Livro Texto - Unidade I MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLINICA UNIP

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Autor: Prof. Flávio Buratti Gonçalves
Colaborador: Prof. Luiz Henrique Cruz de Mello
Microbiologia e 
Micologia Clínica
Professor conteudista: Flávio Buratti Gonçalves
Biomédico graduado pela Universidade de Mogi das Cruzes (1996), especialista em Diagnóstico Laboratorial de 
Doenças Tropicais pela FMUSP, especialista em Acupuntura Tradicional Chinesa, mestre em Saúde Pública pela Faculdade 
de Saúde Pública da USP (2000). Doutor em Patologia Ambiental e Experimental pela UNIP (2017). Habilitações nas 
áreas de Análises Clínicas, Microbiologia, Imunologia, Parasitologia, Saúde Pública e Acupuntura. Atualmente, é 
coordenador do curso de Biomedicina na modalidade semipresencial e docente da UNIP nas áreas de Microbiologia, 
Imunologia, Parasitologia, Bioquímica. Linhas de pesquisa: Patologia Ambiental e Experimental (Neuroimunopatologia), 
Microbiologia e Imunologia. É membro do Banco de Avaliadores (Basis) do Inep.
© Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou 
quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem 
permissão escrita da Universidade Paulista.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
G635m Gonçalves, Flavio Buratti.
Microbiologia e Micologia Clínica / Flavio Buratti Gonçalves. – 
São Paulo: Editora Sol, 2021.
168 p., il.
Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e 
Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230.
1. Identificação. 2. Cultura. 3. Técnica. I. Título.
CDU 576.8
U512.65 – 21
Prof. Dr. João Carlos Di Genio
Reitor
Prof. Fábio Romeu de Carvalho
Vice-Reitor de Planejamento, Administração e Finanças
Profa. Melânia Dalla Torre
Vice-Reitora de Unidades Universitárias
Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez
Vice-Reitora de Pós-Graduação e Pesquisa
Profa. Dra. Marília Ancona-Lopez
Vice-Reitora de Graduação
Unip Interativa – EaD
Profa. Elisabete Brihy 
Prof. Marcello Vannini
Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar
Prof. Ivan Daliberto Frugoli
 Material Didático – EaD
 Comissão editorial: 
 Dra. Angélica L. Carlini (UNIP)
 Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR)
 Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT)
 Apoio:
 Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD
 Profa. Deise Alcantara Carreiro – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos
 Projeto gráfico:
 Prof. Alexandre Ponzetto
 Revisão:
 Bruno Barros
 Vera Saad
Sumário
Microbiologia e Micologia Clínica
 
APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7
INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................7
 
Unidade I
1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA ..............................................................................................9
1.1 Considerações gerais sobre a microbiologia no laboratório de análises 
clínicas – principais equipamentos e níveis de biossegurança ....................................................9
1.2 Principais métodos de coloração, meios de cultura e técnicas de 
semeadura aplicados na prática da microbiologia ........................................................................ 18
1.3 Automação no laboratório de microbiologia clínica ............................................................. 28
1.4 Introdução à coleta de material biológico para prática em 
microbiologia clínica .................................................................................................................................. 31
1.5 Resistência bacteriana aos antimicrobianos e microrganismos multirresistentes – 
condutas do laboratório de microbiologia clínica em infecções hospitalares.................... 35
2 IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS, NEISSERIAS E BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ......................41
2.1 Identificação presuntiva dos estafilococos ................................................................................ 41
2.2 Identificação presuntiva dos estreptococos ............................................................................. 44
2.3 Identificação presuntiva de Neisserias ........................................................................................ 48
2.4 Identificação presuntiva de bactérias anaeróbias................................................................... 50
3 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS; BACILOS GRAM-NEGATIVOS 
NÃO FERMENTADORES E BACILOS CURVOS (ESPIRALADOS) ........................................................... 55
3.1 Identificação presuntiva de enterobactérias ........................................................................... 55
3.2 Identificação presuntiva de bacilos Gram-negativos não fermentadores .................... 62
3.3 Identificação presuntiva de bacilos curvos (espiralados) ..................................................... 65
4 PROTOCOLOS ESPECIAIS NO DIAGNÓSTICO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA ............................. 67
4.1 Urocultura ............................................................................................................................................... 67
4.1.1 Tipos de amostra ..................................................................................................................................... 68
4.1.2 Procedimento ........................................................................................................................................... 69
4.1.3 Laminocultivo (sistema comercial) .................................................................................................. 72
4.2 Coprocultura .......................................................................................................................................... 73
4.2.1 Procedimento ........................................................................................................................................... 75
4.3 Hemocultura........................................................................................................................................... 77
4.3.1 Procedimento ........................................................................................................................................... 79
4.4 Culturas de secreções e feridas ...................................................................................................... 82
4.4.1 Cultura de secreção prostática, vaginal, cervical e uretral .................................................... 82
4.4.2 Cultura de secreções de oro e nasofaringe .................................................................................. 85
4.4.3 Cultura de escarro .................................................................................................................................. 86
4.4.4 Cultura de aspirado traqueal, lavado bronco alveolar (BAL) e escovado brônquico ...87
4.4.5 Cultura de secreção ocular e de ouvido ........................................................................................ 88
4.5 Cultura de ponta de catéter ............................................................................................................ 89
4.6 Culturas de liquor e de líquidos especiais ................................................................................. 91
4.6.1 Processamento da amostra e análise dos resultados da cultura de LCR ......................... 92
4.6.2 Coleta, processamento e análise da cultura de fluidos biológicos ..................................... 93
Unidade II
5 MICOLOGIA CLÍNICA ..................................................................................................................................... 99
5.1 Importância clinica dos fungos e aspectos fisiopatológicos gerais................................. 99
5.2 Características gerais das micoses .............................................................................................1035.2.1 Micoses superficiais e cutâneas .....................................................................................................103
5.2.2 Micoses subcutâneas ...........................................................................................................................105
5.2.3 Micoses sistêmicas ..............................................................................................................................105
5.2.4 Micoses oportunistas .........................................................................................................................107
5.3 Aspectos gerais do diagnóstico micológico ...........................................................................110
6 TÉCNICAS E PROTOCOLOS PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS 
LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS .......................................................................................................115
6.1 Identificação de fungos leveduriformes ...................................................................................115
6.2 Identificação de fungos filamentosos ......................................................................................118
6.3 Métodos moleculares e alternativos para identificação de 
fungos patogênicos .................................................................................................................................119
Unidade III
7 VIROLOGIA CLÍNICA .....................................................................................................................................125
7.1 Principais doenças virais de importância clínica .................................................................125
7.2 Prevenção de doenças virais – vacinas e drogas antivirais ...............................................134
8 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES VIRAIS ..................................................................................................137
8.1 Técnicas clássicas em virologia .....................................................................................................138
8.2 Técnicas moleculares em virologia ..............................................................................................141
8.3 Técnicas imunosorológicas aplicadas em virologia .............................................................144
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APRESENTAÇÃO
Objetiva-se, com este livro-texto, apresentar os principais tópicos que norteiam a microbiologia clínica 
por meio do estudo da bacteriologia, micologia e virologia. O livro-texto apresenta as principais doenças 
de etiologia bacteriana, fúngica e viral, as principais formas de prevenção, tratamento e diagnóstico. São 
apresentados, também, os principais equipamentos utilizados em laboratório de microbiologia clínica 
e automação em microbiologia clínica. São vistos os conceitos básicos de biossegurança e conceitos 
importantes de infecção hospitalar e de como elas podem ser classificadas e identificadas. Discute-se, 
ainda, a problemática da resistência microbiana aos antibióticos, antifúngicos e antivirais. Objetiva-se, 
também, abordar de forma minuciosa os principais protocolos e métodos utilizados em microbiologia 
clínica para o diagnóstico das doenças de etiologia infecciosa, como urocultura, coprocultura, 
hemocultura, cultura de secreções, entre outras.
Serão abordados exemplos de infecções e de como proceder para a identificação do agente 
causal associado a partir de fluxogramas e sequências didáticas que irão favorecer uma conduta 
assertiva e eficaz. Também serão vistas, mais a fundo, as principais técnicas utilizadas no diagnóstico 
micológico e virológico, nesse caso, incluindo técnicas clássicas e as mais atuais relacionadas ao 
diagnóstico imunológico e de biologia molecular.
INTRODUÇÃO
Neste livro-texto, estudaremos os principais tópicos relacionados ao estudo da bacteriologia, 
micologia e virologia clínica, reconhecendo as formas como ocorre o desenvolvimento das principais 
doenças de origens bacterianas, fúngicas e virais, suas formas de prevenção, tratamento e de diagnóstico.
Este livro-texto destina-se a servir como instrumento da aprendizagem para os estudantes da área 
da saúde por meio de uma visão ampla da microbiologia clínica, buscando ser atrativo e didático.
Os conteúdos selecionados buscam atender de forma objetiva, clara e concisa os conceitos mais 
relevantes da patologia geral, patologia específica e da anatomia patológica. Com esse aprendizado, o 
estudante adquire as habilidades e competências necessárias à formação do biomédico, estando apto a 
reconhecer as alterações do estado de saúde, reconhecer e interpretar a evolução das doenças e elaborar 
um plano preventivo, além de propostas terapêuticas e de diagnóstico.
Bons estudos!
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Unidade I
1 INTRODUÇÃO À MICROBIOLOGIA CLÍNICA
1.1 Considerações gerais sobre a microbiologia no laboratório de análises 
clínicas – principais equipamentos e níveis de biossegurança 
O laboratório é um espaço físico com parâmetros ambientais controlados, equipado com diversos 
instrumentos de medição que permitem a correta medida ou análise das grandezas físicas. Nele, 
realizam-se os procedimentos experimentais, cálculos, medições, análises químicas, físicas ou biológicas 
e demais funções que exijam controle e precisão alcançáveis apenas em ambiente planejado para tal. 
O objetivo do laboratório de microbiologia não é apenas apontar o responsável por um determinado 
estado infeccioso, mas, sim, indicar, através do monitoramento de populações microbianas, qual o perfil 
dos microrganismos que estão interagindo com o homem. Com essas informações, a equipe de saúde 
é capaz de definir quais microrganismos podem ser responsáveis pelo quadro clínico do paciente e, 
assim, propor um tratamento mais adequado. No entanto, para alcançar esses objetivos, os laboratórios 
de microbiologia devem possuir estrutura capaz de estabelecer informações sobre a melhor amostra 
biológica, reconhecer a microbiota normal e os contaminantes, identificar microrganismos cujo 
tratamento beneficia o paciente, identificar microrganismos com propósitos epidemiológicos, obter 
resultados rápidos em casos de emergência, racionalizar no uso de antimicrobianos, realizar o transporte 
rápido das amostras e o relato dos resultados e manter uma educação médica contínua em relação aos 
aspectos da infecção hospitalar.
Entre os equipamentos e vidrarias mais utilizados na prática da microbiologia clínica destacam-se: 
• Autoclave: é o equipamento responsável pela esterilização a partir do calor úmido, em que, 
através do vapor, promove a desnaturação de proteínas dos microrganismos. O equipamento 
consiste em uma câmara de vapor, com a temperatura de ebulição em torno de 121 °C. A autoclave 
é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia, na esterilização de meios de 
cultura, água, suspensões, entre outros. O tempo de autoclavagem deve ser respeitado de acordo 
com o material a ser esterilizado. O equipamento deve ser aberto com cautela, quando a pressão 
chegar a zero, pois o vapor liberado é de alta temperatura. Recomenda-se a utilização de luvas de 
amianto para abrir a autoclave. 
• Estufas de esterilização (fornos de Pasteur): esse equipamento é utilizado para esterilização a 
seco, a temperatura de 170-200 °C por 1-2 horas, recomendado o uso para as vidrarias.
• Refrigerador: após o preparo de meio de culturas, para garantir a conservação dos microrganismos, 
recomenda-se deixá-los sob baixa temperatura.
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Unidade I
Figura 1 – Autoclave 
Disponível em: https://bit.ly/3y36m6a. Acesso em: 28 jun. 2021.
• Estufa bacteriológica: auxilia no crescimento dos microrganismos devido à incubação ser em 
temperatura ideal.
• Mesa agitadora (rumbeira): auxilia no crescimento de microrganismos aeróbios, pois a mesa 
agitadora, através dos movimentos rotatórios, dissolve o oxigênio do meio de cultura.
• Capela de fluxo laminar: câmara asséptica, dotada de exaustore lâmpada fluorescente, utilizada 
na repicagem de microrganismos.
• Fermentador: equipamento no qual ocorrem as fermentações, podendo ser dotado de sistemas 
de agitação, aeração e refrigeração.
• Placa de Petri: utilizado para o isolamento de fungos e bactérias, pois a placa de petri tem 
uma superfície de crescimento grande e possibilita o crescimento de diversos microrganismos na 
mesma placa.
Figura 2 – Placa de Petri
Fonte: Oliveira (2018).
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Alça de Drigalsky: é utilizada para espalhar microrganismos em meio de cultura sólido.
Figura 3 – Alça de Drigalski
• Cabo de Kolle: é utilizado como suporte para o fio de platina ou liga de níquel-cromo, esse 
material (cabo de Kolle + fio de platina) é usado para a inoculação de microrganismos.
Importante salientar que, antes de qualquer procedimento no laboratório, a bancada deve ser limpa 
com solução detergente seguida de uma solução com álcool a 70%. Vale ainda lembrar que cada material 
ou equipamento possui uma forma correta de ser tratado, a fim de garantir sua desinfecção e padrão 
de limpeza mínimos para a realização eficiente dos processos microbiológicos. 
 Observação
Toda vidraria utilizada no laboratório de microbiologia, antes de ser 
preparada para esterilização, deverá estar limpa e seca. O material deve 
ser acondicionado também de forma adequada e cada material dispõe de 
uma forma correta para tal, a fim de garantir a qualidade dos procedimentos 
que serão realizados.
Não obstante os equipamentos utilizados, quando no laboratório de microbiologia clínica, deve-se 
atentar a todas as normas de biossegurança. Quando se lida com microrganismos potencialmente 
patogênicos e de alto risco para desenvolvimento de doença, classificamos os níveis de biossegurança 
em quatro, designados como NB-1, NB-2, NB-3 e NB-4, em que NB é a sigla reconhecida para nível 
de biossegurança.
Os laboratórios classificados como nível de biossegurança NB-1 são projetados para trabalhos 
com agentes biológicos de classe de risco 1. São locais apropriados para o treinamento educacional ou 
para o treinamento de técnicos e de professores de técnicas laboratoriais.
A principal contenção, em um laboratório NB-1, é o conjunto de boas práticas de laboratório, o que 
inclui a especificação adequada do uso de EPI, como aventais de mangas compridas e luvas descartáveis, 
não sendo fundamental a existência de fluxo laminar.
12
Unidade I
No manual de boas práticas, deve constar a especificação dos desinfetantes e produtos de limpeza, 
com a respectiva concentração. As salas devem ser separadas da área de passagem de pessoas por portas 
simples, e os revestimentos devem ser feitos com materiais que facilitem a limpeza. Esses revestimentos 
devem ser laváveis e não podem ser porosos. O esgoto do laboratório pode ser descartado na rede pública.
Devem existir pias para limpeza das mãos, lava-olhos e um chuveiro de emergência. As bancadas não 
podem ter emendas na superfície e devem ser resistentes ao ataque de produtos químicos. Deve existir 
um local para armazenamento de produtos de uso imediato, e o espaço entre as bancadas deve permitir 
a circulação de pessoas.
O laboratório deve ter acesso a uma autoclave para a esterilização de vidrarias e instrumentos e 
possuir um local específico para a colocação de objetos pessoais e de aventais. Deve ser colocado o 
símbolo de risco biológico na porta do laboratório.
O nível de biossegurança 2 é semelhante ao primeiro e é adequado ao trabalho que envolva 
agentes de risco moderado para as pessoas e o meio ambiente. Difere do NB-1 nos seguintes aspectos: 
o pessoal de laboratório deverá ter um treinamento específico no manejo de agentes patogênicos e 
deve ser supervisionado por cientistas competentes; o acesso ao laboratório deve ser limitado durante 
os procedimentos operacionais; precauções extremas serão tomadas em relação a objetos cortantes 
infectados; e determinados procedimentos nos quais exista a possibilidade de formação de aerossóis e 
borrifos infecciosos devem ser conduzidos em cabines de segurança biológica ou em outros equipamentos 
de contenção física.
O nível de biossegurança 3 é aplicável para laboratórios clínicos, de diagnóstico, ensino e pesquisa 
ou de produção, em que o trabalho com agentes exóticos possa causar doenças sérias ou potencialmente 
fatais como resultado de exposição por inalação. A equipe laboratorial deve possuir treinamento 
específico no manejo de agentes patogênicos e potencialmente letais, devendo ser supervisionada 
por competentes cientistas que possuam vasta experiência com os agentes. Todos os procedimentos 
que envolverem a manipulação de materiais infecciosos devem ser conduzidos dentro de cabines de 
segurança biológica ou de outro dispositivo de contenção física. Os manipuladores devem usar roupas 
e equipamentos de proteção individual. 
Sabe-se, porém, que algumas instalações existentes podem não possuir todas as características 
recomendadas para um nível de biossegurança 3 (por exemplo, uma área de acesso com duas portas, 
selamento das entradas de ar). Nessas circunstâncias, um nível aceitável de segurança para a condução 
dos procedimentos de rotina (por exemplo, procedimentos para diagnósticos envolvendo a reprodução 
de um agente para identificação, tipagem, teste de susceptibilidade etc.) poderá ser conseguido com 
instalações do nível de biossegurança 2, garantindo-se que o ar liberado do laboratório seja jogado para 
fora da sala, a ventilação do laboratório seja equilibrada para proporcionar um fluxo de ar direcionado 
para dentro da sala, o acesso ao laboratório seja restrito quando o trabalho estiver sendo realizado e as 
práticas padrão de microbiologia, as práticas especiais e o equipamento de segurança necessários para o 
nível de biossegurança 3 sejam rigorosamente cumpridos. A decisão de implementar essas modificações 
das recomendações do nível de biossegurança 3 deve ser tomada somente pelo diretor do laboratório.
