 
 
Deve-se limpar previamente as lâminas onde serão colocados 
os cortes: retirar as lâminas da embalagem e colocá-las em 
uma solução de Extran a 1% em um recipiente grande. Deixar 
de um dia para o outro. Enxaguar em água corrente 
abundantemente até que o detergente tenha sido totalmente 
retirado. Colocar em álcool 95°. As lâminas devem 
permanecer no álcool até o momento de serem utilizadas, 
quando então devem ser secas com uma fralda. 
Se as lâminas estiverem fungadas ou muito sujas, deixar de 
molho em soluçào sulfocrômica ou em álcool-ácido preparado 
da seguinte maneira: 
Álcool 95 ou 100%...........1000 ml 
Água destilada................63 ml 
HCl..........................120 ml 
 
 
4.2. OBTENÇÃO DOS CORTES 
 
Aparar lateralmente o bloco (deve-se aparar o máximo 
possível, pois se ficar excesso de parafina dos lados da 
peça emblocada os cortes sairão enrugados). 
Cortar rotineiramente com 4 a 7 µm. 
Com uma pinça colocar fragmentos da fita de cortes em 
Banho-Maria com água destilada a 45° a 50°C. Colocar a 
superfície brilhante da fita em contacto com a água e 
fazê-la caminhar sobre a superfície da água antes de 
soltá-la da pinça. 
Separar os cortes um a um usando delicadamente a pinça. 
Deixar os cortes no banho-maria até esticarem e pescá-los 
com as próprias lâminas que devem estar perfeitamente 
limpas e desengorduradas (ver "Preparação de lâminas"). 
Depois de pescar, colocar as lâminas com os cortes na 
estufa a 50 a 60° para secar, durante no mínimo duas 
horas, sendo que o melhor é deixá-las na estufa de um dia 
para o outro. Desta maneira, a parafina derrete bem e os 
cortes grudam satisfatoriamente na lâmina. 
 
 
PREP-LAM 1 
5. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS E COLAGEM DE CORTES 
 
 
5.1. COMO DESPARAFINAR E HIDRATAR OS CORTES 
 
Este procedimento deve ser seguido rotineiramente, a menos 
que para o tipo de coloração desejada exista determinação 
específica em contrário. 
 
Passar as lâminas por: 
Xilol 1..........10 min. 
Xilol 2..........10 min. 
álcool 100°.......5 min. 
álcool 95°........5 min. 
álcool 70°.......10' a 15 min. 
Lavar em água corrente 
Corar. 
 
Observações: 
a) Diversos fatores (tipo de parafina, a utilização de 
cortes obtidos há muito tempo, a dimensão do corte) 
influem no tempo durante o qual as lâminas devem 
permanecer no xilol para a retirada da parafina. 
Imediatamente após colocar a lâmina no álcool 100°, 
retirá-la e, olhando a lâmina contra a luz, certificar-se 
de que toda parafina foi retirada pelo xilol; se isto não 
tiver ocorrido, voltar a lâmina para o xilol. 
 
 
5.2. MONTAGEM DA LÂMINA APÓS COLORAÇÃO 
 
 
Passar as lâminas por: 
 
Álcool 70°.............5 min. 
Álcool 95°.............3 min. 
Álcool absoluto........3 min. 
Álcool absoluto........3 min. 
Álcool-xilol (1:1)....10 min. 
Xilol diafanizante.....5 min. 
Xilol montagem........30 min. ou mais 
Colocar a lamínula usando o meio de montagem apropriado. 
 
 
PREP-LAM 2 
5.3. MODELO DE ROTULAÇÃOApós o meio de montagem estar seco, deve-se limpar a 
lâmina para retirar o excesso deste que acumulou-se nas 
bordas da lamínula, limpando com um pano ou lenço de papel 
com xilol. Em seguida, as lâminas devem ser identificadas 
por etiquetas que contenham as seguintes informações: 
número do bloco (correspondente ao número registrado no 
livro de autópsias), identificação da espécie animal, 
identificação do órgão e da coloração. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 corte 
 
 espécie coloração 
 lamínula 
 número do órgão 
 registro 
 
 
 
5.4. ESMERILHAMENTO DE LÂMINAS (PREPARO DE LÂMINA FOSCA) 
 
Com este procedimento consegue-se que uma das extremidades 
da lâmina fique fosca, e assim pode-se escrever sobre ela 
com um lápis, facilitando sua identificação. 
 
 
5.4.1. RECEITA DO PROF. JUNQUEIRA 
 
Solução esmerilhadora: 
 
150 g de fluoreto de amônia anidro 
20 ml de ácido sulfúrico 
150 ml de ácido fluorídrico 
100 ml de água destilada 
 
Adicionar o ácido sulfúrico, em gotas, ao fluoreto de 
amônia agitando com cuidado. Depois adicionar o ácido 
fluorídrico da mesma maneira e a água por último. 
 
Técnica: Deixar as lâminas durante 1 minuto na solução 
esmerilhadora, retirar e lavar bem em água corrente. 
 
PREP-LAM 3 
Observações: 
a) É essencial adicionar os reagentes na ordem indicada. 
b) Não usar fluoreto de amônia hidratado. 
c) Tanto para a preparação como para estocar a solução 
usar recipiente de polietileno de parede espessa, pois a 
reação é exotérmica. 
d) A adição do ácido sulfúrico por gotejamento e sob 
constante agitação deve ser feita para evitar 
empedramento. 
e) Lembrar e avisar ao técnico que a solução ataca vidro 
em geral e não apenas as lâminas. 
f) À medida que a solução for envelhecendo, aumentar o 
tempo para o esmerilhamento, controlando o processo 
observando a lâmina contra luz. 
 
 
5.4.2. RECEITA DA CLEUSA (ICB-USP) 
 
150 g de fluoreto de amônia 
30 ml de ácido sulfúrico 
30 ml de ácido fluorídrico 
75 ml de água destilada 
10 ml de goma arábica 
 
Dissolver o fluoreto de amônia na água; adicionar o ácido 
sulfúrico gota a gota; juntar o ácido fluorídrico e a goma 
arábica também gota a gota. 
 
 
5.5. COLAGEM DE CORTES 
 
Os cortes podem ser pescados em lâminas limpas (sem 
nenhuma substância adesiva) quando pretende-se fazer 
colorações rotineiras e que não agridam muito o material. 
Caso contrário, deve-se promover a colagem do corte na 
lâmina, dissolvendo-se a substância colante no banho-maria 
ou pescando-se os cortes em lâminas previamente 
preparadas. 
 
 
5.5.1. GELATINA (para cortes que vão sofrer digestão 
enzimática) 
 
Gelatina em pó..................1 colher café 
Bicromato de potássio...........1 colher café 
Água destilada..................200 ml 
 
Ferver, filtrar, colocar no banho-maria e completar com 
água destilada. Trocar cada duas ou três semanas. 
 
 
5.5.2. GELATINA (usada rotineiramente) 
 
0,1 g gelatina 
PREP-LAM 4 
0,1 g dicromato de potássio 
1 litro água destilada fervente 
 
 
5.5.3. GELATINA (A Yara diz que esta não interfere na 
coloração e que as outras interferem) 
 
Dissolver na água do banho-maria um quadradinho de 4cm x 
4cm de gelatina em folha. 
 
 
5.5.4. ALBUMINA (Luna, 1968) 
 
Clara de ovo...............50 ml 
Glicerina..................50 ml 
 
Misturar bem. Filtrar em uma gaze. Colocar uma pequena 
gota em uma das extremidades da lâmina e espalhar de uma 
só vez com o dedo. 
Atenção: a albumina cora-se com muitos corantes, interfere 
no resultado final e a lâmina torna-se fungada com o 
tempo. 
 
 
5.5.5. SUPER-COLAGEM PARA DIGESTÃO ENZIMÁTICA 
 
Colar os cortes com albumina. 
Deixar secar e colocar as lâminas apoiadas (com os cortes 
virados para baixo) sobre frascos contendo formol dentro 
da estufa a 60°C durante 1 hora. 
Retirar os frascos de formol e deixar as lâminas secando 
na estufa a 37°C de um dia para outro antes de 
desparafinar. 
Desparafinar. 
Deixar de um dia para outro secando na estufa. 
 