13
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
O nível de biossegurança 4 é indicado para o trabalho que envolve agentes exóticos e perigosos 
que exponham o indivíduo a um alto risco de contaminação de infecções, que podem ser fatais, além de 
apresentarem um potencial elevado de transmissão por aerossóis. Os agentes com uma relação antigênica 
próxima ou idêntica à dos agentes incluídos no nível de biossegurança 4 deverão ser manipulados nesse 
nível até que se consigam dados suficientes para confirmação do trabalho, seja para esse nível ou nível 
inferior. A equipe do laboratório deverá ter um treinamento específico e completo, direcionado para a 
manipulação de agentes infecciosos extremamente perigosos, e deverá ser capaz de entender as funções 
da contenção primária e secundária das práticas padrão específicas, do equipamento de contenção e 
das características do planejamento do laboratório. 
Os trabalhadores deverão ser supervisionados por cientistas competentes, treinados e com vasta 
experiência no manuseio dos agentes. O acesso ao laboratório deverá ser rigorosamente controlado 
pelo diretor. 
A instalação deverá ser em um edifício separado ou em uma área controlada dentro do edifício que 
seja totalmente isolada de todas as outras. Um manual de operações específico para as instalações deverá 
ser preparado ou adotado. Dentro do ambiente de trabalho, todas as atividades deverão permanecer 
restritas às cabines de segurança biológica classes III ou II, usadas com roupas de proteção com pressão 
positiva e ventiladas por sistema de suporte de vida. 
O laboratório do nível de biossegurança 4 deverá possuir características específicas quanto ao projeto 
e à engenharia, para prevenção da disseminação de microrganismos no meio ambiente.
O quadro a seguir apresenta de forma resumida os padrões e práticas especiais, bem como os 
equipamentos de segurança e as instalações que deverão ser aplicados aos agentes designados aos 
níveis de biossegurança 1, 2, 3 e 4, respectivamente.
Quadro1 – Níveis de biossegurança recomendados para agentes infecciosos
NB Agentes Práticas 
Equipamentos de 
segurança (barreiras 
primárias) 
Instalações (barreiras 
secundárias)
1
Que não são conhecidos 
por causarem doenças em 
adultos sadios
Práticas padrão de 
microbiologia Não são necessários
Bancadas abertas com pias 
próximas
2
Associados com doenças 
humanas, risco de lesão 
percutânea, ingestão, 
exposição da membrana 
e mucos
Prática de NB-1 e acesso 
limitado, avisos de risco 
biológico, precauções com 
objetos perfurocortantes, 
manual de biossegurança 
que defina qualquer 
descontaminação de 
dejetos ou normas de 
vigilância médica
Barreiras primárias: 
cabines de classe I ou II 
ou outros dispositivos de 
contenção física usados 
para todas as manipulações 
de agentes que provoquem 
aerossóis ou vazamento 
de materiais infecciosos; 
procedimentos especiais 
como o uso de aventais, 
luvas e proteção para o 
rosto, quando necessário
NB-1 mais: autoclave 
disponível
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Unidade I
NB Agentes Práticas 
Equipamentos de 
segurança (barreiras 
primárias) 
Instalações (barreiras 
secundárias)
3
Agentes exóticos com 
potencial para transmissão 
via aerossol; a doença pode 
trazer consequências sérias 
ou até fatais
Práticas de NB-2 e 
acesso controlado, 
descontaminação de todo 
o lixo, descontaminação da 
roupa usada no laboratório 
antes de ser lavada, 
amostra sorológica
Barreiras primárias: cabines 
de classe I ou II ou outros 
dispositivos de contenção 
usados para todas as 
manipulações abertas de 
agentes; uso de aventais, 
luvas e proteção respiratória, 
quando necessário
NB-2 mais: separação 
física dos corredores de 
acesso, portas de acesso 
dupla com fechamento 
automático, ar de exaustão 
não recirculante, fluxo de 
ar negativo dentro 
do laboratório
4
Agentes exóticos ou 
perigosos de alto risco de 
doenças que ameaçam a 
vida, infecções laboratoriais 
transmitidas via aerossol 
ou relacionadas a agentes 
com risco desconhecido de 
transmissão
Prática de NB-3 e mudança 
de roupa antes de entrar, 
banho de ducha na 
saída, todo o material 
descontaminado na saída 
das instalações
Barreiras primárias: 
todos os procedimentos 
conduzidos em cabines 
de classe III, I ou II, 
juntamente com macacão 
de pressão positiva com 
suprimento de ar
NB-3 mais: edifício 
separado ou área isolada, 
sistemas de abastecimento 
e escape a vácuo e de 
descontaminação, outros 
requisitos sublinhados 
no texto
Adaptado de: Ministério da Saúde (2006).
Entendemos, portanto, que a biossegurança se resume ao conjunto de medidas e ações importantes 
e que devem necessariamente ser implementadas para a segurança do profissional e para a qualidade 
dos ensaios que são realizados. Além do que apresentamos sobre quatro níveis de biossegurança, faz-se 
importante relembrar conceitos básicos, os quais também podem ser encontrados de forma resumida 
no quadro anterior.
Quanto à vestimenta, é necessário utilizar roupas adequadas ao trabalho laboratorial, dessa forma, 
o profissional deve usar sempre calça comprida, visto que bermuda, shorts ou saias são incompatíveis 
com o ambiente; deve-se usar camisa ou camiseta, não sendo permitido o uso de camisetas regatas. Os 
sapatos devem ser fechados, não sendo permitido o uso de chinelos e sandálias. Deve-se usar jaleco de 
algodão, preferencialmente de mangas compridas, até a altura dos pulsos. O seu uso é restrito apenas 
ao laboratório. Ao sair do laboratório, deve-se tirar o jaleco e deixá-lo em local apropriado.
Quanto aos hábitos de higiene pessoal, em relação aos cabelos, eles devem ser mantidos sempre 
presos e, em alguns casos, a depender do tipo de procedimento, o uso de touca é essencial. O uso de 
cosméticos é incompatível com o trabalho realizado no laboratório. Não se deve, portanto, utilizar 
maquiagem. Deve-se, ainda, evitar o uso de unhas postiças. Manter as unhas naturais, curtas e sem 
esmaltes. Não usar adornos como anéis, pulseiras, relógios, entre outros.
Ao sair do laboratório, é necessário sempre lavar as mãos, pois durante todo o trabalho desenvolvido 
no ambiente laboratorial, serão manuseados diversos materiais biológicos, os quais podem conter 
microrganismos com diferente potencial de virulência e/ou patogenicidade, sem contar substâncias 
que podem trazer agravos de ordem química ou física. A limpeza das mãos tem como objetivo garantir que 
o profissional não leve consigo resíduo de reagentes ou agentes patogênicos, os quais podem causar 
irritação por contato em parte específicos do corpo, como olhos, nariz, orelha e boca, ou ainda infectar 
o indivíduo sendo causa de doença. 
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A)
D)
G)
B)
E)
H)
C)
F)
I)
Figura 4 – Passo a passo da lavagem de mãos: 1° passo – palmas (A); 2° passo – dorso (B); 3° passo – entre os dedos (C); 4° passo – 
polegares (D); 5° passo – articulação (E); 6° passo – ponta dos dedos, unhas (F); 7° passo – punhos (G); 8º passo – enxaguar as mãos 
iniciando pelos dedos e seguindo para os punhos (H); 9º passo – secar as mãos e os punhos com papel toalha descartável (I)
A lavagem das mãos, como demostrado no esquema anterior, é um processo que deve ser realizado 
pragmaticamente, a fim de garantir a segurança do profissional de laboratório. Para tal, alguns cuidados 
devem ser observados, como retirar todos os acessórios, como anéis, pulseiras e relógio, fechar a torneira 
com papel toalha, caso ela possua contato manual para fechamento e, para prevenir que a pele resseque, 
é necessário evitar lavar as mãos com água muito quente ou muito fria.
 Lembrete
Lavar as mãos já foi comprovadamente considerada uma das formas 
mais eficazes de evitar a propagação de doenças infecciosas.
A seguir, seguem algumas normas, as quais constituem importante fator para a segurança individual 
e coletiva de quem trabalha em laboratório de análises clínicas. Sendo recomendado que todos os 
profissionais a sigam no desempenho de suas atividades laborais, são elas:
I – É necessário trabalhar com método, atenção e calma.
II – O uso do avental no laboratório é obrigatório, de preferência confeccionado com algodão e de 
manga comprida.
16
Unidade I
III – Acidentes de qualquer natureza devem ser comunicados ao instrutor.
IV – Durante a permanência no laboratório, deve-se evitar passar os dedos na boca, nos olhos ou no 
nariz. Ao sair, deve-se lavar as mãos.
V – Se algum ácido ou qualquer outro produto químico for derramado, o local deve ser lavado 
imediatamente com bastante água.
VI – Antes de utilizar um reagente, deve-se ler com atenção o rótulo do frasco. O frasco de reagente 
sempre deve ser segurado com o rótulo voltado para a palma da mão.
VII – Antes de realizar uma experiência de laboratório, deve-se ler com atenção o procedimento 
operacional padrão (POP) do método a ser realizado. 
VIII – Quando necessário, devem ser utilizados equipamentos de proteção individual (EPIs).
IX – Quando for realizado trabalho com reagentes que liberem vapor, gases venenosos ou irritantes, 
a capela deve ser utilizada.
X – Não se deve fumar e comer no laboratório.
XI – Devem-se jogar todos os sólidos e pedaços de papel usado em coletores especificados.
XII – Deve-se manter limpo o local de trabalho.
Além dos cuidados abordados em muitos procedimentos em microbiologia clínica, faz-se necessária 
a utilização dos EPIs, sendo preciso observar em cada atividade a ser realizada a necessidade específica 
de cada item e de seu uso.
Esses equipamentos devem ser utilizados em situações que oferecem riscos, sobretudo aos olhos e 
sistema respiratório. Os EPIs são de uso obrigatório e exigidos quando a atividade a ser desenvolvida 
oferecer riscos. As empresas costumam disponibilizar EPIs, como sapatos, luvas, óculos, protetor auricular 
e avental, para que, dessa forma, os colaboradores exerçam suas atividades com a máxima tranquilidade 
e segurança. A seguir, são mostrados tipos de EPIs utilizados em laboratório de microbiologia clínica.• Máscara, óculos e visor: esses equipamentos são considerados individuais de proteção (EPIs), 
que devem ser utilizados em situações que oferecem riscos aos olhos e sistema respiratório. Os 
óculos de segurança são utilizados para a proteção dos olhos. Os óculos escuros são indicados 
para proteção contra radiação UVA e UVB.
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MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Figura 5 – Óculos de segurança comum e de sol
• Máscara para poeira: esse equipamento é muito utilizado contra poeiras e particulados ou em 
situações para proteção de respingos da fala. Não indicado contra poeiras toxicas, gases etc.
Figura 6 – Máscaras para poeira
• Máscara N95: esse equipamento é utilizado durante a manipulação de amostras de isolamento 
respiratório (PBK).
• Visor (protetor facial ou face shield): esse equipamento protege a face contra respingos 
provenientes de reações químicas, ou provenientes da fala. 
Figura 7 – Visor (protetor facial)
• Jaleco ou avental: o uso desse item é obrigatório dentro do laboratório, pois protege a parte 
superior do corpo contra possíveis derramamentos de soluções, reagentes etc. O jaleco deve 
permanecer no laboratório após sua utilização. Deve ser usado, preferencialmente, jaleco feito de 
algodão, impermeável.
18
Unidade I
• Luvas de segurança: esse equipamento protege as mãos durante o manuseio de soluções, deve-se 
ter cautela no uso quando próximo da chama do bico de Bunsen ou de qualquer outro material 
inflamável ou que produza chama. Os tipos mais comuns são: de PVC, látex e luva nitrílica. Alguns 
cuidados são necessários para que o uso das luvas de segurança se torne correto e adequado. 
 Saiba mais
Os ambientes de trabalho, em especial na área da saúde, oferecem 
riscos para seus trabalhadores, uma vez que frequentemente os expõem 
a condições que possam resultar em acidentes e processos patológicos 
quando medidas de proteção individual e coletiva não são adotadas. Para 
conhecer mais sobre o uso correto de EPI e o quanto o uso é priorizado por 
profissionais da saúde, leia:
LIMA, R. Agentes biológicos e equipamentos de proteção individual e 
coletiva: conhecimento e utilização entre profissionais. Revista Prevenção 
de Infecção e Saúde, v. 3, n. 3, 2017. Disponível em: https://bit.ly/3x04bAd. 
Acesso em: 29 jun. 2021.
1.2 Principais métodos de coloração, meios de cultura e técnicas de semeadura 
aplicados na prática da microbiologia 
Os microrganismos e as estruturas celulares geralmente são transparentes, no entanto com o 
emprego de um microscópio óptico e técnicas de coloração ou exame a fresco, é possível visualizar 
essas estruturas. Confecção de lâminas a fresco, em que o material é colocado entre lâminas e lamínulas 
com uma gota de solução fisiológica ou solução de KOH a 10%, é muito utilizada, visto que permite a 
visualização de estruturas celulares e microrganismos, principalmente para pesquisa de fungos. 
O emprego de corantes é muito comum e eficaz na microscopia em microbiologia. Corantes, 
como tinta da China, são utilizados principalmente em amostras de liquor cefalorraquidiano para a 
pesquisa de Cryptococcus neoformans. Azul de metileno pode ser utilizado em algumas pesquisas, como 
identificação de grânulos metacromáticos de Corynebacterium diphtheriae. 
O uso de corantes para a microscopia também pode ser utilizado em técnicas de colorações 
diferencias, as mais utilizadas são a técnica de coloração de Gram e a técnica de coloração de Ziehl 
Neelsen, que veremos detalhadamente a seguir.
A técnica de Gram, como pode ser observada na figura a seguir, permite uma visualização aprimorada 
das estruturas de bactérias, fungos, leucócitos e outros elementos. Permite obter informações essenciais 
para o início do tratamento. A visualização de amostras após a coloração de Gram proporciona adquirir 
informações úteis sobre os processos infecciosos, visto que as informações da cultura são demoradas. 
Essas informações, em conjunto com o conhecimento de quais microrganismos geralmente infectam 
19
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
certos sítios, possibilitam indicar a antiobioticoterapia inicial, até os resultados da cultura e teste de 
sensibilidade ficarem prontos. Em alguns casos, os microrganismos não apresentam nenhum crescimento 
nos meios geralmente utilizados na microbiologia, ficando a cargo da bacterioscopia o diagnóstico final.
I – Cobrir a lâmina pingando gotas de cristal de violeta e aguardar um minuto. Em seguida, desprezar 
o corante, lavar a lâmina com um filete de água.
II – Cobrir a lâmina com lugol, aguardar um minuto e desprezar o corante. Lavar a lâmina com um 
filete de água.
III – Aplicar álcool etílico ou cetona para descorar a lâmina por 30 segundos e, em seguida, lavar a 
lâmina em água corrente.
IV – Cobrir a lâmina com fucsina e deixar agir por 30 segundos, e, em seguida, lavar a lâmina em um 
filete de água.
V – Secar a lâmina com auxílio de um papel limpo ou deixá-la secar ao ar livre.
VI – Para visualização do microrganismo, deve ser aplicada uma gota de óleo de imersão sobre a 
lâmina e, em seguida, observá-la no microscópio com objetiva de 100 X.
Aplicação de 
cristal violeta 
(corante púrpura)
1 32 4Aplicação 
de iodo 
(mordente)
Lavagem 
com álcool 
(descoloração)
Aplicação 
de safranina 
(contracorante)
Gram-positiva
Gram-negativa
Cocos (gram-positivos)
Basotonete 
(gram-negativo)
Álcool
Safranina
Iodo
Cristal 
violeta
Legenda
B)A) LM 5 µm
Figura 8 – Representação esquemática da técnica de coloração de Gram. Procedimento técnico da coloração de Gram (A). Análise ao 
microscópio da técnica, resultando em bactérias coradas em azul (Gram-positivas) e em rosa (Gram-negativas) (B)
Fonte: Tortora, Funke e Case (2017, p. 65).
O resultado da técnica consiste em visualizar, esquematizar e descrever a morfologia, classificando as 
bactérias existentes nas lâminas de acordo com a reação diante dos corantes utilizados na técnica de Gram.
As bactérias Gram-positivas têm a parede celular composta por mureína e, após a descoloração 
com o álcool etílico, a bactéria mantém a coloração do corante primário (roxo). Já as bactérias 
Gram-negativas, com parede celular composta por ácidos graxos, são incapazes de reter o cristal de 
violeta, assumindo, assim, a cor do corante de fundo (vermelho). 
20
Unidade I
A) B)
Figura 9 – Exemplos de bactérias Gram: Gram-positivas Staphylococcus spp. (A) e de Gram-negativa Escherichia coli (B) 
O princípio da coloração de Ziehl-Neelsen se fundamenta no fato de que a parede celular, sobretudo 
de micobactérias, é formada por vários lipídeos e ácidos micólicos, e não apresenta peptidoglicano. 
Nesse caso, a conjugação de diversos desses lipídeos com a fucsina gera agrupamentos que são 
responsáveis pelo caráter tintorial de preservação à descoloração por soluções álcool-ácidas. Esse 
grupo de bactérias é denominado como bacilos álcool-ácido resistentes (Baar).
Diversas amostras podem ser coradas pela técnica de Ziehl-Neelsen. Entre elas, estão as biópsias de 
fragmentos, líquidos cavitários, urina, secreções purulentas e principalmente escarro. Os cuidados para o 
preparo do material a ser corado são extremamente importantes, considerando o grau de virulência dos 
agentes associados. A seguir, de forma resumida, os principais cuidados no preparo do material biológico 
a ser corado:
I – O preparo do esfregaço deve ocorrer de preferência na capela de segurança biológica e, 
obrigatoriamente, utilizando EPI (avental, máscara N95, luvas e óculos de proteção). Caso não tenha 
capela de segurança biológica, a lâmina deve ser preparada próxima ao bico de Bunsen. 
II – Identificar a lâmina com nome do paciente e números de identificação.
III – Utilizar sempre lâminas novas e limpas com álcool. 