 
5.5.6. SUPER-COLAGEM PARA RETICULINA. 
 
Colar os cortes com albumina. 
Colocar nos vapores de formol a 60°C durante uma hora (ver 
instruções na receita acima). 
Passar pela bateria de desparafinização e hidratação: 
xilol 1, xilol 2 e álcool 100°. 
Tirar do álcool 100° e colodionar os cortes, mergulhando-
os em solução de celoidina 0,5% (ou nitrato de celulose 
0,1%) em álcool-éter (1:1). 
Deixar secar coberto, à temperatura ambiente. 
Passar no álcool 70°, na água e proceder à coloração 
desejada. 
 
 
PREP-LAM 5 
5.5.7. GELATINA PARA LÂMINAS AO CRIOSTATO (usada para 
digestão enzimática e algumas reações imuno-histoquímicas) 
 
Solução A: Dissolver 1 g de gelatina incolor em 80 ml de 
água quente. 
 
Solução B: Dissolver 0,1 g de cromo alumen [CrK(SO4)2.12H2O; 
PM = 499,40] em 20 ml de água. 
 
Misturar as duas soluções, imergir as lâminas e deixá-las 
enxugar verticalmente. Guardá-las no congelador da 
geladeira em caixas fechadas. 
 
 
5.5.8. SILANE (3-aminopropyltriethoxysilane nº A-3648 
Sigma) 
 
Usar lâminas perfeitamente limpas e desengorduradas. 
 
Fazer uma solução de silane 2% em acetona pura. 
Mergulhar a lâmina 2 vezes nesta solução. 
Mergulhar a lâmina 2 vezes na acetona pura. 
Mergulhar a lâmina 2 vezes em água. 
Secar em temperatura ambiente. 
 
 
5.5.9. SILANE (receita que o Gregorio deu) 
 
Preparar uma solução de 0,5% de silane em acetona pura. 
Mergulhar as lâminas nesta solução por 10 a 15 segundos. 
Deixar secar de um dia para o outro. 
Lavar em três ou mais banhos de água destilada. 
Secar na estufa a 60ºC. 
 
 
5.5.10. COLA TENAZ 
 
Dissolver um pouco (1 a 2 ml) de cola tenaz de rótulo azul 
em um recipiente com 50 ml de água. Mergulhar as lâminas. 
Colocá-las para secar na estufa (cerca de 15 minutos). 
Após a secagem as lâminas devem ficar praticamente 
transparentes, senão é porque tem cola em excesso. Pode-se 
colocar a cola direto no banho-maria onde os cortes são 
pescados. 
 
 
PREP-LAM 6 
5.5.11. COLÓDIO 
 
Esta técnica permite a adesão de cortes que foram pescados 
em lâminas sem nenhuma substância adesiva, possibilitando 
assim submeter lâminas já prontas a processos como 
hidrólise, acetilação, saponificação, metilação etc., que 
são muito agressivos e descolam os cortes. 
As lâminas devem ser colodionadas no momento adequado para 
cada tratamento, segundo as indicações específicas. 
 
Preparo do colódio a 1% ou 0,5% 
Álcool absoluto.....................50 ml 
Éter etílico........................50 ml 
Celoidina em pó..............1 g.ou 0,5 g 
 
No decorrer dos diversos procedimentos, o colódio deve ser 
removido das lâminas, passando-as por álcool absoluto e, 
em seguida, por uma mistura de álcool-éter em partes 
iguais. 
 
 
5.5.12. ADESÃO POR CALOR 
 
De modo geral, para todas as colorações sejam elas 
agressivas ou não (exceto para digestão enzimática, que 
neccesita de uma substância adesiva), os cortes resistem 
muito bem se, após a desparafinização e passagem por 
álcool 100°, as lâminas forem colocadas para secar na 
estufa a 55°,por uma ou duas horas. A seguir, voltar as 
lâminas no álcool 100° e proceder a bateria de hidratação 
normal. 
 
DIG-ENZ 1 
6. TÉCNICAS DE DIGESTÃO ENZIMÁTICA 
 
 
6.1. DIGESTÃO COM COLAGENASE 
 
Fazer uma solução de colagenase 0,1 a 0,4% (1 a 4 mg/ml) 
em Tampão Tris-HCl 0,05M (pH 7,4) contendo 0,0025M (2,5 
mM) de NEM e 0,001M (1 mM) de CaCl2. 
 
Para 10 ml de solução: 
 
10 a 40 mg de colagenase 
3,1 mg de NEM 
1,1 mg de CaCl2 
Dissolver estes ingredientes em 5 ml de tampão e completar 
com o mesmo tampão para 10 ml. 
 
Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C durante 
24 horas ou mais (testar o tempo de incubação para cada 
material). 
 
Observações: 
TRIS = hydroxymethil-aminomethan PM 121,14. 
NEM = N-ethyl-maleidemide PM 125,13. O NEM atua como 
inibidor de outras proteases. Pode-se fazer a digestão sem 
o NEM, caso este não esteja disponível. 
CaCl2 PM= 110,99. 
 
 
6.2. DIGESTÃO COM ELASTASE 
 
Fazer uma solução de 0,5 mg de elastase por ml de tampão 
Veronal-HCl, pH 8,8. 
 
Pingar a solução sobre os cortes e deixar durante 30 a 60 
minutos, à temperatura ambiente. 
Lavar em água corrente. 
Proceder à coloração desejada. 
 
 
6.3.DIGESTÃO COM PEPSINA 
 
Fazer uma solução de 2 mg de pepsina cristalizada por ml 
de HCl 0,02N (pH 1,6). 
Pingar sobre os cortes e proceder à digestão a 37°C, 
durante 15 a 60 minutos. 
 
 
DIG-ENZ 2 
6.4. DIGESTÃO COM RNASE 
 
Fazer uma solução de 1 mg de RNAse por ml de água. Usar 
água deionizada com pH acertado a 6,8. Acertar o pH da 
água com solução de fosfato de sódio bibásico ou 
monobásico (dependendo do pH que está a água). 
 
Colocar 0,5 ml de solução de RNAse sobre o corte. Incubar 
os cortes na RNAse a 37°C durante 3 horas. Lavar e corar 
com Azul de Toluidina ou Galocianina. 
 
 
6.5. DIGESTÃO COM TRIPSINA 
 
Tampão Fosfato 0,05M (pH 8,9)......1 ml 
Tripsina cristalizada............0,1 mg 
 
Dissolver a tripsina no tampão, pingar sobre os cortes e 
incubar a 37°C por duas horas. 
 
 
6.6. DIGESTÃO COM PAPAÍNA 
 
Fazer uma solução de papaína 0,1% (1 mg/ml) em tampão 
fosfato 0,02M, pH=4,7, contendo 0,005M (5mM) de 
metabissulfito de sódio (PM=190,10) e 0,0005M (0,5mM) de 
EDTA (PM=372,24). 
 
Para 10 ml de solução: 
10 mg de papaína 
9,505 mg de bissulfito de sódio 
1,86 mg de EDTA 
Dissolver estes ingredientes em uma quantidade de tampão 
suficiente para completar 10 ml. 
 
Desparafinar os cortes e levá-los até água. Pingar a 
solução sobre os cortes e deixar à temperatura ambiente 
por 2 horas. Lavar durante alguns minutos na água 
corrente. Realizar a coloração desejada. 
Sobre os cortes-controle pingar só a solução de tampão + 
bissulfito + EDTA. 
 
Observação: 
a) Ver Guia de Tabalhos Práticos, no ítem Interação 
Colágeno-Proteoglicanos. 
DIG-ENZ 3 
6.7. DIGESTÃO COM AMILASE (LISON, 1960) 
 
Fazer uma solução de amilase 0,1 a 0,5% em salina (1 a 5 
mg/ml). 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Pingar a solução sobre os cortes e incubar a 37°C por duas 
horas. Os cortes controles devem ser submetidos à solução 
salina sem a enzima. 
Lavar em água destilada. 
Corar pelo Método do PAS. 
 
Resultado: 
Locais PAS positivos na lâmina controle que diminuirem ou 
perderem a positividade na lâmina digerida indicam 
presença de glicogênio. 
 
 
6.8. DIGESTÃO COM AMILASE 
 
Amilase a 2% em solução aquosa de NaCl a 4%. Pingar a 
solução sobre os cortes e deixar a 37°C durante 30 
minutos. 
 
 
6.9. DIGESTÃO COM HIALURONIDASE TESTICULAR 
 
Fazer um solução de hialuronidase testicular 0,1% (1 
mg/ml) em tampão Sorensen pH 6,4. 
 