IV – Abrir o recipiente minuciosamente, impedindo a produção de aerossóis.
V – Utilizando um palito de madeira, separar a fração mais purulenta do material. 
VI – Colocar a fração separada na lâmina de vidro. Com palito, estender o material até a extremidade 
opostada lâmina. Deslocar o palito de uma extremidade a outra até conseguir um esfregaço homogêneo, 
que ocupe 2/3 da lâmina. 
VII – Desprezar o palito em recipiente plástico firme, que deverá ser descontaminado na autoclave.
VIII – Posicionar a lâmina para cima e aguardar secagem em temperatura ambiente. 
IX – Após a secagem, passar a lâmina rapidamente por 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen.
X – Colocar a lâmina no suporte e aguardar que esfrie. 
21
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Tomados os devidos cuidados, o procedimento da coloração de Ziehl-Neelsen segue como 
descrito a seguir:
I – Cobrir todo o esfregaço da lâmina com corante fucsina de Ziehl filtrada.
II – Percorrer chama lentamente por baixo das lâminas até que comece a exalar vapores. Remover a 
chama rapidamente para impedir que a fucsina ferva. 
III – Cronometrar 5 minutos assim que começar a surgir o vapor e repetir o processo por mais 2 vezes 
nesse período de 5 minutos. 
IV – Enxaguar as lâminas cuidadosamente com água corrente retirando todo corante. 
V – Cobrir toda a lâmina com álcool-ácido e aguardar 1 minuto. 
VI – Enxaguar as lâminas com água corrente. 
VII – Observar se as lâminas ficaram descoradas (se estiver levemente rosada, refazer o item V).
VIII – Cobrir as lâminas com azul de metileno filtrado. 
IX – Esperar 30 segundos. 
X – Lavar a lâmina, retirando o azul de metileno. Esperar secar e estará pronta para leitura 
ao microscópio.
Na interpretação da lâmina de escarro, é necessário observar 100 campos úteis de microscópio, ou 
seja, campos em que sejam encontradas células provenientes do pulmão. Para baciloscopia de outras 
amostras clínicas, após concentração ou não, o esfregaço deve ser oval e é necessário ser observada toda 
a região com material. 
Seguindo alguns critérios, podemos quantificar o grau de positividade da lâmina analisada.
Quadro 2 – Critérios para leitura e interpretação 
dos resultados da baciloscopia de escarro
Resultado Observação 
Negativas Não foram encontrados Baar em cem campos observados
Quantificado 1 a 9 Baar em cem campos observados
Positivo + Presença de 10 a 99 Baar em 100 campos observados
Positivo ++ Média de 1 a 10 Baar por campo, nos primeiros 50 campos observados
Positivo +++ Média de mais de 10 Baar por campo, nos primeiros 20 campos observados
22
Unidade I
 Saiba mais
Apesar de ser uma doença antiga, com diagnóstico clínico-laboratorial 
simples e de tratamento barato (gratuito no nosso país) e eficaz, a 
tuberculose pulmonar ainda é um grave problema de saúde pública no 
Brasil e no mundo. Para saber mais sobre o diagnóstico, em especial a 
coloração de Ziehl-Neelsen, leia:
COSTA, R. R.; SILVA, M. R.; GONÇALVES, I. C. Diagnóstico laboratorial da 
tuberculose: revisão de literatura. Revista Médica de Minas Gerais, v. 28, n. 5, 
2018. Disponível em: https://bit.ly/3llpJnM. Acesso em: 2 ago. 2021.
Além das técnicas de coloração apresentadas na prática da microbiologia clínica, temos que estar 
constantemente atentos com os meios de cultura que serão utilizados para a execução de cada protocolo, 
pois disso depende a qualidade e assertividade do resultado a ser fornecido. Nesse sentido, devemos 
relembrar algumas informações acerca do tema.
Meio de cultura é o material nutritivo preparado para o desenvolvimento de microrganismos. 
Algumas bactérias podem crescer normalmente em qualquer tipo de meio, outras bactérias exigem 
meio de cultura específico. Existem também aquelas que não se desenvolvem em nenhum tipo de meio 
de cultura já desenvolvido.
O tipo de meio utilizado para os microrganismos se desenvolverem depende de vários fatores:
• origem do material a ser analisado;
• espécie que deseja obter na amostra;
• necessidades nutricionais dos organismos.
A especificidade dos meios de cultura é muito importante, nomeadamente no isolamento e 
identificação de certos microrganismos, como isolamento de microrganismos do solo ou na análise 
microbiológica de águas, alimentos, entre outros. Para o desenvolvimento de microrganismos em 
laboratório, há uma grande variedade de meios de cultura.
Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico: sólidos, quando há ágar na 
concentração de 1 a 2,0%; semissólidos, quando a quantidade de ágar e/ou gelatina é de até 0,5%; 
líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo.
A consistência do meio de cultura é influenciada pela presença do ágar, que consiste de um 
polissacarídeo complexo obtido a partir de algas marinhas, que vem sendo bastante utilizado na 
23
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
microbiologia. Os meios podem ser classificados quanto a sua composição (simples ou quimicamente 
definidos, básicos ou complexos), também podem ser classificados quanto a seu estado físico 
(líquidos, semissólidos e sólidos) e também em função de sua aplicação (seletivos, diferenciais, de 
pré-enriquecimento ou de enriquecimento). 
• Meios quimicamente definidos: sua composição química exata é conhecida. Esses meios são 
utilizados sobretudo em pesquisa, a fim de avaliar comportamentos nutricionais e processos 
metabólicos de microrganismos específicos.
• Meios de cultura básicos: permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer nenhuma exigência 
em especial.
• Meios de cultura complexos: são compostos de nutrientes, como extratos de levedura, carne, 
plantas ou produtos proteicos de outras fontes. Tais extratos fornecem as vitaminas e os outros 
fatores de crescimento orgânico, como os extratos de levedura, que são extremamente ricos em 
vitaminas B.
• Meios líquidos: os nutrientes estão dissolvidos em uma solução aquosa.
• Meios semissólidos: além de possuir nutrientes em sua composição, apresentam ágar em 
pequena quantidade.
• Meios sólidos: possuem em sua composição nutriente e ágar.
• Meios seletivos: elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento de outras bactérias. O 
ágar sulfeto de bismuto, por exemplo, é um dos meios de cultura utilizados para isolamento de 
bactéria causadora do tifo, a bactéria gram-negativa Salmonella typhi, a partir das fezes. Exemplo 
de meios eletivo: meio ágar Sabouraud é um meio que contém nutrientes que favorecem o 
crescimento de diversos fungos.
• O meio diferencial: utilizado para fácil identificação de bactéria de interesse específico, pois 
geralmente outras bactérias crescem na mesma placa de meio de cultura. Em alguns casos, as 
características dos meios seletivos e diferenciais podem estar combinadas no mesmo meio de cultivo. 
Pode-se obter um meio diferencial, por exemplo, incorporando-se, a um meio básico, 5% de sangue 
de carneiro. Dessa forma, torna-se um meio de cultura complexo e, ao mesmo tempo, diferencial, pois, 
dessa forma, pode-se observar três tipos de hemólise, uma observação fundamental, por exemplo, para 
a caracterização de bactérias tanto do gênero estreptococos como estafilococos. A título de informação 
adicional, os três tipos de hemólise conhecidas são:
• Alfa-hemólise: ocorre lise parcial das hemácias. É possível visualizar uma área de coloração 
esverdeada ao redor das colônias bacterianas. 
• Beta-hemólise: ocorre lise total das hemácias. Formará áreas claras em torno das colônias 
bacterianas. 
24
Unidade I
• Gama-hemólise: não ocorre lise das hemácias. 
• Meios de pré-enriquecimento: utilizado para recuperar os microrganismos danificados por 
algum tipo de tratamento (térmico ou químico), água peptonada e caldo lactosado.
• Meio de enriquecimento: utilizado para separar bactérias presentes em pequenas quantidades 
de outras, presentes em grandes quantidades. Geralmente, esse meio é utilizado em amostras de 
fezes e solos. Exemplo: caldo tetrationato e selenito-cistina para cultivo de salmonelas (líquidos), 
e caldo tioglicolato para Clostridium perfringens.
A diversidade dos meios de cultura é essencial para processo de identificação dos microrganismos. 
Compreender o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adaptar ao perfil bacteriano contribui 
muito no processode diagnóstico microbiológico. 
O quadro a seguir apresenta alguns dos principais meios de cultura utilizados no laboratório de 
microbiologia clínica e sua finalidade. 
Quadro 3 – Principais meios de cultura e sua finalidade na prática clínica
Meio de cultura Finalidade
Ágar chocolate Isolamento de Haemophilus spp.,Neisseria spp., Branhamella catarrhalis e Moraxella spp. em amostras clínicas
Ágar MacConkey É um meio seletivo (pela presença de sais biliares, cristal de violeta e NaCl) para isolamento de bacilos Gram-negativos, enterobactérias e não fermentadores
Ágar Mueller-Hünton Utilizado para realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelo método de difusão em disco (Kirby-Bauer) para bactérias de crescimento rápido
Ágar sangue
Meio utilizado para a maioria dos materiais clínicos, permite o crescimento de grande 
parte dos patógenos não fastidiosos ou que requerem incubação especial. Verificação de 
hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
Caldo tioglicolato Meio liquido enriquecedor
Agar cystine lactose electrolyte 
deficient (Cled)
Usado para isolamento, identificação de microrganismos presentes em amostra de urina. 
A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus spp.
Ágar Salmonella-Shigella (SS) Meio para isolamento de Salmonella sp. e Shigella sp. Permite diferenciar bactérias lactose positivas e negativas, além de detectar a produção de H2S
Ágar dnase Verificar se bactéria possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada DNA
Ágar citrato de simmons Verificar a capacidade do microrganismo em utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono. Auxilia na identificação das enterobactérias
Ágar chromoagar Identificar e isolamento da maioria das espécies de Candida spp.
Ágar Sabouraud (AS) Verificar o crescimento de espécies de Candida e fungos filamentosos
 Observação
Apesar de existirem muitos meios vendidos prontos comercialmente, 
a habilidade de preparar um meio de cultura e saber reconhecer qual o 
melhor meio para a obtenção do melhor isolamento bacteriano é função 
básica e primordial de todo profissional da área de análises clínicas.
25
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Vale salientar, nesse momento, os principais cuidados no preparo e armazenamento dos meios de 
cultura, ponto crítico para a qualidade do resultado da amostra biológica avaliada.
No preparo de um meio básico confeccionado in house, de forma caseira, como chamamos, e a título 
de exemplificação, inicialmente devemos ligar o pHmetro meia hora antes do uso e, após esse período, 
calibrá-lo com soluções padrões. Em seguida, deve-se definir a quantidade de meio a ser preparado e 
pesar a quantidade necessária de ágar e sacarose. 
Colocar 40% do volume de água destilada em recipiente apropriado ao volume final a ser preparado. 
Pipetar as soluções, dissolver a sacarose e completar com água a metade do volume final. Ajustar o pH, 
sendo o valor final em torno de 5.8. 
Em outro recipiente, deve-se colocar ágar e a outra metade da água e, em seguida, dissolver no 
micro-ondas em potência alta ou sobre a chama do bico de Bunsen, agitando de vez em quando. O meio 
estará pronto quando estiver transparente, começando a ferver. 
Deve-se misturar as partes e distribuí-las nos tubos de ensaio (ou placa petri), tampar os tubos com 
papel alumínio ou tampa plástica e levar para a autoclave por cerca de 20 minutos.
Após o preparo dos meios, eles devem ser colocados em recipientes (tubos de ensaio ou placa petri). 
Devem ficar sobre a bancada até atingir a temperatura ambiente e devem ser armazenados em geladeira 
por, no máximo, sete dias.
 Saiba mais
Meios de cultura são essenciais para qualquer procedimento em 
microbiologia clínica, sobretudo em bacteriologia e micologia, e saber 
reconhecer sua composição, especificidade e aplicações é tarefa importante 
a todo profissional de laboratório. Portanto, para saber mais sobre meios de 
cultura, faça a leitura do manual da Anvisa:
ANVISA. Descrição dos meios de cultura empregados nos exames 
microbiológicos. [s.l.], [s.d.]. Disponível em: https://bit.ly/2UKOkal. Acesso 
em: 29 jun. 2021.
Após compreendermos sobre os principais métodos de coloração e meios de cultura, é importante 
salientar a importância das diferentes técnicas de semeadura de material biológico, as quais 
servem para qualificar e quantificar o crescimento microbiano. A utilização dessas técnicas, além 
de importante para evitar a contaminação dos meios de cultura no momento de executá-las, 
estabelece um padrão necessário para a execução de cada protocolo. Para tanto, deve-se tomar 
inicialmente alguns cuidados: 
26
Unidade I
• Flambar a alça níquel cromo ou o fio de platina antes e depois de qualquer técnica de semeadura.
• Flambar a boca dos tubos de ensaio quando a técnica for realizada neles.
• Semeaduras realizadas em placa de Petri deverão ser próximas ao bico de Bunsen, para evitar 
contaminação com o ar. 
Para a semeadura adequada dos diferentes tipos de material biológico em razão dos diferentes 
protocolos a serem realizados, são utilizadas metodologias distintas, a saber:
• Técnica de esgotamento: a metodologia de semeadura por esgotamento pode ser aplicada 
para o crescimento de colônias isoladas, avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio 
de cultura, isolamento de organismos presentes em grandes números relativos à população 
microbiana. Para realizar a técnica de esgotamento, é necessário semear o microrganismo com a 
alça níquel suavemente sobre o meio de cultura, fazendo um zigue-zague, em sentido único, em 
toda a extensão da placa de Petri. Assim que finalizar a técnica, a placa deve ser guardada em 
temperatura adequada e permanecer por tempo suficiente até o desenvolvimento de colônias.
Figura 10 – Técnica de esgotamento na placa de Petri 
• Técnica em estrias: a metodologia de semeadura por estrias pode ser aplicada para estocar 
material, estudar o metabolismo dos organismos na bioquímica e avaliar a capacidade de 
crescimento ou não no meio de cultura. Para realizar a técnica de estrias, é necessário semear o 
microrganismo com a alça de níquel, fazendo estrias na superfície de um meio de cultura sólido.
Figura 11 – Técnica em estrias na placa de Petri 
27
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Técnica quantitativa: a metodologia de semeadura quantitativa é recomendada para a 
semeadura de líquidos, com o objetivo de obter o crescimento de colônias isoladas, a quantidade 
de colônias e avaliar a capacidade de crescimento ou não no meio de cultura. Para realizar a 
técnica quantitativa, é necessário coletar, com alça calibrada, um material clínico. Deve-se realizar, 
com a alça, o estriamento de uma ponta outra, em linha reta, por toda a superfície do ágar. Em 
seguida, deve-se fazer uma linha perpendicular à estria inicial.
Figura 12 – Técnica quantitativa na placa de Petri 
• Técnica em picada: a metodologia de semeadura em picada é recomendada para a semeadura 
em tubos de ensaio e tem como objetivo verificar a agilidade do microrganismo no ágar. Para 
realizar a técnica em picada, é necessário semear o microrganismo com auxílio de uma agulha de 
níquel cromo, fazendo uma picada no centro do meio de cultura, no tubo de ensaio, e penetrar 
agulha até a metade do tubo. Verificar os resultados após o período de incubação.
Figura 13 – Técnica de picada em tubo 
As diferentes formas de se semear o material clínico fazem parte de processos estabelecidos em 
procedimentos operacionais padrões, a fim de garantir a qualidade e reprodutibilidade dos testes e 
ensaios realizados.
Após o preparo do meio de cultura e semeadura do material biológico, parte-se para o processo de 
identificação do patógeno, o qual se inicia com a observação a olho nu, com lupa ou microscópio, das 
colônias isoladas. No estudo das colônias, deve ser observada a forma do microrganismo, bem como seu 
28
Unidade I
tamanho, superfície, estrutura e pigmentação. As principais características observadas no líquidosão o 
tipo de crescimento na superfície, a opacidade (ou turvação), cheiro, sedimento e pigmentação.
Após o crescimento das colônias isoladas no meio de cultura, podemos identificar suas características. 
Essas peculiaridades são de grande valia para selecionar as provas bioquímicas necessárias para 
completar o processo de identificação.
Puntiforme
Forma
Elevação
Margem
Plana
Inteira
Elevada
Ondulada
Convexa
Lobulada
Crateriforme
Filamentosa
Papilada
Espiral
Circular Filamentosa Irregular Rizoide Fusiforme
Figura 14 – Morfologia das colônias
Fonte: Câmara (2013).
1.3 Automação no laboratório de microbiologia clínica 
Em 1881, Robert Koch relatou sua primeira descoberta a respeito da bacteriologia, descrevendo 
“gelatinas” como fontes de nutrientes para bactérias. Após tantas décadas, as placas de Petri contendo 
meios de cultura, com nutrientes, continuam sendo a base para os laboratórios de microbiologia. A 
rotina nos exames de microbiologia clínica é baseada no cultivo e isolamento de colônias puras dos 
microrganismos, identificação fenotípica e testes de sensibilidade aos antimicrobianos utilizados para 
o tratamento, mas é notório que a microbiologia vem avançando de maneira importante, o que tem 
conduzindo a migração para a automação também para esse setor, a exemplo do que ocorre em outros 
setores do laboratório clínico. 
O fluxo de trabalho na microbiologia vem aumentado significativamente, desafiando os 
microbiologistas a escolherem a automação mais adequada, com baixo custo e alta especificidade. Outro 
fator relevante a ser considerado é o surgimento de novos mecanismos de resistência e a necessidade de 
investigações epidemiológicas decorrentes do aumento do número de microrganismos multirresistentes, 
o que é, sem dúvidas, um dos maiores desafios na rotina dos serviços da microbiologia.
O setor de microbiologia clínica é historicamente considerado low-tech, ou seja, baixo grau de 
automação ou tecnologia associada quando comparado ao elevado grau de automação encontrado no 
laboratório de forma geral, como no setor de bioquímica clínica.
29
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
De maneira geral, as automações disponíveis para o laboratório de microbiologia clínica permitem 
a identificação de diversos microrganismos em um período entre 16-24 horas de incubação. O teste 
de sensibilidade aos antimicrobianos (TSA) pode ser realizado concomitantemente à identificação e 
liberado no mesmo prazo. O TSA, quando automatizado, é liberado como sensível, intermediário ou 
resistente, seguido da concentração inibitória mínima (CIM ou MIC) de cada fármaco testado.
Os principais mecanismos de resistência bacteriana de interesse clínico, como a produção de 
beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) por bactérias Gram-negativas, ou a resistência à meticilina 
ou à vancomicina em bactérias Gram-positivas, são detectados e reportados por laudo microbiológico 
gerado nessas plataformas.
Desde o lançamento da automação AutoMicrobic System, projetado no final dos anos 1960 pela 
McDonnell Douglas a pedido da Nasa, uma infinidade de produtos tem surgido no mercado mundial. 
Os principais equipamentos atualmente disponíveis nesse campo são: o sistema automatizado Phoenix 
(lançado pela Becton Dickinson em 2003), o sistema MicroScan WalkAway (fabricado por Dade Behring 
INC., EUA), o sistema Vitek (introduzido pela bioMérieux em 1997) e o sistema Maldi-TOF-MS (Matrix 
Associated Laser Desorption-Ionization – Time of Flight – Mass Spectrometry), que se baseia na técnica 
de espectrometria de massa (MS) para identificar microrganismos.
Estudos comparativos entre essas metodologias têm sido descritos na literatura mundial. Em 
laboratórios de análises clínicas, quando há alta demanda de amostras que serão submetidas ao setor 
de microbiologia, essas tecnologias podem ser aplicadas principalmente para diagnóstico de infecções 
hospitalares ou como metodologia padrão em laboratórios de referência, uma vez que a necessidade da 
automação se faz indispensável para dar suporte à procura, apesar de o custo inicial ser alto. A automação 
se mostra consideravelmente vantajosa nesse setor das análises clínicas, proporcionando uma maior 
agilidade na obtenção dos resultados finais e melhor precisão na identificação de diversas espécies de 
microrganismos, os quais são aspectos importantes na rotina do laboratório clínico e microbiológico, 
minimizando o tempo para a realização de diagnósticos convencionais e otimizando, por exemplo, a 
terapia antimicrobiana. É importante salientar que os métodos automatizados contribuem muito para 
a otimização de um exame microbiológico, embora não seja possível, às vezes, mensurar seu impacto 
clínico por conta da dificuldade de realização desses estudos clínico-laboratoriais. De qualquer forma, 
vale ressaltar que, ao acelerarmos os resultados microbiológicos, como isolamento e identificação 
dos principais microrganismos epidemiologicamente relevantes, estamos proporcionando ao médico 
assistente as escolhas mais apropriadas de antibioticoterapia. Assim, os pacientes podem reagir mais 
rápido e ter alta em menos tempo, minimizando sua permanência no hospital e, assim, diminuindo a 
emergência de infecções hospitalares, especialmente por bactérias mais resistentes.
As automações, no entanto, também apresentam limitações, e muitas vezes é necessário recorrer 
a testes off-line para conseguir resultados confiáveis. A liberação da CIM da polimixina, por exemplo, 
tem sido alvo de diversos debates nos últimos anos. A padronização da liberação da polimixina B 
por microdiluição não automatizada in house limitou a realização do teste pelas plataformas 
atualmente disponíveis.
30
Unidade I
A identificação microbiológica de fungos e bactérias patogênicos tem sido realizada classicamente 
por métodos que envolvem cultura e, depois, testes fenotípicos, explorando as diferenças metabólicas 
que existem entre as várias espécies. Culturas são métodos extremamente poderosos de recuperação 
de patógenos: teoricamente, um único patógeno viável em meio adequado se multiplica em escala 
logarítmica, amplificando, assim, o sinal a partir de amostras com pouquíssimos agentes. Entretanto, 
culturas demoram. Dependendo do patógeno, culturas podem ser positivas tão precocemente como 
quatro a seis horas ou tão demoradas como semanas, e os testes fenotípicos podem demorar mais 
24 ou 48 horas. Em algumas circunstâncias, como bacteremias, a identificação e o tratamento adequado 
são aspectos críticos e mostram claramente que, a cada hora de demora no tratamento adequado de 
uma septicemia, a mortalidade aumenta de 10 a 20%. O tempo de hospitalização e o preço de uma 
internação igualmente diminuem com a identificação precoce da etiologia de uma sepse. Novos métodos 
diagnósticos, que não dependam do crescimento da bactéria ou fungo e que inclusive sejam efetivos 
quando os patógenos não estão viáveis, têm sido desenvolvidos. Os que utilizam ácidos nucleicos já 
estão em uso clínico, mas, apesar de serem mais rápidos que culturas, demandam tempo de técnico e 
pelo menos 6 a 8 horas de trabalho, com profissional dedicado. Um grande progresso é o uso de estudos 
proteômicos para diagnóstico rápido – tão rápido como 5 a 15 minutos – na etiologia de infecções. 
Maldi-TOF consiste num sistema no qual o material biológico (uma colônia ou um concentrado 
de hemocultura) é colocado em uma placa em que há a matriz polimérica. Isso é irradiado com um 
laser que vaporiza a amostra e há ionização de várias moléculas, que são aspiradas num tubo de vácuo 
e levadas a um detector: conforme a molécula, o tempo de chegada ao detector (time of flight) é 
diferente. Isso é colocado em gráfico, dando vários picos e, para cada espécie bacteriana ou fúngica, 
obtém-se um gráfico específico. Uma base de dados computadorizada interpreta e fornece o resultado 
– tudo com muita rapidez. Trata-se, portanto, de uma aplicação da espectrometria de massa. Essa 
técnica permite diagnósticos microbiológicoscomplexos, como a especiação correta dos estafilococos 
coagulase negativos ou a sorologicamente lenta e sujeita a erros definição dos vários sorovariantes da 
Salmonella entérica. 
O diagnóstico de fungos de importância médica e de micobactérias é possível. À medida que o uso 
dessa técnica aumenta, os bancos de dados ficam mais completos, e a identificação, melhor. Os bancos 
de dados são proprietários, o que é uma desvantagem quando comparados aos bancos de dados de 
ácidos nucleicos, como o blast, que são públicos e de uso livre, mas sujeitos de depósitos errados e 
alterações. Já os bancos de dados proteômicos, por ora, são mais cuidados.
O sistema WalkAway inclui software projetado para simplificar o fluxo de trabalho e minimizar a 
interação do tecnólogo enquanto hospeda diferentes ambientes regionais e institucionais por meio de 
recursos de personalização extensivos. O sistema, em resumo: 
• Processa painéis de identificação rápida e especialidade para redução de velocidade quando a 
velocidade é importante.
• Fornece uma precisão de padrão ouro para a identificação de microrganismos e testes de susceptibilidade.
31
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Permite o processamento simultâneo de painéis convencionais, rápidos e especiais em uma única 
plataforma automatizada. 
• Fornece uma detecção de resistência emergente precisa para os agentes patogênicos mais difíceis, 
incluindo ESBL, Visa, VRSA e MRSA.
O sistema AutoSCAN-4 faz parte do Sistema de Microbiologia MicroScan, simplificando a 
identificação e testes de susceptibilidade aos antibióticos (ID/AST) enquanto padronizam os resultados 
ao processar painéis em segundos. O sistema autoSCAN-4 inclui projetado para simplificar o fluxo 
de trabalho, ao mesmo tempo que possui diferentes ambientes regionais e institucionais por meio de 
recursos de personalização extensivos:
• A operação é fácil de aprender e usar, com treinamento mínimo.
• Automação econômica para baixos volumes.
• Processa painéis convencionais com concentrações inibitórias mínimas (MICs) diretas e não 
identificadas (ID) para ajudá-lo a entrar na resistência emergente.
• Processa os painéis de ID especiais para uma reviravolta reduzida quando a velocidade importa.
• Os diagnósticos remotos opcionais fornecem um nível adicional de capacidade de resposta 
do serviço.
 Observação
Apesar de os métodos automatizados estarem se difundindo de forma 
bastante importante em razão da demanda por resultados em menor prazo, 
o conhecimento do profissional continuará sendo essencial até mesmo 
para a programação da automação, bem como análise dos resultados 
por ela fornecidos.
1.4 Introdução à coleta de material biológico para prática em microbiologia clínica
Será abordado breve resumo sobre os principais aspectos inerentes à coleta de material biológico na 
prática da microbiologia clínica, salientando que, mais adiante, aos descrever os principais protocolos 
adotados no diagnóstico, iremos aprofundar a discussão sobre os critérios e qualidade da amostra para 
realização de cada procedimento de forma específica.
A coleta e o transporte das amostras representam um ponto crítico na microbiologia, pois a qualidade 
desses serviços pode, ou não, alterar nos resultados. Se a instituição não recebe a amostra de forma 
adequada, a informação repassada, em muitos casos, pode confundir ou desviar do verdadeiro resultado. 
32
Unidade I
Fatores que podem comprometer o exame microbiológico: hipótese diagnóstica mal elaborada, 
informações mal colhidas, incompletas ou não devidamente interpretadas etc.; requisição inadequada da 
análise laboratorial; coleta, conservação e transporte inadequados; falhas técnicas no processamento 
da análise; demora na liberação de resultado; má interpretação dos resultados. 
As informações básicas que devem constar da requisição médica são: 
• identificação clara do paciente: nome e sobrenome; 
• registro no hospital ou serviço; 
• data de nascimento (evitar confusão com homônimos e informações importantes relacionadas à 
faixa etária); 
• sexo (por exemplo, a interpretação de bacteriúria pode ser diferente para a mulher); clínica, leito 
ou ambulatório; 
• espaço para identificação do exame (número da análise microbiológica e seção do laboratório). 
São informações relevantes para o diagnóstico do processo infeccioso: 
• Dados gerais sobre o paciente.
• Hipótese diagnóstica.
• Dados clínicos (descrever objetivamente os achados clínicos mais significativos, lesões cutâneas 
ou de mucosas, local e características do sítio de infecção etc.).
• Dados epidemiológicos relevantes (viagem ou excursão, se vive em área endêmica de alguma 
doença infecciosa - malária, riquetsioses, cólera etc.), doença ocupacional (contato com animais, 
por exemplo), acidentes (mordida, trauma, picada de carrapato, enchentes etc.), envolvimento em 
surto de infecção hospitalar etc.
• Dados laboratoriais que evidenciem o sítio do processo infeccioso (RX, tomografia, urina rotina, 
hemograma etc.);
• Provável origem do processo infeccioso comunitário ou hospitalar. Se hospitalar: relacionado 
a procedimento invasivo (sonda vesical, cateter, traqueostomia, diálise, alimentação parenteral, 
cirurgia). 
• Existência de infecção em outra topografia? Qual? Uso de antibióticos nos últimos 10 dias (por 
que e quais?).
33
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
• Paciente com comprometimento imunológico ou com algum fator predisponente à infecção 
oportunista (prematuridade, transplante de órgãos, uso de droga imunossupressora, diabetes, 
câncer, aids, leucemia, anemia falciforme, talassemia, hemofilia, esplenectomia, cirrose etc.) 
Suspeita de doença oportunista. Qual? 
• Paciente transferido ou de alta nos últimos 30 dias de outro hospital? É colonizado ou infectado 
ou portador de bactérias multirresistentes? 
• Data do pedido médico, nome legível do médico, carimbo e/ou ramal de contato (facilita a 
comunicação para situações emergenciais como isolamento de M. tuberculosis, isolamento de 
nova cepa multirresistente etc.). 
• Data e hora da coleta e nome de quem colheu o material (permite reavaliação de procedimentos 
e reciclagem, por exemplo, quando se detecta excesso de contaminação em uroculturas etc.). 
• Comentários, quando necessários, sobre o procedimento de coleta. Por exemplo, acidentes ou 
dificuldades para obtenção do material, condições do paciente, quantidade etc. No caso de 
suspeita de infecção urinária, informar se o paciente é sintomático ou não.
O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível e correta 
o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia. Na amostra, devem estar identificados: 
• nome e registro do paciente; 
• leito ou ambulatório e especialidade; 
• material colhido; 
• data, hora e quem realizou a coleta; quem colhe o material deve ser devidamente treinado e 
periodicamente reciclado nessa atividade. 
Deve-se lembrar que o envolvimento do médico com o laboratório de microbiologia pode, com 
frequência, ser muito útil para ambos, propiciando melhor orientação técnica, mais objetividade, 
facilitando a interpretação de resultados etc. A importância do relacionamento médico e laboratório 
deve-se ao fato de que a microbiologia envolve etapas interpretativas para muitos exames, como aqueles 
que envolvem microbiota (mucosas) ou no caso de agentes específicos em que são fundamentais escolha 
de meios seletivos, uso de meios enriquecedores, uso de suplementos, ampliação do tempo de cultivo, 
variação na temperatura de incubação, adição de novos testes etc. 
A coleta de todo tipo de material biológico, visando a sua análise, deve ser realizada seguindo 
minimamente os critérios a seguir: 
• Evitar a contaminação com microrganismos ao redor da área/sítio de coleta. 
34
Unidade I
• Selecionar a área correta de onde se quer obter as amostras e utilizar a técnica apropriada.
• Coletar o volume necessário para análise, pois, caso a quantidade seja insuficiente,os resultados 
podem ser prejudicados.
• Identificar a amostra com a data de coleta, local, quem coletou e a quantidade coletada.
• Colocar a amostra em recipiente apropriado.
• Evitar derramar a amostra, com a finalidade de garantir um resultado seguro.
• Imediatamente após a coleta, as amostras devem ser colocadas ao abrigo de luz solar e 
acondicionadas, normalmente, em refrigeração.
A coleta de amostras biológicas inclui sangue, fezes, urina, secreções, entre outras. Para a coleta 
de sangue, é necessário realizar uma punção arterial, capilar ou venosa; em alguns casos, é necessário 
estar em jejum. Conforme o sítio anatômico e a amostra a ser coletada, será preciso utilizar uma 
técnica e material específicos para cada procedimento. O profissional deve estar ciente que diversos 
fatores podem afetar diretamente o resultado ou a eficácia do tratamento que será dado ao paciente 
e, portanto, é fundamental conhecer esses fatores, por exemplo, evitar a contaminação da amostra, 
coletando material diretamente do sítio real da infecção. 
Bactérias da microbiota normal humana podem ser coletadas equivocadamente, gerando um 
resultado errôneo com consequente indicação incorreta de tratamento, em alguns casos, podendo 
acarretar danos ao paciente.
Quando possível, o material deve ser coletado no momento ideal, visto que, em uma determinada 
fase do processo infeccioso, existe aumento populacional microbiano. O que pode aumentar as chances 
de detecção do microrganismo, mas, para que se encontre o momento ideal, é necessário entender o 
desenvolvimento da doença. 
O número de amostras contínuas pode maximizar o resultado. Por exemplo: amostras de escarro nas 
primeiras horas do dia, por três dias consecutivos, ampliam o número de casos positivos na pesquisa 
de tuberculose.
Deve-se colher de preferência as amostras antes do início da administração de antibióticos, uma 
vez que a antibioticoterapia diminuirá o número de microrganismos, provocando um resultado 
falso negativo.
Para particularidades no procedimento, como na coleta da urina, é necessário que haja assepsia 
do local antes da micção, e que seja desprezado o primeiro jato, para que não haja interferência nos 
resultados. Para a coleta de secreções, é necessário utilizar swab, agulha ou outro tipo de coletor. Esses 
pontos são essências para identificação correta dos microrganismos.
35
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A grande dificuldade na etapa de transporte é manter a condição natural da amostra. Com esse 
propósito, é necessário evitar que a amostra fique exposta ao frio e/ou ao calor excessivo. Deve seguir as 
especificações para cada tipo de amostra, por exemplo, frasco com escarro não precisa de refrigeração 
se for brevemente processado. Amostras de urina devem ser transportadas o quanto antes, uma vez que 
há degradação e fácil contaminação.
Amostras devem ser bem embaladas para evitar o vazamento. Deve ser utilizado o recipiente ideal 
para determinado tipo de amostra, de acordo com o exame que será realizado. Meios de transporte 
permitem manter a integridade da amostra por mais tempo, os mais utilizados são Stuart, Amies e 
Carey-Blair.
Transportar as amostras imediatamente ao laboratório para: 
• assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório de microbiologia 
trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos; 
• evitar o contato prolongado dos microrganismos com anestésicos utilizados durante a coleta, pois 
eles poderão exercer atividade bactericida;
• evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e lavado 
bronco alveolar. 
1.5 Resistência bacteriana aos antimicrobianos e microrganismos multirresistentes 
– condutas do laboratório de microbiologia clínica em infecções hospitalares 
O conhecimento do fenômeno de resistência bacteriana data do início da era microbiana. Com 
a introdução das primeiras substâncias químicas com finalidades terapêuticas, observou-se que 
determinadas populações bacterianas expostas a diferentes agentes sobreviviam a essa exposição. 
As espécies bacterianas podem apresentar duas formas de resistência, a natural ou intrínseca 
e a adquirida. A resistência adquirida é, sem dúvidas, a forma mais preocupante. Ela é descrita em 
praticamente todas as espécies de bactérias e já são conhecidos muitos dos mecanismos envolvidos 
nesses processos. Sabe-se, também, que a capacidade de as bactérias serem resistentes a diferentes 
antibacterianos não é uma propriedade nova ou particular de determinada espécie. Fatores como uso 
empírico de antibacterianos contribuem de forma considerável para o surgimento desses fenômenos 
de resistência. As bactérias têm a capacidade de se comunicar entre indivíduos da mesma espécie e 
ou de espécies diferentes e, por meio dessa interação procariota, ocorre a transferência de elementos 
genéticos móveis capazes de modificar tanto a sua estrutura celular como levá-la a produzir substâncias 
capazes de neutralizar a ação dos antibacterianos.
Vários são os mecanismos de resistência desenvolvidos, entre eles, destacam-se: a capacidade de 
reduzir purinas, impedindo a penetração do fármaco na célula bacteriana; a superexpressão de bomba 
de efluxo, promovendo a expulsão do fármaco da célula bacteriana; a modificação de estruturas 
36
Unidade I
responsáveis pela formação da parede celular, como as proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) e a 
produção de enzimas capazes de promover a hidrólise dos fármacos, como as betalactamases. 