Desparafinar e hidratar 2 cortes (A e B). 
Submeter o corte A à digestão enzimática, enquanto que o 
corte B recebe apenas o tampão. 
Corar os dois cortes pelo Alcian Blue pH 2,5 ou Azul de 
Toluidina. 
 
Resultado: Diminuição ou perda da positividade ao Alcian 
Blue no corte A indica a presença de ácido hialurônico 
e/ou condroitim-4 ou -6 sulfatado. 
 
 
DIG-ENZ 4 
6.10. DIGESTÃO COM NEURAMINIDASE 
 
Fazer uma solução de neuraminidase 500 U/ml em água 
destilada. Diluir esta solução em igual volume de tampão 
acetato 0,1M pH 5,5 contendo 1% de NaCl e 0,1% de CaCl2. 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Incubar os cortes com a solução enzimática, a 37° C, por 
16 a 24 horas. Os cortes controles devem ser incubados no 
mesmo tampão acetato a 0,05M. 
Lavar com água destilada. 
Corar com Alcian Blue - PAS. 
Montar. 
 
Resultado: 
Locais menos corados pelo Alcian Blue no corte digerido 
indicam a presença de ácido siálico (sialomucinas). 
 
COLOR 1 
7. COLORAÇÕES (TÉCNICAS DE USO CORRENTE) 
 
 
7.1. EOSINA (usar com hematoxilina de Harris) 
 
0,25 g de eosina amarela em pó (solúvel em água) 
100 ml de água destilada 
 
 
7.2. EOSINA (para usar com Hematoxilina de Ehrlich) 
 
2 g de eosina 
1 g de bicromato de potássio 
20 ml de solução aquosa saturada de ác. pícrico 
20 ml de álcool absoluto 
160 ml de água destilada 
 
 
7.3. HEMATOXILINA DE HARRIS 
 
1 g de hematoxilina cristalizada 
10 ml de álcool absoluto 
20 g de alúmen de potássio ou de amônio 
200 ml de água destilada 
0,5 g de óxido de mercúrio (vermelho) 
8 ml de ácido acético glacial (optativo) 
 
Preparo do corante: 
Dissolver a hematoxilina no álcool ligeiramente aquecido, 
dissolver o alúmen em água aquecida. Misturar as soluções 
e aquecer até ferver. Tirar do fogo e adicionar 
imediatamente e aos poucos o óxido de mercúrio (agitando 
para não explodir). 
Resfriar a solução o mais rapidamente possível, 
mergulhando o frasco num vasilhame (ou na pia) contendo 
água fria. 
Acrescentar o ácido acético e filtrar. Estocar em vidro 
escuro. Dura cerca de 3 meses. 
Deve-se filtrar a solução toda vez que for usar. 
 
 
COLOR 2 
7.4. HEMATOXILINA DE EHRLICH 
 
2 g de hematoxilina 
100 ml de álcool absoluto 
100 ml de glicerina 
100 ml de água destilada 
10 ml de ácido acético glacial 
15 g de alúmen de potássio 
 
A hematoxilina deve ser dissolvida no álcool; o alúmen 
deve ser dissolvido na água. Misturar as duas soluções e 
adicionar os outros reativos. 
Deixar amadurecer no sol por 1 mês. 
Dura muitos anos. 
 
Observações: 
a) O amadurecimento pode ser apressado adicionando-se 
iodato de sódio, na proporção de 50 mg de iodato de sódio 
para cada grama de hematoxilina; porém o corante não dura 
muito tempo. 
b) Útil para corar tecidos que estiveram expostos a 
soluções ácidas; assim é recomendada para corar tecidos 
que sofreram descalcificação ou que ficaram muito tempo no 
fixador. 
c) Usar associada à eosina preparada com bicromato de 
potássio e ácido pícrico. 
 
 
7.5. HEMATOXILINA DE MAYER 
 
0,2 g de hematoxilina 
200 ml de água destilada 
0,4 g de iodato de sódio 
10 g de alúmen de potássio 
10 g de hidrato cloral 
0,2 g de ácido cítrico 
 
Dissolver a hematoxilina, o alúmen e o iodato na água 
destilada. Isto pode ser feito a quente ou deixando de um 
dia para o outro à temperatura ambiente. Após a total 
dissolução, adicionar o hidrato cloral e o ácido cítrico. 
Ferver por 5 minutos, esfriar e filtrar. Pode ser usada 
imediatamente. 
 
COLOR 3 
Observação: 
a) Esta hematoxilina, por não precisar de diferenciação 
com álccol-ácido, é especialmente útil como corante 
nuclear nos casos em que é necessário realçar, por 
contraste, algum componente citoplasmático que tenha sido 
demonstrado por um corante que sofre descoloração com a 
diferenciação em álcool ácido (comum para outras 
hematoxilinas). 
 
 
7.6. HEMATOXILINA-EOSINA 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar com hematoxilina, pelo tempo desejado, conforme o 
tipo e idade da hematoxilina; de modo geral: corar durante 
15 a 20 minutos com hematoxilina de Mayer; corar de 2 a 10 
minutos com a hematoxilina de Harris e corar de 2 a 10 
minutos com a hematoxilina de Ehrlich. 
Lavar em água corrente por 10 minutos. 
Caso necessário, proceder à diferenciação em álcool-ácido: 
solução alcoólica de HCl a 1% (1 ml de HCl em 99 ml de 
álcool 70°). Controlar a diferenciação ao microscópio até 
chegar à intensidade desejada. 
Lavar rapidamente em água corrente, após a diferenciação. 
Corar pela eosina por 2 minutos. 
Lavar em água corrente (até que a água esteja limpa). 
Passar pela bateria de desidratação: passar rapidamente 
pelo álcool 70°, passar pelo álcool 95°, álcool 100°, 
xilol e montar. 
 
Observações: 
a) A hematoxilina cora os núcleos primariamente em 
vermelho e a posterior lavagem em água corrente converte a 
coloração para o azul (processo de azulecimento da 
hematoxilina). 
b) O procedimento de diferenciação da hematoxilinaem 
álcool-ácido raramente é necessário e deve ser feito nos 
casos em que ocorre uma supercoloração. 
c) A eosina sofre diferenciação com o álcool 70°; por isso 
esta passagem deve ser rápida. Se, por acaso, o corte 
ficar muito descorado ao ser passado pelo álcool 70° , 
passá-lo novamente pela água e recolocá-lo na eosina. Às 
vezes, é preferível pular a passagem pelo álcool 70°, 
colocando diretamente em álcool 95°. 
 
 
COLOR 4 
7.7. SHORR - HEMATOXILINA (para esfregaços vaginais) 
 
Pode-se usar o corante comercial ou prepará-lo: 
0,5 g de Biebrich scarlat red 
0,25 g de Orange G 
0,075 g de fast green FCF 
0,5 g de ácido fosfotúngstico 
0,5 g de ácido fosfomolíbdico 
1 ml de ácido acético glacial 
100 ml de álcool 50° 
 
Procedimento: 
Fazer o esfregaço numa lâmina e colocá-la imediatamente no 
álcool 95° para fixação. Deixar no álcool por 15 minutos 
(pode ficar até 72 horas). 
Lavar rapidamente em álcool 70°. 
Lavar rapidamente em água corrente. 
Corar pela hematoxilina por 30 segundos. 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Lavar em álcool 90°. 
Corar no corante de Shorr por 5 minutos. 
Lavar em álcool 95°. 
Desidratar e montar. 
 