Existem quatro técnicas recomendadas para a avaliação do perfil de sensibilidade bacteriano, 
são elas: 
• técnicas de microdiluição;
• técnicas de macrodiluição; 
• etest;
• difusão em ágar. 
As técnicas de macrodiluição, microdiluição e etest têm como princípio e objetivo determinar a 
concentração inibitória mínima (CIM) do fármaco capaz de destruir e/ou de impedir o crescimento 
bacteriano. A técnica de disco-difusão em ágar, também conhecida como técnica de disco-difusão 
de Kirby-Bauer, fornece um resultado qualitativo do potencial antibacteriano por meio da ausência, 
presença ou presença reduzida de um halo de inibição de crescimento. 
No método de Kirby-Bauer, com o auxílio de uma alça bacteriológica, toca-se a superfície de 
4 a 5 colônias bacterianas de aspecto similar, a fim de obtenção do inóculo. Após a realização desse 
processo, transfere-se esse inóculo para um tubo contendo 5 ml de solução salina estéril, ajustando a 
turvação para 0,5 da escala McFarland, que corresponde a uma quantidade de 108 UFC/ml. Submergir 
a essa suspensão um swab, também conhecido como ceconete, eliminar todo o excesso de líquido, 
pressionando-o contra a parede interna do tubo. Em seguida, realiza-se um semeio do tipo distensão 
na placa de ágar Muller-Hünton, de modo a cobrir todo o espaço da superfície do ágar com a 
suspensão bacteriana.
Passado esse procedimento, recolocar a tampa da placa e deixar em repouso por 5 minutos para 
a secagem do ágar, antes da colocação dos discos de antibióticos. A escolha do antibacteriano 
deverá obedecer às recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Os discos 
de antibióticos devem ser colocados de forma manual sobre a superfície do meio, com auxílio de 
pinça estéril, respeitando um distanciamento de 20 mm um do outro. Feito isso, os discos devem 
ser pressionados à superfície do meio com a ponta da pinça. Após essa etapa, as placas devem ser 
incubadas em estufa bacteriológica em temperatura de 35 °C por um período de 18 h. Passado o 
período de incubação, faz-se a medição do diâmetro da zona de inibição do crescimento bacteriano 
ao redor de cada disco de antibiótico, caso ela seja formada, como pode ser observada a seguir.
37
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Figura 15 – Teste de disco-difusão de Kirby Bauer, indicando pela seta como é realizada a medição do halo
Adaptada de: Rodrigues (2014). 
A seguir, uma relação de alguns antibacterianos recomendados para teste pela técnicade Kirby-Bauer 
para os organismos bacterianos mais frequentes no laboratório clínico de acordo com CLSI: 
• Enterobacteriaceae: penicilinas, penicilinas associadas a inibidores de betalactamases, cefalosporinas, 
carbapenêmicos, monobactâmicos, fluorquinolonas, aminoglicosídeos, glicopeptídeos, macrolídeos, 
tetraciclinas, inibidores de folato, fenicóis, fosfonicinas e nitrofuranos.
• Pseudomonas aeruginosa: penicilinas, penicilinas associadas a inibidores de betalactamase, 
cefalosporinas, carbapenêmicos, monobactâmicos, fluorquinolonas e aminoglicosídeos. 
• Acinetobacter sp.: penicilinas, penicilinas associadas a inibidores de betalactamase, cefalosporinas, 
aminoglicosídeos, fluorquinolonas, inibidores de folato e tetraciclinas. 
• Staphylococcus sp.: fluorquinolonas, aminoglicosídeos, macrolídeos, tetraciclinas, nitrofurantoína, 
lincosamidas, cloranfenicol, rifampicina, linezolida e teicoplanina, cefoxitina (30 µg).
Sabe-se que o principal mecanismo de resistência desenvolvido por bacilos Gram-negativos é a produção 
de betalactamases. São espécies de bacilos Gram-negativos: Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp. e 
Pseudomonas aeruginosa. Betalactamases de espectro estendido (ESBL), mecanismo presente, sobretudo, 
em espécies pertencentes à família das Enterobacteriaceae. Essas betalactamases são caracterizadas por 
promoverem a hidrólise de cefalosporinas de terceira geração, são sensíveis à cefoxitina, hidrolisam o 
Aztreonam e, por apresentarem um grupo serina como componente estrutural, possuem sensibilidade aos 
inibidores de betalactamases. Observa-se que a grande maioria das ESBLs hidrolisa também as cefalosporinas 
de quarta geração. Sua confirmação pode ser observada com uso da técnica do disco-aproximação.
Produção de AmpC 
A produção de betalactamases do tipo AmpC caracteriza-se por promover hidrólise das 
cefalosporinas de terceira geração e hidrolisar cefoxitina. Apesar de sua pesquisa no laboratório clínico 
38
Unidade I
não ser tão frequente, esse mecanismo inspira cuidados, principalmente quando está associado a outros 
mecanismos, sobretudo os de produção enzimática. Existem dois tipos de produção AmpC: a forma 
plasmidial, podendo ser encontrada em todas as espécies de bacilos Gram-negativos, e o cromossômico 
(induzível), frequente em espécies pertencentes ao grupo CESP (Citrobacter sp., Enterobacter sp., Serratia 
sp. e Providencia sp.). 
Carbapenemases 
As cepas produtoras de carbapenemases apresentam resistência a todos os betalactâmicos. De 
acordo com sua diversidade bioquímica estrutural, esse grupo subdivide-se em: carbapenemases que 
apresentam um grupamento serina em seu sítio ativo e carbapenemases que apresentam um íon zinco 
em seu sítio ativo. Dentro desse grupo, destacam-se as formas: IMP (imipenemases), VIM (verona 
metallo betalactamase), NDM (nova delhimetallo betalactamase), OXA (oxacilinase), SPM (São Paulo 
betalactamase) e a KPC (carbapenemase), sendo esta a única que apresenta um grupo de aminoácido 
serina em seu sítio ativo.
Grupo KPC 
Esse grupo de carbapenemases apresenta uma sensibilidade in vitro aos inibidores de betalactamases. 
Fenotipicamente, a determinação desse grupo é feita pelo teste de Hodge modificado (MHT), o qual é 
realizado a partir do semeio em placa de ágar Mueller-Hünton, por distensão, de uma suspensão (0.5 
McFarland) de Escherichia coli (ATCC25922), acompanhado de repique na forma de estria vertical de 
colônia suspeita para produção de KPC-2 e um controle positivo (Klebsiella pneumoniae, CCBH4955). 
Após as etapas de semeio, deve-se adicionar ao centro da placa um disco de ertapeném, é o disco 
mais sensível para confirmação de produção de carbapenemase, incubando em seguida a placa a uma 
temperatura de 35 °C por um período de 18 h. Define-se como prova MHT positiva a formação de um 
trevo nas bordas da estria do inóculo suspeito, como pode ser observado a seguir.
Figura 16 – Ao fundo, semeio de suspensão de cepa Escherichia coli ATCC25922, e estrias de Klebsiella pneumoniae, 
produtoras de KPC-2. O crescimento da cepa de E. coli em direção ao halo de inibição, formado pela presença 
do disco de ertapeném ou meropenem, indica que a cepa pesquisada produz carbapenemase
Fonte: UFRN (s.d.).
39
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
 Saiba mais
A resistência bacteriana é problema frequente e importante no ambiente 
hospitalar. Várias bactérias apresentam habilidade de desenvolver mecanismos 
de resistência enzimática, nesse contexto, destaca-se a K. pneumoniae, 
produtora de carbapenemase conhecida. Para saber mais sobre a importância 
dessa bactéria no ambiente hospitalar, leia:
DIENSTMANN, R. et al. Avaliação fenotípica da enzima Klebsiella 
pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente 
hospitalar. J. Bras. Patol. Med. Lab., v. 46, n. 1, fev. 2010. Disponível em: 
https://bit.ly/2Tk0eHR. Acesso em: 29 jun. 2021.
Grupo MBL 
Bactérias produtoras de metallo-beta-lactamases que apresentam em sua unidade estrutural um íon 
Zn+2. Apresentam um complexo perfil de resistência a todas as classes de betalactâmicos, apresentando 
uma sensibilidade in vitro ao aztreonam. Esse tipo de mecanismo de produção de carbapenemase, 
muitas vezes, está associado a outros diferentes mecanismos de resistência, como os de modificação 
estrutural (redução de porina) e superexpressão de bomba de efluxo. No laboratório clínico, utiliza-se 
a prova de inativação iônica (quelação) por meio da utilização de uma solução padronizada de ácido 
etileno-diaminotetracético (EDTA) para a confirmação fenotípica desse mecanismo.
Prova do EDTA
Prepara-se uma suspensão (0,5 McFarland) da bactéria suspeita, semeia em ágar Mueller-Hünton. 
Em seguida, acrescenta-se um disco de carbapenêmico (ertapeném) de um lado da placa, paralelo a esse 
disco, acrescenta-se outro disco de carbapenêmico (ertapeném) saturado com uma gota da solução de 
EDTA. Após esse processo, incubar a 35 °C por 18 h. Assim, a formação de halo e/ou aumento de 5 mm 
no halo formado pela ação do disco saturado com EDTA caracteriza-se como prova positiva.
As infecções hospitalares constituem, hoje, um grave problema de saúde pública no país, 
e muitos se perguntam se tais situações serão os sintomas mais evidentes da inadequação do 
sistema de saúde, sinônimo de erro médico, colocando a responsabilidade de sua ocorrência sobre 
o profissional de saúde ou na instituição prestadora de assistência. Evidentemente, o profissional de 
saúde ou o hospital não contamina voluntariamente seus pacientes, mas a inobservância de princípios 
básicos do controle das infecções hospitalares pode ter consequências drásticas. Assim, é importante 
ter profissionais conscientes, trabalhando em equipe, respeitando cada um dentro de suas funções, 
atualizando-se com frequência e com capacidade de se autoavaliarem.
O controle das infecções hospitalares, no Brasil, teve seu marco referencial com a Portaria MS n. 196, 
de 24 de junho de 1993, que instituiu a implantação de Comissões de Controle de Infecções Hospitalares 
em todos os hospitais do País, independentemente de sua natureza jurídica.
40
Unidade I
A Lei n. 9.431/97 instituiu a obrigatoriedade da existência da Comissão de Controle de Infecção 
Hospitalar (CCIH) e de um Programa de Controle de Infecções Hospitalares (PCIH), definido como 
um conjunto de ações desenvolvidas deliberada e sistematicamente, tendo como objetivo a redução 
máxima possível da incidência e gravidade das infecções nosocomiais. Em 1998, o Ministério da Saúde 
editou a Portaria 2.616/98, com diretrizes e normas para a execução dessas ações, adequando-as à 
nova legislação.
A Portaria 2.616/98 traz diretrizes e normas para o controle das infecções hospitalares. Em seu 
anexo II, traz conceitos e critérios para o diagnóstico das infecções, classificando-as em comunitárias 
ou hospitalares.
A infecção é classificada como comunitária quando é constatada em incubação no ato de admissão 
do paciente, desde que não relacionada com internação anteriorno mesmo hospital. A infecção é 
hospitalar em decorrência de qualquer infecção adquirida após a internação do paciente e que se 
manifesta durante a internação ou mesmo após a alta, quando puder ser relacionada com a internação 
ou procedimentos hospitalares.
Fernandes (2000), no livro Infecção hospitalar e suas interfaces na área da saúde, elaborou um 
fluxograma que facilita a distinção entre infecções hospitalares e comunitárias, como pode ser 
observado a seguir.
Perinatal
Comunitária
Comunitária
Hospitalar
Hospitalar
Hospitalar
Hospitalar
Hospitalar
Comunitária
SimInfecção 
neonatal
Transplacentária
(congênita)
Período > que 
hospitalização?
Período 
incubação está 
descrito?
Procedimento 
invasivo 
associado?
Internação 
> 72
> 24 horas?
Bolsa
Comunitária
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Não Não
Não
Não
Figura 17 – Fluxograma para diferenciação de infecções hospitalares e infecções comunitárias
Fonte: Fernandes (2000, p. 201).
41
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A prática da quimioprofilaxia para doenças infecciosas refere-se ao uso de uma droga por um paciente 
com risco aumentado para o desenvolvimento de infecção, tendo por objetivo reduzir a incidência de 
doença e morte.
A quimioprofilaxia contra algumas bactérias é de grande importância em saúde pública. Suas 
indicações devem sempre seguir as normas estabelecidas pelos serviços públicos de saúde. Entre as 
infecções que requerem tratamento quimioprofilatico de prevenção, destacam-se: Neisseria meningitidis, 
Haemophilus influenzae tipo b, Corynebacterium diphtheriae e Mycobacterium tuberculosis.
 Saiba mais
As infecções hospitalares, enquanto ocorrência vinculada tanto às 
condições intrínsecas do paciente/cliente quanto às ações/procedimentos 
realizados pela equipe multiprofissional atuante nas instituições, têm sido 
tema de discussões e reflexões por parte dos trabalhadores da área da 
saúde, bem como da comunidade em geral, e você pode saber mais sobre 
infecção hospitalar lendo:
AZAMBUJA, E. P.; PIRES, D. P.; VAZ, M. R. C. Prevenção e controle 
da infecção hospitalar: as interfaces com o processo de formação do 
trabalhador. Texto contexto - enferm., v. 13, número especial, 2004. 
Disponível em: https://bit.ly/3AmhOvM. Acesso em: 29 jun. 2021.
2 IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS, NEISSERIAS E 
BACTÉRIAS ANAERÓBIAS 
2.1 Identificação presuntiva dos estafilococos
Os estafilococos são bactérias inquestionavelmente mais resistentes no meio ambiente. Podem 
sobreviver por meses em amostras clínicas secas, são relativamente resistentes ao calor e podem tolerar 
uma concentração aumentada de sal. Indivíduos sadios são colonizados intermitentemente por 
Staphylococcus aureus desde a amamentação e podem albergar o microrganismo na nasofaringe, 
ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir desses sítios, o S. aureus pode contaminar a 
pele e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato direto ou 
por aerossol, ocasionando infecções letais por conta dos fatores de virulência ou através de resistência 
aos antimicrobianos atualmente utilizados.
A identificação de estreptococos e estafilococos é baseada na morfologia que apresentam em meios 
líquidos. Sendo o estreptococo uma cadeia normalmente longa e os estafilococos mostrando-se em 
forma de cocos aos pares, em cachos de uva. 
42
Unidade I
A identificação presuntiva começa com a inoculação primária na placa de ágar sangue de carneiro, 
que deve ser incubada em 5% de tensão de CO2 (método da vela ou estufa de CO2). As colônias de 
estafilococos são geralmente maiores, convexas, de coloração variando do branco a amarelo, podendo 
apresentar hemólise ou não. Nota-se que o desenvolvimento da cor amarelada no S. aureus ocorre 
somente após incubação prolongada (72 h), a temperatura ambiente. As colônias de estreptococos 
tendem a serem menores (puntiformes), e com halos de hemólise total ou parcial (beta e alfa-hemólise). 
A diferenciação entre os estreptococos e os estafilococos se dá, seguramente, pela prova da catalase.
O gênero Staphylococcus apresenta 32 espécies, 14 subespécies, sendo que somente 15 espécies 
são encontradas em amostras humanas, e de uma maneira prática, os estafilococos são divididos em 
duas categorias: coagulase positivos e coagulase negativos, de acordo com a resposta ao teste da 
plasmo coagulase.
Existem cerca de 31 espécies de Staphylococcus coagulase negativa conhecidas, e as mais 
frequentes são: 
• Staphylococcus epidermidis: causador de infecções de cateteres e próteses e o mais frequente 
microrganismo encontrado em hemoculturas. Também associado a bacteremias e endocardites.
• Staphylococcus saprophyticus: causador de infecção urinária em mulheres jovens. 
• Staphylococcus haemolyticus: importante devido à resistência aumentada aos antimicrobianos e 
por ser comumente confundido com o S. aureus, pois apresenta hemólise na placa de ágar sangue 
de carneiro.
A seguir, são apresentados os principais testes utilizados na identificação Staphylococcus spp.
Prova da catalase 
Com a alça bacteriológica, retira-se uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lâmina de vidro. 
Despejar sobre esse esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas. Para 
a família Micrococcaceae (estafilococos), a prova é geralmente positiva, enquanto que para a família 
Streptococcaceae (estreptococos) é negativa. Dessa forma pode-se utilizar dessa prova como um teste 
diferencial entre as duas famílias de bactérias. Uma observação importante na realização dessa técnica: 
deve-se tomar o cuidado de não carregar meio de cultura (ágar sangue), que pode acarretar resultados 
falso-positivos. 
Teste da resistência a novobiocina 
A bactéria é semeada seguindo os cuidados da técnica de disco-difusão de Kirby-Bauer, acrescida 
de um disco teste de novobiocina contendo 5 µg. As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 
6 a 12 mm, enquanto as susceptíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus 
saprophyticus são resistentes. 
43
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A forma mais simples de identificar o Staphylococcus aureus é a prova da coagulase, que pode ser 
efetuada em tubo ou em lâmina. 
Teste da coagulase em lâmina 
A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada clumping factor (fator 
aglutinante) na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando sua 
coagulação. Para se realizar o teste, é muito simples, deve-se, inicialmente, colocar duas gotas de 
salina em uma lâmina. Depois, homogeneizar com uma colônia isolada a ser testada, acrescentar 
uma gota de plasma e misturar. Deve-se observar se há aglutinação visível num prazo estabelecido 
de dez segundos.
Teste da DNAse 
Esse teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA (DNAse test agar) obtido 
comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%. Incubar a 
35 °C por 24 horas e, depois desse período, verificar se há a presença de uma coloração rósea ao redor 
das colônias produtoras de DNAse, indicando a positividade da prova.
Teste do crescimento em ágar manitol 
O Staphylococcus aureus tem a capacidade de fermentar o manitol em meio contendo 7,5 % de 
NaCl, denominado ágar manitol salgado ou meio de Chapman. O indicador de pH é o vermelho de 
fenol, que indica uma reação positiva quando o meio ao redor das colônias se torna amarelo, e negativa 
quando permanece avermelhado. 
Sensível 
Staphylococcus 
coagulase negativos 
Novobiocina
Resistente
Staphylococcus 
saprophyticcus
Coagulase
Negativa
Positivo 
Staphylococcus aureus 
Manitol
Coagulase 
DNAse
Positivo
Figura 18 – Fluxograma resumido de identificação 
das principais espécies de Staphylococcus spp. 
44
Unidade I
2.2 Identificação presuntiva dos estreptococos 
A hemólise em meio de ágar sangue é um fator muito importante para a classificação das 
bactérias nesse grupo.Sabe-se que bactérias podem produzir diferentes graus de hemólise, a 
julgar pela concentração de hemolisina que cada uma pode produzir. Bactérias que produzem 
altas concentrações de hemolisina, provocando uma hemólise total quando semeadas em meio de 
ágar sangue, são chamadas beta-hemolíticas. Bactérias que produzem concentrações moderadas 
de hemolisina, produzindo hemólise do tipo parcial, são denominadas alfa-hemolíticas. Já aquelas 
que não produzem hemólise, por não produzirem hemolisina para tal, são denominadas de 
gama-hemolíticas. 
Dessa forma, o diagnóstico presuntivo de infecção por estreptococos inicia-se obviamente pela 
microscopia, revelando a presença de bactérias arredondadas, gram-positivas, dispostas em cadeias 
curtas ou longas, catalase negativos e observando o padrão de hemólise evidenciado.
Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue 
após incubação a 35 °C em presença de 5% de CO2.
A identificação de espécie de estreptococos beta-hemolíticos é feita por meio de aglutinação com 
soros específicos contra os antígenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rápida, 
porém não acessível a todos os laboratórios em virtude do elevado custo. 
Teste da bacitracina 
Esse teste é semelhante ao teste da novobiocina em termos de metodologia utilizada, porém deve-se 
estar bastante atento, pois depende da utilização de meio de ágar sangue, cujos resultados podem 
gerar conflitos. 
Para sua realização, deve-se semear a placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, 
colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; incubar por 24 horas a 35 ºC sem CO2; e verificar 
a presença de qualquer halo ou zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus 
pyogenes (grupo A) é, assim, rapidamente identificado.
Teste do sulfametoxazol trimetoprim (SXT)
Adicionar na mesma placa de ágar sangue onde foi realizado o teste da bacitracina o disco de SXT, 
para tal, pode-se dividir a placa ao meio. Deve-se incubar por 24 horas a 35 °C sem CO2. A sensibilidade 
a essa droga significa, em conjunto com as outras leituras, que o estreptococo não pertence ao 
grupo A, B ou D de Lancefield. Em adição, como dito, pode ser feito na mesma placa o teste de 
Bacitracina 0,004 UI e o de Camp, conforme a seguir.
45
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
1 - Disco de bacitracina
2 - Disco de sulfamentoxazol trimetoprim
3 - Camp Test
Linha horizontal - 
estria com cepa beta hemolítica de 
Staphylococcus aureus (ATCC 25923)
Linhas verticais - 
cepas teste
1
2
3
Figura 19 – Testes de Bacitracina, STX e Camp em uma mesma placa
Fonte: Anvisa (s.d.).
Teste de camp 
Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta-lisina 
(ATCC25923) no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de 
carneiro. Na sequência, deve-se inocular as amostras a serem testadas em estrias, formando um ângulo 
reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando 
entre 1 e, no máximo, 2 mm de distância. Desse modo, várias amostras podem ser testadas em uma 
mesma placa de ágar sangue. As placas devem ser incubadas em temperatura entre 35-37 °C durante 
um período de 18-24 horas. A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada 
pelo alargamento da zona de análise, que adquire a forma de ponta de flecha característica na área de 
intersecção entre as duas estrias.
Teste da bile esculina 
A prova da bile esculina avalia a capacidade de determinadas bactérias de hidrolisarem a esculina 
em esculetina em um meio contendo sais minerais e ferro. A esculetina hidrolisada reage com os íons 
ferro, gerando a formação de um induto preto no interior do tubo. Para realizar a prova, deve-se semear 
a bactéria em tubo contendo meio de bile esculina, incubar em temperatura entre 35-37 °C durante 
um período de 18-24 horas; se houver formação de induto preto, o teste é postivo, mantendo-se 
a cor marrom do meio o teste é negativo. O caldo de NaCl a 6,5% deve mostrar turvação para ser 
considerado positivo.
Teste do NaCl 6,5% 
No teste do NaCl 6,5%, utiliza-se de um meio líquido, também chamado de caldo, onde adiciona-se 
uma solução de NaCl a 6,5%. É sabido que muitas bactérias não resistem a tamanha concentração de 
sal. Nesse caso, as bactérias que conseguem sobreviver multiplicam-se no meio graças aos nutrientes 
presentes, turvando-o. As bactérias que não resistem morrem e acabam por se depositar no fundo do 
tubo, mantendo o meio translúcido.
46
Unidade I
Teste do PYR 
Esse teste determina a atividade do PYR, também chamado pyrrolidonyl-aminopeptidase, uma 
enzima produzida pelo Streptococcus pyogenes e também pelo Enterococcus sp. 
Para se realizar o teste de maneira eficaz, deve-se obrigatoriamente utilizar somente colônias puras. 
Seguir as instruções do fabricante, uma vez que se encontra disponível comercialmente. Esse teste é 
tecnicamente equivalente à prova da hidrólise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados 
na identificação clássica dos enterococos, e mais específico que o teste da bacitracina na caracterização 
presuntiva dos estreptococos beta-hemolíticos do grupo A, tendo a vantagem de ser mais rápido. 
Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes 
duvidosos. Na impossibilidade da realização de testes sorológicos de confirmação, reforçar o valor dos 
testes presuntivos clássicos de identificação do Streptococcus pyogenes.
Teste da optoquina 
Teste semelhante aos demais que utilizam como princípio a técnica de disco difusão, para tal, deve-se 
semear um quarto de uma placa de ágar sangue (isso como opção, caso queira utilizar a mesma placa 
para demais testes) com a cepa alfa-hemolítica a ser testada. Em sequência, deve-se aplicar um disco 
de optoquina, incubar a 35 °C em tensão aumentada de CO2, sugere-se uso do sistema de anaerobiose, 
com gerador apropriado. Após período de incubação, notar se há presença de uma zona de inibição de 
14 mm ou mais indicando sensibilidade ao teste e identificando de forma assertiva uma infecção por 
Streptococcus pneumoniae. 
A seguir, os quadros com a identificação presuntiva de bactérias do gênero estreptococos alfa, beta 
e gama-hemolíticas e, na sequência, as figuras apresentando os fluxogramas para identificação de 
bactérias do gênero estreptococos.
Quadro 4 – Identificação de bactérias alfa hemolíticas 
Identificação Optoquina Bile esculina Tolerância NaCl 6,5%
Pneumococo Sensível Negativo Negativo
Enterococos Resistente Positivo Positivo
Grupo viridans Resistente Negativo Negativo
Streptococcus bovis Resistente Positivo Negativo
Quadro 5 – Identificação de bactérias beta hemolíticas 
Identificação Bacitracina Camp Teste Sensibilidade SXT Bile-esculina e tolerância NaCl 6,5%
S. pyogenes Sensível Negativo Resistente Negativo
S.agalactiae Resistente Positivo Resistente Positivo
Enterococcus sp. Resistente Negativo Resistente Negativo
Estreptococcus não A, B ou D Resistente Negativo Sensível Negativo
47
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Quadro 6 – Identificação de bactérias gama hemolíticas 
Identificação Camp Teste Bile-Esculina Tolerância NaCl 6,5%
S. agalactiae Positivo Negativo Negativo
Enterococcus sp. Negativo Positivo Positivo
Streptococcus bovis Negativo Positivo Negativo
Catalase negativo
Optoquina
Bile-esculina
Tolerância a NaCl 6,5%
Sensível
Steptococcus pneumoniae
Bile-esculina positivo 
Enterococos
Streptococcus bovis
Tolerância NaCl 6,5% 
positiva
Enterococos
Alfa-hemólise 
Resistente 
Enterococos
Grupo Viridans
Streptococcus bovis 
Bile-esculina negativo
Grupo viridans 
Tolerância NaCl 6,5% negativa
Sterptococcus bovis
Figura 20 – Fluxograma de identificação de bactéria alfa hemolítica 
Catalase negativo
Bacitracina
Teste Camp
Sensível
Estreptococos não A, B ou D 
Resistente 
S. agalactiae
Enterococos
Estreptococos nãoA, B ou D
Sensível
Streptococcus pyogenes
Teste Camp positivo
Streptococcus agalactiaes
Resistente
Enterococos sp.
Beta-hemólise
Teste Camp negativo 
Enterococos
Estreptococos não A, B ou D 
Sensibilidade a SXT
Figura 21 – Fluxograma de identificação de bactéria beta hemolíticas 
48
Unidade I
Catalase negativo
Teste Camp
Bile-esculina negativo 
Streptococcus agalactiae
Teste Camp negativo
Enterococos
Streptococcus bovis 
Teste Camp positivo
 Streptococcus agalactiae
Bile-esculina positivo
Enterococos
Streptococcus bovis
Gama-hemólise
Tolerância a NaCl 6,5%
Tolerância a NaCl 
6,5 % positiva 
Enterococos
Tolerância NaCl 6,5 % negativa
Streptococcus bovis
Figura 22 – Fluxograma de identificação de bactéria gama hemolítica 
2.3 Identificação presuntiva de Neisserias 
As várias espécies de Neisseria apresentam-se morfologicamente como diplococos Gram-negativos 
lateralmente achatadas, de aspecto riniforme (lembram rins) ou dois grãos de feijão unidos por uma 
ponte. Apenas a espécie N. elongata difere dessa morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. 
Todas Neisserias são oxidase positivas e catalase positivas, exceto Neisseria elongata e Kingella 
denitrificans. Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e não fermentativa, sendo baixa a acidez, de 
modo que podem acontecer reações duvidosas com o meio CTA (cistyne tripticase agar) com indicador 
vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina. No que tange aos aspectos clínicos, a 
maioria das Neisserias é comensal, vivendo em mucosas de humanos e animais.
As N. gonorrhoeae crescem em ágar chocolate formando colônias pequenas. As colônias de 
N. meningitidis A e C capsuladas apresentam-se com consistência mucoide. Testes imunológicos não 
substituem a cultura e a bacterioscopia e, para o diagnóstico da gonorreia, existem kits de Elisa comerciais, 
sondas genéticas de ácido nucléico, PCR e suas variantes, que se mostram altamente eficientes apesar 
de seu elevado custo.
No exame de um líquido céfalo raquidiano (LCR) com suspeita de infecção por Neisseria meningitidis, 
pode ser feita a técnica de aglutinação com partículas de látex, que é rápida, com boa sensibilidade, 
especificidade e permite a tipagem dos principais tipos prevalentes em meningites. O teste pode ser 
positivo nos casos de cultura negativa, por uso prévio de antimicrobianos, sendo, no entanto, de custo 
elevado. Para o tipo B, alguns produtos oferecem testes para afastar reação cruzada com E. coli. A reação 
negativa não exclui o diagnóstico que deve ser sempre avaliado juntamente com a bacterioscopia 
e a cultura.
49
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Na ocorrência de surtos de meningite meningocócica, o diagnóstico presuntivo para fins de tratamento 
também pode basear-se na clínica e na bacterioscopia do LCR ou de lesões (petéquias e púrpuras). 
As culturas devem sempre ser colhidas para confirmação, identificação de sorotipo e sensibilidade aos 
antimicrobianos, deve-se sempre fazer a bacterioscopia das colônias isoladas para confirmar a presença 
de diplococos Gram-negativos com forma de dois feijões, o teste da oxidase das colônias sugestivas, e 
deve-se procurar afastar outros gêneros de bactérias como Acinetobacter spp., Kingella spp. e Moraxella 
spp., que são morfologicamente parecidos. 
Para se evitarem resultados falso-positivos com identificação de Acinetobacter spp. e Kingella spp. 
como Neisserias, deve-se semear o agente suspeito em ágar chocolate, adicionar um disco de 
penicilina de 10 UI, fazer leitura após 24 h e proceder uma coloração de Gram das colônias que 
crescerem próximas à zona de inibição. Notar se as bactérias continuam a apresentar morfologia 
cocoides, se sim, confirma-se o isolamento; do contrário, caso tenham adquirido a forma de bacilos 
longos, o isolado não é de Neisseria. 
Como recurso adicional importante, recomenda-se enviar a cepa isolada rapidamente ao laboratório 
de referência para confirmação.
Teste de oxidase
O teste da oxidase é um teste-chave para diferenciar entre as famílias de Pseudomonadaceae (oxidase 
positiva) e Enterobacteriaceae (oxidase negativa). A enzima citocromo oxidase está envolvida com a 
redução do oxigênio no final da cadeia de transporte de elétrons. É útil no diagnóstico de infecções 
por Neisseria, como dito anteriormente, e é classicamente utilizada para executar a triagem dos BGN 
(bacilos Gram-negativos) não fermentadores da glicose uma vez que algumas bactérias utilizam este 
açúcar pela via oxidativa. Convém rotineiramente se aplicar a pesquisa da oxidase principalmente aos 
BGN lactose negativos.
Utilizar tiras com reativo para oxidase, adquiridas comercialmente. Pingar uma gota de solução salina 
0,85% estéril na tira de oxidase. Com o auxílio de uma alça bacteriológica, transferir assepticamente uma 
ou duas colônias da bactéria em análise e distribuir uniformemente sobre a superfície da área reagente 
da tira, notar se em 2 minutos ocorre o desenvolvimento de uma coloração violeta caracterizando um 
teste de oxidase positiva.
Oxidase
neg.
Oxidase
pos.
Figura 23 – Teste de oxidase negativo e positivo (coloração violeta)
50
Unidade I
2.4 Identificação presuntiva de bactérias anaeróbias 
Bactérias anaeróbias estritas configuram-se como um grupo de bactérias capazes de causar 
doença aos seres humanos e animais e que não possuíam capacidade de multiplicar-se em presença 
do oxigênio atmosférico.
Existem várias razões já descritas que buscam explicar a susceptibilidade dessas bactérias ao oxigênio, 
entre elas: 
• Oxigênio seria um tóxico direto para a bactéria anaeróbia.
• As bactérias anaeróbias estritas não têm a enzima catalase que impede a formação de grandes 
quantidades de peróxidos.
• Oxigênio altera enzimas bacterianas importantes para o metabolismo bacteriano.
• As bactérias anaeróbias estritas não possuem a enzima superóxido dismutase, capaz de transformar 
o radical, o que é altamente tóxico para a bactéria.
A susceptibilidade das bactérias anaeróbias estritas ao oxigênio mais do que justifica a 
dificuldade existente nos laboratórios para seu isolamento, cultivo e estudo. Por esse motivo 
também, boa parte das infecções provocadas por esses microrganismos não eram diagnosticadas 
até a década de 1970, quando foram desenvolvidos procedimentos práticos de laboratórios 
para criar atmosferas de anaerobiose. 
Um fato que também merece destaque, a fim de explicar a frequência com que essas bactérias 
provocam infecção, é que os anaeróbios estritos são habitantes normais do organismo humano, ou seja, 
são bactérias consideradas da microbiota residente, ultrapassando em número os aeróbios e anaeróbios 
facultativos. Dessa forma, os anaeróbios estritos estão em proporções de cinco a mil vezes maiores que 
os anaeróbios facultativos na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato respiratório superior e 
genital feminino.
A existência de fatores predisponentes promove e, podemos, por que não, dizer que facilitam os 
processos patológicos em diferentes órgãos e sistemas. Por esse motivo, a maior parte das infecções 
provocadas por anaeróbias estritas são denominadas de infecções endógenas, por se tratar de um 
microrganismo da microbiota do próprio paciente.
As infecções provocadas pelo gênero Clostridium são fundamentalmente adquiridas a partir do 
meio ambiente externo e, por esse motivo, são chamadas de infecções exógenas. Nas mucosas, onde 
os anaeróbios estritos formam parte da flora normal, existem condições locais de anaerobiose. Essas 
condições são provocadas por compostos orgânicos, enzimas, restos celulares e bactérias anaeróbias 
facultativas que baixam o potencial redox nesses locais. Nesse sentido, devemos assinalar que essas 
bactérias toleram pequenas quantidades de oxigênio. As mais estritas crescem em atmosferas com 
51
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
0,5% de oxigênio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas podem crescer ainda em 
concentrações de até 8% de oxigênio.
A existência,como sugerido, de bactérias anaeróbias facultativas e de aeróbias, no mesmo 
sitio de infecção de bactérias anaeróbias estritas, facilita o processo de infecção pelas anaeróbias, 
justamente em razão do consumo de oxigênio que as demais espécies oxigênio-dependentes fazem 
e, sem dúvidas, por também produzirem alguns fatores de crescimento como substâncias secundárias 
do seu metabolismo, razões pelas quais a maior parte das infecções é por bactérias anaeróbias 
estritas mistas. Assim, são frequentes as infecções conjuntas com Enterobactérias, Pseudomonas e 
Staphylococcus aureus.
Alguns aspectos clínicos fazem suspeitar uma infecção com envolvimento de bactérias anaeróbias, 
sendo os principais:
• secreção fétida;
• infecção nas proximidades de superfície mucosa;
• tecido necrótico;
• presença de gás em tecidos ou secreções;
• tromboflebite séptica;
• coloração preta em secreção com sangue;
• infecção decorrente de mordida humana ou de animal;
• presença de grânulos de enxofre nas secreções;
• terapêutica prévia com aminoglicosídeos;
• gangrena gasosa.
A coleta de material biológico visando a uma investigação de bactérias anaeróbias também deve ser 
cercada de inúmeros cuidados. Deve-se colher de forma que não entrem em contato com oxigênio e não 
se contaminem com bactérias anaeróbias da microbiota normal. 