Resultado: 
Reconhecimento das fases do ciclo estral de ratas: 
No diestro tardio o esfregaço aparece tipicamente 
atrófico, consistindo de poucas células epiteliais 
pequenas, arredondadas e nucleadas, enorme quantidade de 
polimorfonucleares e muco. 
No começo do proestro decresce em muito a quantidade de 
polimorfonucleares e o esfregaço compõe-se principalmente 
de células epiteliais arredondas ou ovaladas e nucleadas. 
No fim do proestro predominam as células poligonais 
grandes, achatadas e com núcleo picnótico, sendo que já 
existem células anucleadas. 
Com a chegada do estro, o esfregaço apresenta-se 
basicamente constituído por células cornificadas (células 
poligonais, grandes, achatadas, anucleadas e acidófilas). 
No começo do metaestro o esfregaço constitui-se de células 
cornificadas, polimorfonucleares e muco. No metaestro 
tardio a imagem é de muitas células epiteliais ovaladas ou 
arredondadas e nucleadas, associadas a polimorfonucleares 
e muco. 
A fase seguinte é o diestro, onde nota-se que o esfregaço 
torna-se cada vez mais atrófico: as poucas células 
epiteliais que aparecem são pequenas, arredondadas, 
COLOR 5 
nucleadas e sempre acompanhadas de grande quantidade de 
polimorfonucleares e muco. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV. MÉTODOS HISTOQUÍMICOS 
MINERAIS 1 
1. MINERAIS 
 
 
1.1. VON KOSSA (para cálcio) 
 
Solução corante: 
solução aquosa de AgNO3 (nitrato de prata) a 5% 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Corar na solução de nitrato de prata, sob luz do dia forte 
(porém não luz solar direta), durante 10 a 60 minutos. 
Lavar em água destilada por 1 a 2 minutos. 
Deixar em água destilada, sob luz difusa, por 10 a 60 
minutos 
(esta passagem pode ser omitida). 
Reduzir a prata, imergindo os cortes em solução de 
hidroquinona 0,5% ou solução diluída 1:3 de qualquer 
revelador fotográfico, durante 2 minutos, agitando sempre. 
Tratar com solução aquosa de hipossulfito de sódio a 5% 
durante 2 a 3 minutos, para remover o excesso de prata 
(controlar ao microscópio). 
Lavar em água destilada. 
Contracorar com safranina O a 0,2 a 0,5%, durante 20 a 30 
segundos. 
Montar. 
 
Resultado: regiões contendo carbonato ou fosfato de cálcio 
aparecem coradas em negro; o método demonstra a presença 
de cálcio de maneira indireta, uma vez que, de fato, é 
específico para os íons fosfato e carbonato. 
 
Observações: 
a) se os cortes estiverem descolando da lâminas, 
colodionar com celoidina a 1%, depois do álcool absoluto 
de montagem, mergulhar no álcool 70° e seguir a montagem. 
b) a reação consiste em uma dupla troca entre o nitrato de 
prata e o fosfato ou carbonato de cálcio, levando à 
formação de carbonato e fosfato de prata insolúveis. Estes 
compostos são fotossensíveis e escurecem, sobre a ação da 
luz, formando um precipitado amarelo ou marrom. A passagem 
pela hidroquinona serve para reforçar a cor destes 
precipitados, tornando-os negros. 
c) o material de eleição para esta coloração é joelho de 
rato de 5 dias de idade, pois ainda é pequeno e permite 
cortes sem descalcificação. 
MINERAIS 2 
d) se houver grande quantidade de cálcio depositado, é 
melhor corar pelo nitrato de prata, em bloco, antes de 
descalcificar, pois deve-se remover um pouco do cálcio 
para poder cortar. 
 
 
1.2. AZUL DA PRÚSSIA E TURNBULL (para Fe+3 ou Fe+2, 
respectivamente) 
 
Solução corante: 
Preparar na hora de usar: 
a) para testar a presença Fe+3: 
solução de ferrocianeto de potássio [K4Fe(CN)6.3H2O] a 1% 
em ácido clorídrico 0,5%. 
b) para testar a presença de Fe+2: 
solução de ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] a 1% em 
ácido clorídrico 0,5%. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Deixar na solução corante por 60 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Contracorar os núcleos com corante nuclear vermelho. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: pigmentos de ferro coram-se em azul brilhante, 
núcleos em vermelho e citoplasma em rosa claro. 
 
Observação: 
a) a fixação do material deverá ser feita em formol 
isotônico (preparado com salina ou PBS) ao pH fisiológico, 
durante 24 horas. Fixadores ácidos solubilizam os íons 
ferro e são, portanto, contra-indicados. 
b) material de eleição: baço e rim de rato ou cobaia 
injetados, intraperitonialmente, com sangue, durante 6 
dias, na dose diária de 1 ml de sangue para cada 100 g de 
animal. 
 
 
MINERAIS 3 
1.3. DETECÇÃO DE TÁLIO 
 
Solução de gás sulfídrico: 
7,8 g de Na2S 
0,56 ml de H2SO4 
100 ml de água destilada 
 
Solução de sulfeto de amônia: 
Solução aquosa de sulfeto de amônia [(NH4)S] saturada com 
selênio preto (óxido de selênio) 
 
Soluções estoques para revelação: 
Preparar: 
solução aquosa de goma arábica a 10% (preparada 7 a 14 
dias antes e agitada diariamente com um bastão de vidro) 
solução aquosa de nitrato de prata a 10% (mantida 14 dias 
no escuro, antes de usar) 
solução de ácido cítrico a 5% 
solução de hidroquinona a 2% 
 
Solução reveladora de trabalho (líquido de Timm): 
100 ml da solução de goma arábica 
1 ml da solução de nitrato de prata 
2 ml da solução de ácido cítrico 
10 ml da solução de hidroquinona 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Tratar pela solução de gás sulfídrico por 15 minutos. 
Imergir na solução de sulfeto de amônia por 10 minutos. 
Lavar em água destilada. 
Passar em H2O2 a 20% até descolorir. 
Colocar no líquido de Timm (solução de trabalho), durante 
20 a 30 minutos, no escuro. Parar a revelação quando os 
cortes estiverem marrons e não pretos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: depósitos de tálio aparecem como grânulos 
negros. 
 
MINERAIS 4 
Observações: 
a) Deve-se fazer junto cortes controles, omitindo-se o gás 
sulfídrico, o óxido de selênio ou o procedimento de 
revelação. 
b) A prata e o mercúrio podem interferir na coloração, mas 
poderão ser identificados no controle sem o óxido de 
selênio. 
RADQUIM 1 
2. RADICAIS QUÍMICOS EM PROTEÍNAS 
 
 
2.1. REAÇÃO PARA CITRULINA (Rogers, 1970) 
 
Preparo da solução corante: 
1 g de p-dimetil-amino-benzaldeído (reagente de Ehrlich) 
4 ml de ácido clorídrico concentrado 
23,38 g de NaCl 
água destilada suficiente para completar 100 ml 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Colocá-los na solução corante e montar no próprio meio de 
reação. 
Observar seguidamente ao microscópio até o aparecimento de 
uma coloração amarelada (demora cerca de 15 a 20 minutos). 
Fotografar, pois a preparação não pode ser montada de 
maneira permanente. 
 
Resultado: 
Locais ricos em citrulina, principalmente folículos 
pilosos, coram-se em amarelho palha.2.2. REAÇÃO PARA CISTEÍNA (SH) 
 
Preparo da solução corante: 
30 ml de solução aquosa de cloreto férrico (FeCl3.6H2O) a 
1% 
4 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio 
[K3Fe(CN)6] a 1 % 
6 ml de água destilada 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Deixá-los imersos na solução corante recém preparada, por 
10 minutos, à temperatura ambiente. 
Lavar em solução de ácido ácético a 1%. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: Locais ricos em radicais SH coram-se em azul. 
 
 
2.3. REAÇÃO PARA CISTINA (SS) 
Barka e Anderson, 1963 
RADQUIM 2 
 
Preparo da solução corante: 
60 ml de solução aquosa de cloreto férrico [FeCl3.6H2O] a 
1% 
20 ml de solução aquosa de ferricianeto de potássio 
[K3Fe(CN)6] a 1 % 
 
Preparo da solução de iodoacetamida: 
2 g de acetamida 
0,5 d iodo ressublimado 
100 ml de água destilada 
Ajustar o pH para 8,5 com NaOH 1N 
 
Preparo do tioglicolato de sódio: 
5 ml de ácido tioglicólico 
50 ml de água destilada 
50 ml de NaOH 1N 
Ajustar o pH para 8,5 com cerca de 5 ml de NaOH 1N 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Submetê-los à ação da iodoacetamida por 24 a 48 horas a 
37°C. 
Lavar em água destilada. 
Deixar na solução de tioglicolato de sódio por 4 horas. 
Lavar em solução de ácido acético 1% por 2 minutos. 
Colocar na solução corante recém-preparada por 10 minutos, 
no escuro. 
Lavar demoradamente em água corrente (cerca de 15 
minutos). 
Montar. 
 
Resultado: locais em que houve a redução dos grupos SS 
aparecem corados em pink, vermelho, lilás e azulado. 
 
 
2.4. DETECÇÃO DE PROTEÍNAS BÁSICAS EM GERAL 
 
Solução corante: 
naphtol yellow S...............1 g 
ácido acético..................1 ml 
água destilada...............100 ml 
 
RADQUIM 3 
Solução metiladora: 
HCl 1N...................0,8 ml 
álcool metílico...........100 ml 
 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até álcool absoluto e colodionar os 
cortes. 
Metilar o tecido, à 60°, por cerca de 3 horas. 
Lavar em álcool e levar até a água. 
Imergir os cortes na solução corante durante 20 minutos. 
Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1 
minuto cada banho. 
Desidratar diretamente em álcool butílico terciário, 
diafanizar e montar. 
 