A maioria das amostras é colhida por punção aspirativa (agulha e seringa), na qual é eliminado o 
ar imediatamente após a obtenção da amostra. Não devem ser semeados escarro, secreção faríngea 
ou nasal, secreções vaginais, fezes ou material de colostomia, pois esses materiais sempre têm 
bactérias anaeróbias. 
52
Unidade I
As bactérias anaeróbias estritas são, portanto, pesquisadas em líquidos aspirados de cavidades 
fechadas, material obtido por aspiração profunda de feridas, punção de traqueia ou pulmonar e sangue 
para hemocultura.
O transporte da amostra colhida deve ser realizado com a mesma seringa com que foi colhido o 
material. O material colhido deve sempre ser examinado partindo-se da de Gram. Quando o material 
vem numa seringa, a semeadura é feita em tioglicolato e em placa. Quando o material já vem no meio 
de tioglicolato, é feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os meios.
Como mencionado, é fundamental uma atmosfera de anaerobiose para o isolamento e cultivo desses 
microrganismos, para tal, pode-se utilizar de vários recursos, entre os quais destacam-se dois de forma 
mais específica: 
• Câmaras anaeróbias (glove box), nas quais o manipulador introduz somente as mãos, sendo o 
ar eliminado, colocando-se uma mistura de gases (H2, CO2, N2); nessas câmaras, existem todos os 
elementos necessários para o trabalho bacteriológico, incluindo estufas de incubação.
• Jarras de anaerobiose com geradores químicos que permitem obter uma atmosfera adequada 
para a multiplicação dessas bactérias. Existem diversos tipos de geradores. Os mais utilizados são 
os que provocam um consumo do oxigênio com substâncias redutoras como ferro reduzido ou 
ácido ascórbico.
Placas
Gerador
Figura 24 – Jarra de anaerobiose com gerador químico
Ambos os sistemas citados são igualmente eficientes, porem o sistema de jarra é o mais prático e de 
melhor custo-benefício.
A seguir, veja o quadro com os principais gêneros e espécies de bactérias anaeróbias estritas de 
importância a seres humanos em função de sua morfologia e classificação morfotintorial frente à 
técnica de coloração de Gram.
53
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Quadro 7 – Principais grupos bacterianos classificados 
segundo método de coloração de Gram
Classificação morfotintorial de Gram Agrupamento Bacteriano
Cocos Gram-positivos Peptostreptococcus sp.
Cocos Gram-negativos Veillonella sp.; Acidaminococcus sp.; Megasphaera sp.
Bacilos Gram-positivos - não esporulados Propionibacterium sp.; Bifidobacterium sp.; Actinomyces sp.; Eubacterium sp.; Lactobacillus sp.
Bacilos Gram-positivos – esporulados Clostridium sp.
Bacilos Gram-negativos Bacteroides sp.; Fusobacterium sp.; Prevotella sp.; Porphyromonas sp.
A identificação correta do agente bacteriano associado ao processo infeccioso sob investigação 
depende de forma bastante importante da execução rígida do protocolo a ser seguido. A escolha dos 
meios de cultura, as condições de cultivo, a forma correta de colher e transportar o material, como já 
informado, são aspectos fundamentais para um bom resultado. Não obstante ao protocolo de isolamento 
e cultivo, o diagnóstico de gênero e espécie é feito utilizando de diferentes metodologias, como: 
• provas bioquímicas: utilização de açúcares, produção de indol, redução de nitratos, urease;
• crescimento em presença de bile, liquefação da gelatina, hidrólise de esculina;
• produção de pigmentos;
• hemólise;
• susceptibilidade a antimicrobianos.
Nesse sentido, o fluxograma a seguir apresenta uma possibilidade de protocolo de execução de 
cultura a partir de material líquido ou purulento, baseado em recomendações da Agência Nacional 
de Vigilância Sanitária e do CLSI para a cultura e processamento de amostras suspeitas contendo 
bactérias anaeróbias, bem como uma tabela com os resultados esperados em alguns testes de 
referência e o agente etiológico respectivamente associado. 
Amostra material 
líquido ou purulento
Inoculação em caldo tioglicolato 
(THIO) em anaerobiose 48 h a 
7 dias 35 °C
Ágar sangue 
anaeróbio (Asana)Ágar sangue 
Gram
Ágar bacteroides bile 
esculina (BBE) Ágar chocolate 
Semeadura em placas 
Ágar MacConckey
Incubar em aerobiose 
a 35 °C 24 a 48 h
Incubar anaerobiose 
35 °C 24 a 48 h
Incubar em CO2 a 
35°C 24 a 48 h
Figura 25 – Fluxograma de identificação de bactérias anaeróbias 
54
Unidade I
A título de exemplificação, segue tabela de identificação de algumas bactérias anaeróbias com os 
resultados de cada teste. 
Quadro 8 – Identificação de bactérias anaeróbias 
Bactéria Rifampicina (15 mcg) Kanamicina (1000 mcg) Indol Pigmento
Grupos Bacteroides fragilis Sensível Resistente Positivo/negativo Negativo
Prevotella sp. Sensível Resistente Positivo/negativo Positivo
Porphyromonas sp. Sensível Resistente Positivo Positivo
Bacteroides sp. Sensível Sensível-resistente Negativo -
F. mortiferum Resistente Sensível Negativo Negativo
F. varium Resistente Sensível Positivo Negativo
Fusobacterium spp. Sensível Sensível Positivo Negativo
Nota-se que para Rifampicina e Kanamicina, o resultado é resistente quando os halos medidos forem 
menores que 12 mm, importante observar que o inóculo para o teste deve ser equivalente à escala 3 de 
McFarland, diferente do utilizado em outras situações, em que o inóculo normalmente corresponde à 
escala 0,5 de McFarland. 
Para a produção de pigmento, recomendamos a observação direta das colônias, e, caso não exista pigmento 
evidente, iluminar a placa com luz ultravioleta (± 360 mm de comprimento de onda). Colônias de Prevotella 
melaninogenica aparecem com cor tijolo avermelhado, e de Porphyromonas gingivalis, com coloração escurecida.
Para a prova de indol, retira-se uma colônia do meio com triptofano com ajuda de uma alça de 
platina num papel filtro impregnado em 1% de paradimetilaminocinamaldeido (em ácido clorídrico 
10%). Uma reação positiva produz imediatamente uma cor azul.
 Saiba mais
A carga de bactérias anaeróbias que colonizam o organismo humano 
é vasta, correspondendo a cerca de 90% da biomassa humana. A relação 
biótica entre o ser humano e a sua microbiota configura benefícios 
recíprocos, embora com potencial patogênico para o ser humano em 
situações de disbiose. Infecções com ponto de partida ou em contiguidade 
com a pele ou mucosas do trato intestinal, geniturinário ou respiratório alto 
são frequentemente polimicrobianas, devido às bactérias anaeróbias serem 
invariavelmente contempladas no diagnóstico diferencial etiológico dessas 
situações. Para saber mais sobre bactérias anaeróbias e sua importância, leia:
ALVES, J. et al. Bactérias anaeróbias com relevância clínica: classificaçãotaxonômica e morfológica, presença na microbiota humana e diagnóstico 
microbiológico. Acta. Med. Port., v. 30, n. 5, p. 409-417, maio 2017. Disponível 
em: https://bit.ly/3hz2Zxp. Acesso em: 29 jun. 2021.
55
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
3 IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS; BACILOS GRAM-NEGATIVOS NÃO 
FERMENTADORES E BACILOS CURVOS (ESPIRALADOS)
3.1 Identificação presuntiva de enterobactérias 
A família das Enterobacteriaceae compreende um largo número de espécies bacterianas de 
importância médica. Essas espécies respondem por mais de 70% dos isolados bacterianos na rotina do 
laboratório clínico, sendo responsáveis por diferentes agravos infectocontagiosos, como gastroenterites, 
bacteremias, infecções urinárias, infecções de feridas, meningites etc. Estão intimamente associadas 
a diferentes mecanismos de resistência bacteriana, sobretudo, no ambiente hospitalar. Em termos 
morfológicos, todas as espécies apresentam um aspecto bacilar e/ou cocobacilar, adquirem coloração 
rosa/vermelha após coloração de Gram, apresentando uma bioquímica de fermentação, são oxidase 
negativa, anaeróbias facultativas, reduzem nitrato a nitrito, não apresentando a capacidade de 
formar esporos.
A primeira etapa para a identificação de uma enterobactéria patogênica é o semeio da amostra 
em um meio de cultura seletivo e diferencial. Os meios mais utilizados para essa finalidade são: 
ágar eosina azul de metileno (ágar EMB, também chamado de ágar teague), ágar MacConkey, ágar 
Salmonella-Shigella (ágar SS), ágar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) e o ágar entérico Hektoen (HE).
Ágar EMB
Nesse meio, os típicos fermentadores da lactose, especialmente a Escherichia coli, produzem 
colônias de coloração escura, apresentando um brilho metálico de tom esverdeado (devido à alta 
produção de ácidos). Produtores mais fracos de ácido (Klebsiella; Enterobacter; Serratia) formam 
colônias geralmente acinzentadas. Os não fermentadores de lactose (Shigella e Salmonella, por 
exemplo) produzem colônias transparentes.
Figura 26 – Agar BEM. Detalhe das colônias verdes metálicas características de Escherichia coli
Adaptada de: https://bit.ly/2SEI17M. Acesso em: 29 jun. 2021.
56
Unidade I
Ágar MacConkey (MC)
A presença de cristal violeta na constituição desse meio impede o crescimento de bactérias 
Gram-positivas, especialmente estafilococos e enterococos. Os típicos fermentadores de lactose formam 
colônias cor de rosa/vermelha, as amostras lactose negativas apresentam-se incolores ou transparentes.
Ágar Salmonella-Shigella (SS)
Os meios SS, XLD e HE são empregados no laboratório clínico, geralmente para o isolamento de 
espécies de Salmonella e Shigella, a partir de amostras de fezes diarreicas, ou em laboratórios de saúde 
pública para investigar uma possível contaminação fecal de alimentos e reservatórios de água. 
A incorporação de lactose ao meio SS permite diferenciar entre bactérias fermentadoras de lactose 
e não fermentadoras. As primeiras formam colônias de aspecto avermelhado, já as que não fermentam 
lactose geram colônias transparentes. Uma característica importante desse meio é a presença de 
tiossulfato de sódio e citrato férrico, o que permite a detecção de H2S, evidenciado pela formação 
de pigmentação preta no centro das colônias.
Provas para identificação de enterobactérias 
Teste do tríplice açúcar ferro (TSI) 
A prova do TSI é realizada utilizando o meio conhecido como ágar TSI. É extremamente importante 
no processo de identificação, permitindo a diferenciação de bacilo gram-negativos fermentadores de 
não fermentadores ou de fermentadores lentos. O meio tem uma coloração vermelho alaranjada quando não 
inoculado, apresenta-se em tubo e no formato inclinado. Esse meio em sua composição é formado por 
três açúcares: 0,1% de glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol como indicador de pH 
para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de H2S.
1 2 3 4
Figura 27 – Teste do tríplice açúcar ferro: (1) glicose positiva e H2S positivo; 
(2) glicose positiva, lactose e sacarose negativas; (3) glicose, lactose, sacarose positivas e 
gás positivo (notar rompimento do meio por produção excessiva de gás no interior do tubo); 
(4) glicose, lactose e sacarose negativas (provável bacilo gram-negativo não fermentador) 
57
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A semeadura se faz introduzindo a agulha bacteriológica por picada até o fundo do tubo, seguido 
por estriamento na superfície inclinada, essa configuração origina duas zonas de reação dentro do 
mesmo tubo: a porção inclinada (superfície) e a porção inferior (denominada base). O meio então é 
incubado a 35-37 ºC por 18-24 horas. A fermentação é indicada pela mudança de cor do indicador 
(vermelho de fenol) de vermelho para amarelo.
Considerando-se que todos os membros da família Enterobacteriaceae são fermentadores de glicose, 
a ausência de alteração (ou leve mudança para púrpura) no meio de TSI caracteriza o indício da presença 
de bastonetes Gram-negativos não fermentadores (Pseudomonas, por exemplo), os quais apresentam 
um esquema próprio de identificação.
Ágar SIM (teste sulfeto-indol-motilidade)
Meio utilizado na identificação de enterobactérias permitindo a verificação na produção de indol, 
produção de H2S e determinação de motilidade. 
• Indol: a formação de indol acontece pela metabolização do aminoácido triptofano (presente 
no meio) por bactérias produtoras de triptofanase. Quando a bactéria é produtora da enzima 
triptofanase, promove a desaminação do triptofano gerando ácido pirúvico, amônia e indol. O 
indol pode ser detectado pela adição do reativo de Kovacs ao tubo com crescimento. Nos casos 
positivos, forma-se um anel avermelhado na superfície do tubo. 
• H2S: a formação de H2S é detectada pela presença de tiossulfato de sódio e ferro no meio, o que 
promove a formação de sulfitos insolúveis, que, quando precipitados, denotam uma coloração 
preta ao meio. 
• Motilidade: a prova da motilidade avalia de forma indireta a presença de flagelos na bactéria que 
está sendo identificada. Para a realização do teste, é condição fundamental o uso de meio semissólido a 
fim de permitir a dispersão das bactérias pelo meio em busca de nutrientes. O resultado é obtido 
pela visualização macroscópica do tubo, observando-se uma área de intensa turvação ao redor 
da picada de inoculação. A semeadura é feita com a agulha bacteriológica em picada, seguida de 
incubação a 35-37 ºC por 18-24 horas. Deve-se observar a motilidade antes de pingar algumas 
gotas de reativo de Kovacs (o pigmento escurecido, se existir, será a primeira característica notada). 
A B
Figura 28 – Prova/teste Indol. Nota-se anel vermelho, indicando 
resultado positivo (A); resultado negativo (B)
58
Unidade I
A B
Figura 29 – Prova/teste motilidade. (A) nota-se meio turvo, sendo positivo; 
(B) meio límpido e crescimento somente no local da picada, sendo negativo 
Teste do citrato de Simmons
Verifica a capacidade da bactéria de usar o citrato como única fonte de carbono. Caso a bactéria 
utilize somente o citrato de sódio como fonte de carbono, o nitrogênio também é extraído do fosfato 
de amônio contido no meio, liberando amônia; nessas condições, ocorre uma alcalinização do meio, 
alterando sua cor de verde para azul intenso. O indicador de reação é o azul de bromotimol.
Identifica-se uma amostra como positiva pela mudança da cor do meio, de verde para azul. Exemplos 
de bactérias citrato positivo são Salmonella sp. e Klebsiella sp.
A B
Figura 30 – Prova/teste citrato de Simons. (A) nota-se 
coloração azul, sendo positivo; (B) resultado negativo 
Teste da urease (ágar ureia de Christensen)
Algumas enterobactérias apresentam a capacidade de degradar a ureia por meio da ação da enzima 
urease, que acaba como resultado final, formando duas moléculas de amônia e alcalinizando o meio. 
O meio de ureia de Christensen tem originalmente uma coloração amarelo/laranja, e as bactérias 
produtoras deurease provocam uma mudança de cor para rosa/vermelho.
59
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A B
Figura 31 – Prova/teste urease. (A) nota-se coloração 
rosa, caso positivo; (B) resultado negativo 
Teste do vermelho de metila (VM) e Voges-Proskauer (VP)
Para a identificação de enterobactérias, também podemos nos valer de testes que avaliem a via de 
metabolização do piruvato, utilizado por bactérias. As enterobactérias fermentam a glicose por meio 
da via de Embden-Meyerhof, a fim de formar ácido pirúvico, mas a forma de utilização pode ocorrer por 
outras duas vias conhecidas, como ácida mista ou butilenoglicólica. O teste de VM e VP revela por qual dessas 
duas vias ocorre a utilização do piruvato (VM – via ácida mista; VP – via butilenoglicólica).
Para a realização do teste, utiliza-se um caldo (meio líquido) à base de peptona, fosfato de potássio 
e grande concentração de glicose. Para a realização dos testes, serão utilizados dois tubos idênticos, 
identificados como VM e VP. 
No tubo indicado para VM, pingam-se, após inoculação com a bactéria a ser investigada por 24 horas 
a 35-37 °C, algumas gotas de vermelho de metila para verificar a produção, ou não, de ácidos mistos 
(sobretudo ácido láctico, acético e fórmico) suficientes para manter o pH abaixo de 4,4. A cor do meio, 
que é naturalmente branca, ficará completamente vermelha após a adição do vermelho de metila.
No tubo indicado para o teste de VP, pinga-se uma solução de hidróxido de potássio (KOH) e, em 
seguida, algumas gotas de alfa-naftol, após inoculação com a bactéria a ser investigada por 24 horas 
a 35-37 °C. A visualização do resultado é a mesma: presença de coloração vermelha. As bactérias que 
utilizam a via do butileno glicol, como certas cepas do grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia-Hafnia, 
produzem apenas pequenas quantidades de ácidos mistos, que podem ser insuficientes para reduzir o 
pH do meio contendo vermelho de metila e produzir mudança de cor. Em consequência, as espécies de 
Enterobacteriaceae que são VP positivas são, na maioria das vezes, VM negativas e vice-versa.
60
Unidade I
Figura 32 – Prova/teste VM/VP. Nota-se coloração vermelha revelando 
positividade para o teste. Os resultados são autoexcludentes, ou 
seja, se VM positivo, VP será negativo e vice-versa
Teste da fenilalanina desaminase (ágar de fenilalanina)
O teste avalia a capacidade de formação de ácido fenilpirúvico a partir da ação da fenilalanina desaminase. 
Para tal, utiliza-se o meio de fenilalanina. A bactéria, se produtora da enzima fenilalanina desaminase (FAD), 
degrada a fenilalanina do meio formando ácido fenilpirúvico. A revelação do teste é feita após o período 
de incubação, adicionando-se ao meio algumas gotas de cloreto férrico a 10% como indicador do meio. 
O meio, que é normalmente de coloração branca, apresentará uma mudança de cor para verde, 
sobretudo na área da rampa ou superfície do meio. Esse teste é útil para diferenciação inicial de 
espécies de Proteus sp., Morganella sp. e Providencia sp. de outros bacilos Gram-negativos. Apenas os 
membros desses gêneros e alguns microrganismos isolados relativamente raros do grupo Enterobacter sp. 
possuem a enzima responsável pela desaminação oxidativa da fenilalanina. 