Resultado: locais ricos em proteínas básicas aparecem 
corados de amarelo vivo. 
 
 
2.5. DETECÇÃO DE HISTIDINA 
 
Solução corante: 
naphtol yellow S...............1 g 
ácido acético..................1 ml 
água destilada...............100 ml 
 
Solução metiladora: 
HCl 1N....................0,8 ml 
álcool metílico...........100 ml 
 
Solução acetiladora: 
Anidro acético.............40 ml 
Piridina...................60 ml 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. 
Metilar o material por 3 horas. 
Lavar em álcool absoluto. 
Recolodionar. 
Deixar na solução acetiladora, por 24 horas. 
Lavar em piridina por 2 minutos. 
Lavar em álcool absoluto e levar até a água. 
Corar pela solução corante por 20 minutos. 
Lavar em dois banhos de ácido acético 0,1%, durante 1 
minuto cada banho. 
Desidratar diretamente em álcool butílico terciário, 
diafanizar e montar. 
RADQUIM 4 
 
Resultado: locais ricos em histidina aparecem corados de 
amarelo vivo. 
 
 
2.6. DETECÇÃO DE ARGININA 
 
Solução corante: 
2 ml de solução aquosa de NaOH a 4% 
2 gotas de água sanitária, "cândida", solução de 
hipoclorito de sódio a 5% comercial 
4 gotas de solução de alfa naphtol a 1% em álcool 70° 
Misturar nesta ordem e imediatamente antes do uso. 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. 
Secar e mergulhá-los em álcool 70°. 
Levar até a água. 
Colocar os cortes na horizontal e cobrí-los com a solução 
corante. 
Preparar nova solução corante, desprezar a primeira e 
tornar a cobrir os cortes por 2 minutos. 
Montar no próprio meio de reação e observar imediatamente. 
 
Resultado: locais ricos em arginina coram-se em vermelho 
tijolo. 
 
Observação: 
a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles, 
bloqueando-se os radicais guanidil, através da acetilação, 
assim realizada: após a passagem pelo álcool 70°, lavar os 
cortes em piridina por 2 minutos e colocá-los na solução 
acetiladora por 24 horas; em seguida, lavar em álcool 
absoluto, recolodionar os cortes e realizar a reação para 
arginina. 
Solução acetiladora: 
Anidro acético.............16 ml 
Piridina...................24 ml 
 
 
RADQUIM 5 
2.7. DETECÇÃO DE TIROSINA 
Bensley & Gersh, 1933 
 
Preparo do reativo de Millon: 
Preparar uma solução aquosa de ácido nítrico a 40%, 
dissolvendo o ácido gota a gota na água (40 ml de ácido em 
60 ml de água). Deixar estabilizar por 48 horas. Diluir 40 
ml desta solução em 360 ml de água, conseguindo-se assim 
400 ml de uma solução de ácido nítrico a 4%. Deixe 
repousar por 24 horas. Saturar esta solução com excesso de 
cristais de nitrato de mercúrio. Filtrar e adicionar 1,4 g 
de nitrito de sódio e 4 ml da solução aquosa de ácido 
nítrico a 40% (aquela inicial). O reativo de Millon assim 
preparado pode ser guardado em geladeira por muito tempo. 
 
Procedimento: 
Desparafinar, levar até o álcool e colodionar os cortes. 
Secar e mergulhá-los em álcool 70°, por 3 minutos. 
Mergulhar em acetona anidra e deixar secar ao ar. 
Cobrir com o reagente de Millon. 
Levar à chama do bico de Bunsen até o aparecimento da 
coloração tijolo. 
Lavar bem em solução de ácido nítrico a 2% a 37°C. 
 
Resultado: locais ricos em tirosina aparecem em vermelho 
tijolo. 
 
Observação: 
a) a reação pode ser bloqueada nos cortes controles, 
através do bloqueio dos radicais p-hidroxi-fenil, por 
processo de iodação, da seguinte maneira (Landing & Hall, 
1956): 
Após colodionar os cortes, colocá-los diretamente na 
solução de iodação por 24 horas; em seguida, lavar em água 
corrente, voltar ao álcool absoluto, recolodionar os 
cortes e realizar o método para tirosina, a partir da 
etapa da acetona. 
Solução de iodação: 
Iodo.........................3 g 
Iodeto de potássio...........6 g 
Água destilada............100 ml 
 
 
RADQUIM 6 
2.8. DETECÇÃO DE TRIPTOFANO 
 
Soluções corantes: 
Solução de p-dimetiaminobenzaldeído (DMAB) a 5% em HCl 
concentrado 
 
Solução de nitrito de sódio a 1% em HCl concentrado. Os 
cristais de NaNO2 são postos no HCl imediatamente antes de 
se usar a solução. Mergulhar as lâminas enquanto está 
havendo formação de gás. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e levar as lâminas até álcool absoluto. 
Recobrir o corte com celoidina, imergindo-o em solução 
0,25% de celoidina em álcool absoluto e éter em partes 
iguais durante 1 minuto. 
Retirar o corte da celoidina e colocar diretamente na 
solução de DMAB por 1 minuto. 
Colocar diretamente na solução de NaNO2 por 1 minuto. 
Lavar em água corrente por 30 segundos. 
Passar em solução de álcool ácido (HCl concentrado a 1% em 
álcool 70°). 
Montar. 
 
Resultados: 
Locais contendo triptofano aparecem corados em azul. 
Grânulos de zimogênio das células principais do estômago: 
moderadamente corados. 
granulações eosinofílicas: fortemente coradas. 
queratina: não se cora. 
grânulos de zimogênio do pâncreas: muito corados. 
células alfa da ilhota pancreática: azul claro. 
células beta da ilhota pancreática: não se coram. 
célula de Paneth: fortemente corada. 
células absortivas do intestino: azul acinzentado claro. 
fibras elásticas das artérias: não se coram. 
 
Observações: 
a) o ácido clorídrico puro é extremamente corrosivo e 
fumegante; trabalhe com luvas e na capela. 
b) para demonstrar células de Paneth no intestino use 
animais que foram mantidos em jejum por um noite. 
RADQUIM 7 
c) pode-se bloquear a reação, utilizando-se o ácido 
perfórmico, da seguinte maneira: 
Após colodionar, mergulhar os cortes em solução de formol 
a 10% em álcool 70° e em seguida, colocá-losna solução de 
ácido perfórmico por 2 minutos; lavar em álcool absoluto, 
recolodionar os cortes e aplicar a técnica para 
triptofano. 
Preparo da solução de ácido fórmico: 
Ácido fórmico a 98%......................40 ml 
Ácido sulfúrico a 65%...................0,5 ml 
Água oxigenada 100 vol....................4 ml 
Preparar 3 horas antes de usar e agitar por diversas vezes 
para remover o gás formado. 
 
 
2.9. DETECÇÃO DE GRUPOS NH2 
(Yasuma & Ichikawa, 1953) 
 
Solução corante: 
solução aloxana a 1% em álcool absoluto 
 
Reativo de Schiff: ver método de PAS, em Histoquímica de 
polissacarídeos 
 
Solução de água sulfurosa: 
10 ml de metabissulfito de sódio 
10 ml de HCl 1N 
180 ml de água destilada 
 
Procedimento: 
Desparafinar os cortes e levá-los até o álcool absoluto. 
Mergulhar as lâminas em solução de aloxana por 24 horas. 
Lavar em álcool absoluto e levar até a água. 
Colocar no reativo de Schiff por 30 minutos. 
Passar por três banhos de água sulfurosa de 2 minutos 
cada. 
Lavar em água corrente por 15 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: locais ricos em radicais livres NH2 coram-se em 
vermelho. 
RADQUIM 8 
Observação: 
a) pode-se bloquear a reação, através do método de Barka & 
Anderson (1963), utilizando-se o seguinte procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes, colocá-los na solução 
bloqueadora por 24 horas; lavar em água e realizar o 
método da aloxana. 
Preparo da solução bloqueadora: misturar, na hora de usar, 
partes iguais de solução aquosa de ácido acético a 12,5% e 
solução de nitrito de sódio a 15% (ambas geladas). 
 
 
 
LIPID 1 
3. LÍPIDEOS 
 
 
3.1. SUDAN BLACK B 
 
Preparo da solução corante: 
Preparar uma solução saturada de Sudan black em álcool 70° 
e filtrar. 
 
Procedimento: 
Usar cortes de material fresco ou fixado em formol. 
Cortar em congelação. 
Imergir os cortes por 10 minutos na solução corante 
filtrada. 
Lavar em álcool 70° para retirar o excesso de corante ou 
até que os cortes controles estejam descorados. 
Lavar em água corrente. 
Pode-se contracorar fracamente com hematoxilina. 
Montar em glicerina. 
 
Resultado: lipideos coram-se em negro. 
 
Observações: 
a) a adição de cálcio ao formol fixador contribui para a 
retenção dos lípides ao tecido. 
b) Sabe-se que os cristais de colesterol não se coram 
normalmente com o Sudan black; além disso, os 
fosfolipídeos se dissolvem no álcool (que é o solvente do 
corante). Estes dois problemas podem ser contornados 
usando-se uma solução de brometo da seguinte forma: 
Obtidos os cortes, deixá-los em uma solução aquosa de 
brometo a 2,5%, por 1 hora e, em seguida, lavar em uma 
solução aquosa de 0,5% de metabissulfito de sódio para 
retirar o excesso de brometo; lavar em água corrente e 
imergir na solução corante. 
 
 
 
 
POLISS 1 
4. POLISSACARÍDEOS 
 
 
4.1. AZUL DE TOLUIDINA 
 
Solução corante: 
Azul de Toluidina 0,5% em água destilada 
 
Procedimento: 
Corar as lâminas durante 1 a 2 horas. 
Lavar em água destilada. 
Montar. 
 
Resultado: 
Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA e 
polissacarídeos ácidos, com diferentes intensidades de 
cor, conforme a quantidade de grupamentos ácidos. 
 
 
4.2. ALCIAN BLUE, pH 2,5 
Mowry, R.W.; Ann. N.Y. Acad. Sci, 106 (2): 402-423, 1963. 
 
Solução corante: Alcian Blue 8GX 1% em solução aquosa de 
ácido acético a 3% 
 
Preparo da solução corante: 
97 ml de água destilada 
3 ml de ácido acético glacial 
1 g de Alcian Blue 8GX 
 
Medir o pH da solução e, se necessário, acertá-lo com HCl 
1N ou NaOH 1N. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Passá-los em solução aquosa de ácido acético 3% durante 3 
minutos. 
Corar pela solução corante, por 2 horas. 
Enxugar o excesso de corante. 
Lavar em ácido acético 3%, durante 3 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
POLISS 2 
Resultado: 
Coram-se, em azul turquesa, carboidratos complexos ricos 
em grupos carboxilas, ácido hialurônico, carboibratos 
fracamente sulfatados, carboidratos ricos em ácido 
siálico. Os carboidratos fortemente sulfatados coram-se 
fracamente ou não se coram. 
 
 
4.3. ALCIAN BLUE pH 0,5 e 1,0 
 
Solução corante: solução de Alcian Blue 1% em HCl 0,2 N. 
 
Preparo da solução: 
1 g de Alcian Blue 8GX 
100 ml de HCl 0,2N (para pH 0,5) ou 
100 ml de HCl 0,1N (para pH 1,0). 
 
Para 100 ml de HCl 0,2N: 1,65 ml de HCl em 98,3 ml de H2O. 
Para 100 ml de HCl 0,1N: 0,83 ml de HCl em 99,17 ml de 
H2O. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Passar no HCl 0,2N ou 0,1N, por 3 minutos. 
Corar na solução corante por 30 minutos. 
Passar em HCl 0,2N ou 0,1N. 
Lavar rapidamente em água destilada. 
Desidratar e montar. 
 
Resultado: 
Locais ricos em polissacarídeos sulfatados coram-se em 
azul, portanto não cora ácido hialurônico (não-sulfatado). 
 
 
4.4. METILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + ALCIAN BLUE, pH 2,5 
 
O processo de metilação em alta temperatura promove o 
bloqueio da basofilia dos polissacarídeos sulfatados e 
carboxilados; a saponificação posterior restaura a 
basofilia somente dos polissacarídeos carboxilados. 
 
Solução para metilação: 
99,2 ml de álcool metílico (metanol) 
0,8 ml de HCl 
 
POLISS 3 
Solução para saponificação: 
Solução de BaOH a 4% em álcool 80° 
ou 
1 g de hidróxido de potássio 
70 ml de álcool absoluto 
30 ml de água destilada 
 
Procedimento: 
Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcool 
absoluto. 
Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, 
passar 5 minutos no álcool 70° e levar até álcool 
absoluto. 
Colocar os cortes A e B na solução metiladora pré aquecida 
por 2 a 5 horas a 60°C. O corte C deve permanecer em água 
destilada pelo mesmo tempo e na mesma temperatura. 
Lavar em água corrente e colocar todos os cortes em álcool 
70°. 
Tratar o corte A com uma das soluções saponificadoras, por 
uma hora à temperatura ambiente. Os cortes B e C devem 
permanecer em álcool 70°. 
Lavar em água corrente por 5 minutos. 
Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as por 
álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-
éter em partes iguais. 
Lavar em água, ou em solução de ácido acético a 3%, caso a 
manutenção do pH seja importante. 
Corar todos os cortes com Alcian Blue, pH 2,5, por 5 a 30 
minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: 
Corte C (Alcian): coram-se os polissacarídeos carboxilados 
e sulfatados; 
Corte B (metilação + Alcian): bloqueia a coloração dos 
polissacarídeos carboxilados e sulfatados; 
Corte A (metilação + saponificação + Alcian): coram-se 
somente os polissacarídeos carboxilados. 
 
POLISS 4 
Interpretação: 
Caso o corte A fique tão corado quanto o corte C: indica a 
presença de polissacarídeos carboxilados somente. 
Caso o corte A fique menos corado que o corte C: indica a 
presença de polissacarídeos carboxilados e sulfatados. 
Caso o corte A não se core pelo Alcian: indica a presença 
de polissacarídeos sulfatos somente. 
 
Observações: 
a) Sempre que realizar este método colocar para correr 
junto três lâminas de um material já previamente testado 
com bons resultados. 
b) O colódio deve ser bem removido, pois ele se cora com o 
Alcian Blue, interferindo com o resultado. 
 
 
4.5. MÉTODO DA HIDRÓLISE ÁCIDA + ALCIAN BLUE (Quintarelli) 
 
Solução para hidrólise: 
acetato de sódio a 0,02M: 0,164 g em 100 ml de água 
 0,273 g , se for trihidratado. 
ácido clorídrico a 0,02N: 0,164 ml em 100 ml água 
Misturar as duas soluções em partes iguais. 
Medir o pH e acertar para 2,5. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e levar até álcool absoluto dois cortes (A e 
B). 
Colodionar os cortes. 
Deixar secar, passar no álcool e água destilada. 
Colocar o corte A na solução de hidrólise, durante 2 horas 
a 60°C. Acompanhar o procedimento com o corte B, coberto 
com água destilada. 
Descolodionar oscortes com mistura de álcool-éter (partes 
iguais). 
Corar pelo Alcian Blue pH 2,5, durante 30 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultados: 
Estruturas Alcian Blue positivas na lâmina B, que 
diminuírem ou perderem positividade na lâmina A, indicam a 
presença de ácido siálico. 
Pode-se aumentar o tempo ou a temperatura de hidrólise 
para obtenção de melhores resultados. 
 
 
4.6. ALCIAN BLUE + PAS 
POLISS 5 
 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Colocá-los por 30 minutos em solução de Alcian Blue, pH 
2,5. 
Lavar em solução de ácido acético a 3%. 
Passar em água destilada. 
Deixar por 10 minutos em ácido periódico a 1%. 
Lavar rapidamente em água destilada. 
Deixar por 1 hora no Reativo de Schiff (ver preparo do 
reativo de Schiff no ítem PAS, em Histoquímica de 
Polissacarídeos). 
Lavar em água corrente por 10 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Glicogênio e polissacarídeos neutros em vermelho. 
Polissacarídeos ácidos em azul. 
A cor violeta representa associação de ambos. 
 
 
4.7. ALCIAN BLUE + CONCENTRAÇÃO ELETROLÍTICA CRÍTICA 
 
Solução corante: 
0,05 g de Alcian Blue 
100 ml de tampão acetato 0,2M, pH 5.8 
Adicionar MgCl2.6H2O (PM = 203,30) nas diversas 
molaridades requeridas 0,3M, 0,65M, 0,9M e 1M. 
 
Procedimento: 
Desparafinar e hidratar as lâminas. 
Corar pelas soluções de Alcian Blue com as diferentes 
concentrações de MgCl2, por 18 horas, à temperatura 
ambiente. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
POLISS 6 
Resultado: 
A presença de uma concentração eletrolítica maior na 
solução corante proporciona uma coloração seletiva dos 
polissacarídeos de acordo com o grau crescente de 
sulfatação. 
Com MgCl2 0,3M: coram-se todos os polissacarídeos 
carboxilados e sulfatados. 
Com MgCl2 0,65M: coram-se todos os polissacarídeos 
sulfatados. 
Com MgCl2 0,9M: coram-se heparina, heparam sulfato e 
queratam sulfato. 
Com MgCl2 1M: cora-se somente queratam sulfato. 
 
 
4.8. REAÇÃO FERRO-COLOIDAL (Mowrey) 
 
Preparo da solução estoque de ferro-coloidal: 
Preparar 5 ml de solução de cloreto férrico a 29% (1,45 g 
de cloreto férrico em 5 ml de água). 
Ferver 250 ml de água destilada. 
Com a água fervendo, adicionar 4,4 ml da solução de 
cloreto férrico. Deixar ferver. Quando a solução ficar 
vermelho escuro suspender a fervura e deixar esfriar. 
Dializar a solução contra água destilada gelada 18-24 
horas duas vezes. 
Guardar a solução estoque na geladeira. Dura muitos meses. 
Na hora de usar, diluir esta solução estoque na seguinte 
proporção: 
12 ml de ácido acético 
18 ml de água destilada 
10 ml solução estoque de ferro-coloidal 
 
Preparo da solução de ferrocianeto clorídrica: 
Preparar 15 ml de solução de ferrocianeto de potássio a 
2%: 0,3 g de ferrocianeto de potássio em 15 ml de água. 
Preparar 30 ml de ácido clorídrico 1%: 0,3 ml de HCl em 30 
ml de água. 
Misturar as duas soluções na hora de usar. 
 
Procedimento para reação: 
Desparafinar e hidratar o corte. 
Lavar rapidamente em ácido acético 10%. 
Colocar na solução de ferro coloidal recém-preparada, 
durante 2 horas. 
Lavar em 3 banhos de ácido acético 10%, 3 minutos cada. 
POLISS 7 
Colocar os cortes expostos ao ferro e os cortes controles 
(que ficaram na água) durante 20 minutos na solução de 
ferrocianeto-clorídrica. 
Lavar em água corrente 5 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Cora polissacarídeos ácidos em azul 
 
Observação: 
a) O ferro coloidal é adsorvido pelos polissacarídeos e é 
visualizado com a subseqüente conversão para ferrocianeto-
férrico (azul da Prússia). 
 
 
4.9. REAÇÃO DO FERRO COLOIDAL (Muller, 1966) 
 
Preparo da solução estoque de hidróxido de ferro coloidal: 
solução aquosa de cloreto férrico a 32%............12 ml 
água destilada....................................750 ml 
Levar a água à ebulição e, quando ferver, ajuntar a 
solução de cloreto férrico. Dura um mês, no máximo. 
Solução de trabalho (preparar na hora de usar): 
solução de hidróxido de ferro coloidal..........100 ml 
ácido acético....................................10 ml 
 
Preparo da solução de ferrocianeto de potássio: 
Ferrocianeto de potássio..............1 g 
HCl concentrado......................1 ml 
Água destilada......................99 ml 
 
Procedimento: 
Desparafinar os cortes e levá-los até a água. 
Tratar com a solução de trabalho de hidróxido de ferro 
coloidal, durante 10 minutos. 
Lavar 5 vezes em água destilada. 
Tratar pela solução ferrocianeto clorídrica recém 
preparada, por 10 minutos. 
Lavar em água destilada. 
Montar. 
 
Resultado: 
Coram-se os polissacarídeos ácidos em azul. 
 
 
4.10. PAS (ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF) 
 
Solução de ácido periódico a 1%: 
POLISS 8 
Esta solução pode ser preparada de duas maneiras: 
periodato de sódio ou potássio ............1 g 
ácido sulfúrico 1N.......................100 ml 
ou, a mais usada: 
ácido periódico............................1 g 
água destilada...........................100 ml 
 
 
PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF: 
Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963 
 
Água destilada........................192 ml 
Ácido clorídrico concentrado............8 ml 
Fucsina Básica (Color Index 42510)....0,5 g 
Sulfito de sódio (Na2SO3)...............5 g ou 
Metabissulfito de sódio (Na2S2O5).....3,8 g 
Carvão ativado........................0,5 g 
 
Dissolver a fucsina na água adicionada de ácido 
clorídrico. 
Junte o sulfito ou o metabissulfito. Fechar o frasco. 
Agitar por 20 a 30 minutos até que a mistura esteja 
límpida e de cor marrom avermelhado. Adicione o carvão 
ativado para descolorir. Agitar por 2 minutos e 
filtrar. O filtrado deverá ser incolor. O reativo 
somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 horas após 
sua preparação. Guardar na geladeira. 
 
Observações sobre o Reativo de Schiff: 
a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido; 
se não, rejeitá-lo. 
b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo este 
pode descolorir totalmente ou ficar com coloração 
amarelo palha; em qualquer dos casos está bom para ser 
utilizado. 
c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do 
mesmo em alguns mililitros de formol a 10%. Se a 
solução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode ser 
usado. 
 
POLISS 9 
Procedimento para a realização do método PAS: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Colocar no ácido periódico, durante 10 a 15 minutos, na 
geladeira. 
Lavar em várias trocas de água destilada ou lavar 5 
minutos na água corrente e, em seguida, passar pela água 
destilada. 
Colocar no reativo de Schiff durante 1 hora, no escuro, na 
geladeira ou durante 15 minutos, no escuro, à temperatura 
ambiente. 
Lavar em água corrente por 5 a 10 minutos. 
Montar. 
 
Resultado: 
Locais ricos em glicogênio ou polissacarídeos neutros, 
contendo grupos 1,-2 glicol, coram-se em vermelho. Os 
proteoglicanos não se coram. 
 
Observações: 
a) Ao retirar-se do Reativo de Schiff pode-se passar pelas 
seguintes soluções: 
bissulfito de sódio 2% durante 2 minutos 
ou 
vários banhos de HCl 3N durante 2 minutos 
ou 
3 banhos de água sulfurosa de 2 minutos cada 
Preparo da água sulforosa: 
Metabissulfito de sódio a 10% ...............10 ml 
HCl 1N.......................................10 ml 
Água destilada...............................180 ml 
De modo geral, estes banhos são desnecessários. 
b) Para material incluído em historesina o ácido periódico 
deve ser a 0,4% e os cortes devem ficar no Reativo de 
Schiff por 30 minutos. 
 
 
4.11. ACETILAÇÃO + SAPONIFICAÇÃO + PAS 
 
Solução acetiladora: 
Anidrido acético..................32,5 ml 
Piridina..........................50,0 ml 
 
Solução saponificadora: 
Solução de BaOH a 4% em álcool 80° 
 
POLISS 10 
Procedimento: 
Desparafinar três cortes (A, B, C) e levá-los até álcool 
absoluto. 
Colodionar os cortes com celoidina a 0,5%. Deixar secar, 
passar 5 minutos no álcool70° e levar até álcool 
absoluto. 
Passar os corte A e B na piridina por 2 minutos. 
Colocar os cortes A e B na solução acetiladora recém-
preparada, durante 24 horas à temperatura ambiente. O 
corte C deve permanecer em água destilada pelo mesmo tempo 
e na mesma temperatura. 
Lavar em álcool absoluto. 
Recolodionar os cortes. 
Passar no álcool 70° por 5 minutos. 
Passar no álcool 80°. 
Colocar o corte A na solução saponificadora, por 4 a 5 
minutos, a temperatura ambiente. Os cortes B e C devem 
permanecer no álcool 80°. 
Lavar em água destilada. 
Remover o colódio de todas as lâminas, passando-as por 
álcool absoluto e, em seguida, por uma mistura de álcool-
éter em partes iguais. 
Lavar em água. 
Realizar o método de PAS. 
 
Resultado: 
Corte C (PAS): coram-se o glicogênio e os polissacarídeos 
neutros. 
Corte B (acetilação + PAS): bloqueia a coloração dos 
polissacarídeos neutros. 
Corte A (acetilação + saponificação + PAS): 
polissacarídeos neutros bloqueados pela acetilação voltam 
a se corar. 
 
 
4.12. P.A.S. + BOROHIDRIDO 
 
Solução de borohidrido de sódio: 
Borohidrido de sódio (NaBH4 ; P.M = 37,83)........0,1 g 
Na2HPO4 (anidro)..................................1,0 g 
Água destilada...................................100 ml 
Dissolver o fosfato de sódio na água e então acrescentar o 
borohidrido. Preparar solução nova cada vez que for usar. 
O pH deve ser 9,4. 
 
POLISS 11 
Procedimento: 
Desparafinar três lâminas (A, B e C) e levar até a água. 
Tratar a lâmina A e B com ácido periódico a 1%, por 30 
minutos. A lâmina C deve permanecer no ácido periódico por 
24 horas. 
Lavar bem as lâminas em água destilada. 
Tratar a lâmina B com a solução de borohidrido, por 30 
minutos, enquanto a lâmina A espera em solução aquosa de 
Na2HPO4 .sem o borohidrido. 
Lavar as lâminas em água corrente. 
Tratar as lâminas com Reativo de Schiff, por 15 minutos. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: 
Lâmina A: somente os polissacarídeos neutros e o 
glicogênio aparecem corados em magenta (P.A.S. normal). 
Lâmina B: bloqueio total da coloração dos polissacarídeos 
neutros e do glicogênio. 
Lâmina C: coram-se, em magenta, tanto os polissacarídeos 
neutros quanto os ácidos (glicosaminoglicanas). 
 
Observação: 
a) Com o tempo maior de exposição ao ácido periódico (24 
horas) os grupamentos 1,2 glicol das glicosaminoglicas 
também dão origem a aldeídos e reagem com o Reagente de 
Schiff. 
b) o borohidrido serve para bloquear a positividade do 
P.A.S. 
c) Aconselha-se usar cortes colhidos em lâminas com algum 
tipo de adesivo e/ou colodionar os cortes. 
d) O tempo durante o qual as lâminas A e B permanecem no 
primeiro ácido é 30 minutos, ao invés dos 10 a 15 minutos 
do P.A.S. de rotina. Assim, as glicoproteínas neutras e o 
glicogênio produzam o máximo de grupamentos aldeídos neste 
estágio, para que sejam efetivamente bloqueados pelo 
borohidrido. 
 
 
 
 
 
 
 
ACNUCL 1 
5. ÁCIDOS NUCLÉICOS 
 
 
5.1. COLORAÇÃO DE ACRIDINE ORANGE (Ganter e Jolles) 
 
Solução estoque de Acridine Orange: 
Acridine Orange....................1 g 
H2O destilada...................1000 ml 
 
Solução de Trabalho: 
Solução Estoque de Acridine Orange.........10 ml 
PBS (pH 6,0 a 6,5).........................90 ml 
 
Corar 15 minutos na solução de trabalho de acridine 
orange. 
Lavar em PBS. 
Cobrir a lâmina com glicerina e observar no microscópio de 
fluorescência. 
 
Observações: 
a) A fixação do material deve ser feita em Carnoy ou 
etanol acético; para esfregaços ou culturas de células a 
fixação deve ser feita em acetona metanol. 
b) O preparado descora e muda de cor depois de um tempo. 
c) Alguns autores recomendam, após lavar no PBS, passar em 
uma solução de cloreto de cálcio 0,1M, por 1 a 2 minutos 
e, em seguida, lavar em PBS por 10 segundos, antes de 
montar. 
 
Resultado: coram-se as estruturas ricas em ácidos 
nucléicos. 
 
 
5.2. AZUL DE TOLUIDINA ÁCIDO 
 
Solução corante: 
Azul de Toluidina 0,5% em água; pH 3,5 (acertar com HCl 
0,1N) 
 
Procedimento: 
Corar as lâminas durante 1 a 24 horas a 60°C (com o 
corante pré-aquecido a esta temperatura). 
Lavar em água destilada. 
Imergir em molibdato de sódio ou potássio 1%, por 30 
segundos, para evitar descoloração posterior. 
Montar. 
 
ACNUCL 2 
Resultado: 
Cora estruturas ácidas presentes no tecido: DNA, RNA e 
polissacarídeos ácidos. 
 
 
5.3. MÉTODO DE FEULGEN PARA DNA 
 
Solução de ácido clorídrico 1N: 8,5 ml de HCl em 91,5 ml 
de água destilada. 
 
Solução aquosa de metabissulfito de sódio ou de potássio a 
0,5%. 
 
Reativo de Schiff. 
 
PREPARO DO REATIVO DE SCHIFF 
Am N Y Acad Sci, 106(2): 402-423, 1963. 
 
Água destilada.........................192 ml 
Ácido clorídrico concentrado.............8 ml 
Sulfito de sódio (Na2SO3)................5 g ou 
Metabissulfito de sódio (Na2S2O5)......3,8 g 
Fucsina Básica (Color Index 42510).....0,5 g 
Carvão ativado.........................0,5 g 
 
Dissolver a fucsina na água adicionada de ácido 
clorídrico. Juntar o sulfito ou o metabissulfito. 
Fechar o frasco. Agitar por 20 a 30 minutos até que a 
mistura esteja límpida e de cor marrom avermelhado. 
Adicionar o carvão ativado para descolorir. Agitar por 
2 minutos e filtrar. O filtrado deverá ser incolor. O 
reativo somente poderá ser utilizado, no mínimo, 6 
horas após sua preparação. Guardar na geladeira. 
 
Observações sobre o Reativo de Schiff: 
a) O reativo deve apresentar-se perfeitamente límpido; 
se não, rejeitá-lo. 
b) Quando se coloca o carvão ativado no reativo este 
pode descolorir totalmente ou ficar com coloração 
amarelo palha; nos dois casos está bom para ser usado. 
c) Para testar o Reativo de Schiff pingar gotas do 
mesmo em alguns mililitros de formol a 10%; se a 
solução ficar vermelho-púrpura, o reativo pode ser 
usado. 
 
ACNUCL 3 
Procedimento para realização do método de Feulgen: 
Desparafinar e hidratar os cortes. 
Hidrolisar os cortes, a 60°C, durante 5 a 20 minutos, no 
ácido clorídrico 1N pré-aquecido a esta temperatura. 
Interromper a hidrólise através de uma lavagem em água 
destilada. 
Transferir para o Reativo de Schiff, durante 45 minutos. 
Lavar os cortes em três banhos de metabissulfito de sódio 
ou potássio durante 2 minutos cada. 
Lavar em água corrente. 
Montar. 
 
Resultado: 
O DNA nuclear cora-se em vermelho escuro. 
Os núcleos de microorganismos, como plasmódios, 
sarcosporídeos, toxoplasma, histoplasma, etc., coram-se em 
vermelho pálido devido ao seu baixo teor de DNA. 
 
Observações sobre o método de Feulgen: 
a) O metabissulfito utilizado deve ser ativo. Conhece-se 
pelo seu forte cheiro característico. 
b) O tempo de hidrólise com ácido clorídrico varia com o 
tipo de fixador que foi usado e com o tempo de fixação. No 
caso do formol, o tempo de hidrólise é ao redor de 8 
minutos; para o Bouin, deve ser um pouco menor; para o 
Helly, deve ser ao redor de 5 minutos. Para obter bons 
resultados convém testar vários tempos de hidrólise, entre 
5 a 15 minutos para cada bloco utilizado. 
c) O método de Feulgen baseia-se no fato de que o HCl 
quebra a ligação purina-desoxiribose formando grupamentos 
aldeídicos, que podem ser visualizados pelo Reativo de 
Schiff pela formação de um novo composto de adição 
insolúvel e de cor vermelho forte. O processo de hidrólise 
não afeta o RNA, de modo que o método é específico para 
DNA. 
d) Se quiser, antes de montar, contracorar em solução 
0,01% Fast Green - FCF em álcool 95° durante alguns 
segundos. 
e) Se a lâmina estiver colodionada, deve-se retirar o 
colódio antes de tratar pelo Reativo de Schiff. 
 
 
ACNUCL 4 
5.4. GALOCIANINA 
 
Solução corante: 
10 g de alúmen de cromo 
0,3 g de galocianina 
200 ml de água destilada 
 
Dissolver o álumen em 200 ml de água e acrescentar a 
galocianina. Misturar por agitação e