FAD (+)
FAD (-)
Figura 33 – Prova/teste FAD. Nota-se coloração verde na superfície/rampa do tubo
61
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Teste da lisina descarboxilase (LDC) ou teste da descarboxilação de lisina, arginina e ornitina
Verifica a presença de uma enzima denominada lisina descarboxilase, ornitina descarboxilase e da 
arginina de-hidrolase (exceção no grupo). No teste, avalia-se a capacidade das bactérias de descarboxilar 
os aminoácidos presentes no meio de cultura. As enzimas removem de diferentes formas as moléculas de 
CO2 de um aminoácido para formar aminas de reação alcalina, gerando como produtos desse processo:
• Lisina → cadaverina.
• Arginina → citrulina.
• Ornitina → putrescina.
Visto que a conversão da arginina em citrulina não ocorre por ação de uma descarboxilase, mas sim 
de uma de-hidrolase, o grupo NH2 é retirado da arginina como primeira etapa; em seguida, a citrulina é 
convertida em ornitina, que sofre descarboxilação para gerar putrescina.
Os testes podem ser feitos em meio líquido ou em meio semissólido, contendo cada tubo um 
aminoácido especifico, os testes são independentes, podendo ser feitos todos em separado e os resultados 
analisados em conjunto com as demais provas ou testes 
Um pH abaixo de 5,5 é a condição ideal para a ação das enzimas. Caso a bactéria analisada possua uma 
descarboxilase ou de-hidrolase para o aminoácido teste, essa reação irá alcalinizar o meio, devolvendo 
sua cor púrpura original. Sendo assim, a positividade do teste é dada pela manutenção da cor púrpura, 
após o período de incubação. A mudança de cor indica a produção de ácidos pela fermentação ou quebra 
da glicose e um teste negativo (esse é o único teste cuja mudança de cor exibe um resultado negativo).
A B
Figura 34 – Prova/teste LDC. (A) nota-se coloração púrpura original e mantida após 
inoculação na superfície; (B) tubo de meio com coloração amarela após inoculação, 
indicando resultado negativo para o aminoácido testado
62
Unidade I
A identificação de Enterobactérias é realizada, portanto, com base na análise em separado de cada 
teste em termos de resultado positivo ou negativo e pela análise conjunta de todos os resultados. No 
quadro a seguir, estão indicados os resultados positivos ou negativos para os diversos testes para as 
principais enterobactérias de importância clínica. 
Quadro 9 – Identificação das principais bactérias da família Enterobacteriaceae
Bactérias IND CIT H2S URE FAD LDC MOT GÁS LAC
Citrobacter freundii (-/+) (+/-) (+/-) (V) (-) (-) (+) (+) (+)
Edwardsiella tarda (+) (-) (+) (-) (-) (+) (+) (+) (-)
Enterobacter aerogenes (-) (+) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+)
Enterobacter cloacae (-) (+) (V) (+/-) (-) (-) (+) (+) (+)
Escherichia coli (+) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (+) (+)
Salmonella spp. (-) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (+) (-)
Salmonella typhi (-) (+) (-) (-) (-) (+) (+) (-) (-)
Salmonella paratyphi (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+) (+) (-)
Serratia marcescens (-) (+) (-) (-/+) (-) (+) (+) (+/-) (-)
Shigella dysenteriae (-/+) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Shigella flexneri (+/-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Klebsiella pneumoniae (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (+)
Klebsiella oxytoca (+) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (+)
Morganella morganii (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (+) (-)
Proteus mirabilis (-) (+/-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)
Proteus vulgaris (+) (-) (+) (+) (+) (-) (+) (+) (-)
IND=INDOL; CIT=CITRATO; URE=UREIA; FAD=FENILALANINA DESAMINASE; LDC= LISINA DESCARBOXILASE; 
MOT= MOTILIDADE; LAC= LACTOSE; (+/-) 55% ou mais das cepas são positivas; (-/+) 55% ou mais das cepas são 
negativas; (V) proporção de cepas com resultados positivos ou negativos em torno de 50%; (+) Cepas 100% positivas; 
(-) Cepas 100% negativas
 Lembrete
Essa tabela foi elaborada com base nas orientações para identificação 
de BGN da família Enterobacteriaceae publicada pela Agencia Nacional de 
Vigilância Sanitária. Esteja sempre atento às atualizações e informes da 
Anvisa e publicações do CLSI.
3.2 Identificação presuntiva de bacilos Gram-negativos não fermentadores 
Os bacilos Gram-negativos não fermentadores (BNFs) são bactérias aeróbias, não esporuladas, 
incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia por meio de fermentação, degradando-os pela 
via oxidativa.
63
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Os BNFs são de grande importância nos casos de infecção hospitalar, geralmente relacionados com 
resistência elevada a vários antibióticos, sobretudo em infecções graves. O número de bactérias não 
fermentadoras conhecidas é muito grande.
Para o isolamento de BNFs, é comum utilizar inicialmente de meios como ágar MacConkey e 
ágar sangue. O microbiologista pode suspeitar de que um bacilo Gram-negativo desconhecido 
que cresça emalgum desses (ou nos dois) meios seja membro do grupo não fermentador, caso 
ele apresente ausência de evidências de fermentação da glicose (o que pode ser confirmado pela 
semeadura em TSI). São exemplos bastante importantes de BNFs a Pseudomonas sp. e Acinetobacter sp., 
Moraxella sp., entre outros. A seguir, são destacadas as principais provas para a identificação de 
bactérias não fermentadoras. 
Prova da oxidase
Essa prova é simples e de fácil realização, visto que já existem no mercado várias tiras ou fitas 
contendo reativos específicos para tal. Nesse caso, basta fazer a seleção da colônia suspeita a partir 
de uma placa semeada de MacConkey ou ágar sangue, retirá-la da placa com um palito de madeira 
(preferencialmente), e espalhar a colônia na área de teste na tira (papel de filtro saturado com o reagente), 
tal como pode ser observado na figura seguinte. A positividade do teste é dada pelo aparecimento de 
uma coloração arroxeada, indicando atividade de citocromo oxidase.
(Pos)
(Neg)
Figura 35 – Teste de oxidase indicando Positividade nos casos de BNFs
Produção de pigmento
Os não fermentadores produzem diversos pigmentos, alguns dos quais são úteis para identificar uma 
espécie. No caso da Pseudomonas sp., é importante destacar a produção de piocianina, um pigmento 
que confere ao meio de cultura e às colônias bacterianas um tom azulado, como pode ser observado na 
figura a seguir. 
64
Unidade I
Figura 36 – Produção de pigmento (piocianina) típico de crescimento por Pseudomonas aeruginosa 
Prova de oxidação e fermentação (OF)
Esse teste avalia a capacidade do BNF em utilizar os carboidratos por meio de uma das duas possíveis 
vias, seja a via oxidativa ou a via fermentativa. O meio OF pode ser utilizado como base para verificar a 
metabolização de diversos açúcares: glicose, frutose, lactose, maltose, manitol, sacarose, xilose. Utiliza-se 
para a realização do teste um meio de ágar base acrescido do açúcar que se deseja testar. Normalmente, 
utiliza-se o OF-glicose. Nesse teste, são necessários dois tubos para cada açúcar a ser testado. 
Um dos tubos deve estar com a entrada de ar oclusa por meio de uma camada de óleo mineral, 
impedindo a dispersão no meio do oxigênio. As bactérias oxidativas produzem ácidos apenas no tubo 
aberto (exposto ao oxigênio atmosférico); as bactérias fermentadoras produzem ácidos em ambos 
os tubos; e as bactérias não sacarolíticas permanecem inertes nesse meio. O indicador é o azul de 
bromotimol; a cor amarela indica fermentação. 
A)
Óleo
Óleo
Aberto 
sem óleo
C) B)
Figura 37 – (A) meio de OF-glicose para teste de OF-tubo. Fermentação positiva (bactéria fermentadora); (B) e (C) Tubos positivos para 
bactéria não fermentadora. Observe que bactérias oxidativas não são capazes de fermentar a glicose no tubo fechado, preservando a 
cor original do meio (verde) e, quando em contato com o oxigênio, promovem oxidação (amarelo) 
65
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Crescimento em caldo tryptic soy broth (TSB) a 42 °C
Para esse teste, utiliza-se o meio de TSB na forma de caldo, ou seja, meio liquido. Para tal, retira-se 
de 2 a 3 colônias da placa de ágar MacConckey ou ágar sangue e inocula-se no interior do meio de 
TSB agitando com alça bacteriológica estéril ou devidamente flambada. Após agitação, deve-se incubar 
o tubo a temperatura de 42 °C e, após período de incubação, deve-se notar se houve crescimento 
bacteriano por turvação característica do meio ou não (meio límpido).
A) B)
Figura 38 – Teste do crescimento em TSB 42 °C indicando (A) negativo e (B) positivo
Além dos testes explicitados, adicionalmente ainda são realizados outros testes, os quais também 
são realizados para bactérias Gram-negativas fermentadoras da família das enterobactérias, como testes 
de urease, citrato, motilidade, lisina e bile-esculina (nesse caso, para grupo dos estreptococos). Dessa 
forma, também nos baseamos em tabelas de identificação recomendadas pela Anvisa para a correta 
identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores em todas suas especificidades em termos 
de gêneros e espécies.
3.3 Identificação presuntiva de bacilos curvos (espiralados)
Os denominados bacilos curvos ou espiralados são, em sua maioria, de frequência rara no laboratório 
de microbiologia, com exceção das cepas de Campylobacter sp., e, por essa razão, é uma recomendação da 
Anvisa que a identificação desses agentes, quando de testes ou exames morfológicos sugestivos, deva 
ser feita por profissionais dos laboratórios de referência.
Entre as bactérias pertencentes a esse grupo, pode-se destacar a Leptospira sp., causadora 
da leptospirose, que tem como reservatório cães, gatos, porcos e ratos e cuja transmissão ocorre 
principalmente por meio da água e alimentos contaminados. Pode-se destacar também o Helicobacter 
pylori associado aos quadros de úlcera péptica e gastrite, sobretudo em humanos, macacos e felinos, e 
cuja transmissão é fecal-oral. Não obstante, ainda como membro importante desse grupo, destacam-se 
as bactérias do gênero Vibrio sp., obviamente associadas com gastroenterites bastante produtivas e cuja 
principal via de transmissão é a água e os alimentos. 
66
Unidade I
Nos casos de suspeita de infecção por Campylobacter jejuni ou Campylobacter fetus (principal 
espécie associada a infecções extraintestinais), deve-se colher material fecal em meio de transporte 
conhecido como Cary-Blair. Tão logo o material chegue ao laboratório, deve ser submetido a uma 
microscopia utilizando a técnica de Gram, recomenda-se a utilização da fucsina a 0,1% por 2 minutos, 
diferente do que é realizado no teste convencional.
É comum observar a presença de inúmeros leucócitos na amostra corada, mas a cultura sempre 
deve ser preconizada independentemente da presença ou ausência de leucócitos na matéria fecal. 
O Gram da amostra fecal por inúmeros estudos apresenta uma sensibilidade em torno de 70-90% e 
elevada especificidade.
A maioria das espécies de Campylobacter é microaerofila, exigindo entre 5% e 10% de CO2 e 
85% de N2. Para tal, deve-se utilizar geradores específicos para microaerofila ou estufa de CO2. 
Já para o isolamento, podem ser utilizados diversos meios de cultura específicos, sendo o mais 
utilizado o ágar carvão desoxicolato cefoperazona, o meio Campy e o meio de Karmali.
Para a identificação presuntiva de Campylobacter e suas espécies, várias provas são realizadas, 
algumas das quais já debatidas em capítulos anteriores, como a prova da catalase, H2S, TSI, crescimento 
a 25 °C; crescimento a 42 °C; crescimento em ágar MacConkey, teste de sensibilidade ao ácido nalidíxico 
e à cefalotina.
As provas que se baseiam no crescimento em meios submetidos a diferentes temperaturas se baseiam na 
capacidade de a bactéria se adaptar em temperaturas mesófilas ou termofilias (acima de 40 °C). A maioria 
das espécies de Campylobacter são termofílicas, com a exceção de Campylobacter fetus (mesófila). 
Os testes de sensibilidade utilizam do princípio da técnica de disco-difusão de Kirby-Bauer e avaliam o 
perfil de sensibilidade ou resistência de cada espécie.
Os resultados para as principais espécies de Campylobacter sp. podem ser observados no 
quadro a seguir: 
Quadro 10 – Identificação das principais bactérias da familia Enterobacteriaceae
Bactérias CAT H2S TSI Cresc 25 °C Cresc 42 °C MacConkey NAL CEF
Campylobacter jejuni (+) (-) (-) (-) (+) (+) (v) res
Campylobacter coli (+) (-) (-) (-) (+) (+) sen res
Campylobacter fetus (+) (-) (-) (+) (-) (+) (v) sen
CAT=CATALASE; TSI= TRIPLICE AÇÚCAR FERRO; NAL =ÁCIDO NALIDÍXICO; CEF=CEFALOTINA; (+/-) 55% ou mais das cepas 
são positivas; (-/+) 55% ou mais das cepas são negativas; (V) proporção de cepas com resultados positivos ou negativos ou 
resistentes/sensíveis em torno de 50%; (+) Cepas 100% positivas; (-) Cepas 100% negativas; res= cepas resistentes; sen= 
cepas sensíveis.
67
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
4 PROTOCOLOS ESPECIAIS NO DIAGNÓSTICO EM BACTERIOLOGIA CLÍNICA
4.1 Urocultura
Inúmerassituações podem demandar a cultura de amostras de urina, sobretudo quando existe 
suspeita de infecções do trato urinário, no controle terapêutico e/ou em pacientes assintomáticos, os 
quais podem apresentar alto risco de infecção. As infecções do trato urinário (ITU) apresentam-se como 
as mais comuns na prática clínica, atingindo, sobretudo, crianças e adultos, entre eles, do sexo feminino 
são as mais susceptíveis.
A susceptibilidade natural de pacientes do sexo feminino se explica em funções de diferenças 
anatômicas, como o tamanho da uretra (mulheres apresentam uretra 4 a 5 vezes menor que os homens, 
variando na mulher entre 4-5 cm e, nos homens, por volta de 20 cm), a proximidade da abertura genital 
com o poro anal, fatores hormonais, gestação, entre outras situações.
As infecções urinárias podem vir a ocorrer em diferentes grupos etários, desde neonatos a idosos 
com idade acima de 65 anos, nos quais as ITU ocorrem quase que indistintamente entre ambos os sexos. 
Em idosos, a elevada frequência de ITU associa-se a doenças de base, como hipertrofia prostática e 
cistocele, condições que dificultam o esvaziamento normal da bexiga e o aumento do pH vaginal.
As infecções do trato urinário podem, em razão de sua topografia ou localização, serem classificadas 
em ITUs altas, quando atingem sobretudo o parênquima renal e/ou os ureteres, respectivamente 
conhecidas pelos nomes de pielonefrite e ureterites. Quando baixas, atingem bexiga, uretra e, 
particularmente nos homens, a próstata e o epidídimo, episódios clinicamente denominados de cistite, 
uretrite, prostatite e epididimite. 
A pielonefrite é caracterizada clinicamente por febre, calafrios, náuseas, vômitos e dor posterior 
e região dos flancos, é comum apresentar-se como assintomática nas situações crônicas. A cistite 
é caracterizada por disúria, ou seja, uma dificuldade para urinar muitas vezes acompanhada de 
sintomas como ardência, dor e/ou desconforto ao urinar. Uretrite também é caracterizada por disúria 
e poliúria, ou seja, um aumento significativo da frequência miccional, muitas vezes acompanhadas de 
corrimento uretral. 
São inúmeros os agentes que podem ser frequentemente implicados com ITU, sendo os mais frequentes 
agentes etiológicos as bactérias da família Enterobacteriaceae, tais como Escherichia coli, Grupo CESP 
(Citrobacter spp., Enterobacter spp.; Serratia spp., Proteus spp.) e Klebsiella spp. Entre os gram-positivos, 
sobretudo do grupo dos cocos, destacam-se Staphylococcus saprophyticus e o Enterococcus spp.
As ITU podem ocorrer de várias formas e com manifestações clínicas diferentes, podendo variar 
desde episódios únicos, pouco frequentes, a situações de infecções de longa duração denominadas 
comumente de crônicas.
São consideradas ITU isoladas ou únicas quando o evento ocorre de forma isolada, sendo tratada com 
antibioticoterapia convencional. ITUs recidivantes são determinadas quando ocorre falha terapêutica, o 
68
Unidade I
que se percebe nitidamente em razão da persistência de um mesmo microrganismo isolado em situações 
anteriores, tal condição pode levar a uma infecção persistente também conhecida como crônica, a qual 
pode ser sintomática ou assintomática.
Quando uma paciente apresenta frequente ITU por agentes microbianos diferentes, ou seja, sem 
relação entre os diferentes episódios ocorridos anteriormente, classifica-se a infecção como sendo uma 
situação de reinfecção, e não deve ser confundida com situações de infecções do trato urinário crônicas.
ITUs crônicas caracterizam-se por apresentar a manutenção do mesmo microrganismo por longos 
períodos, muitas vezes meses e ou anos, durante os quais são extremamente comuns os episódios de 
recidivas pós-tratamento.
Para o diagnóstico de ITU, deve-se utilizar de urocultura, por ser considerado exame padrão, também 
conhecido como gold-standard. No entanto, para uma realização e interpretação perfeita dos resultados, 
o exame reveste-se de uma série de cuidados, os quais devem ser observados.
Para a realização do procedimento, preconiza-se preferencialmente a utilização da primeira amostra, 
ou seja, a coleta e utilização da primeira urina da manhã, sempre em frasco estéril, de boca larga e 
tampa de rosca e, preferencialmente, antes da utilização de antibióticos e/ou outros medicamentos. 
Na impossibilidade de se colher a primeira amostra da manhã ou por orientação da unidade laboratorial, 
pode-se colher outras amostras, desde que o paciente seja devidamente orientado a manter uma 
retenção vesical de pelo menos 2 a 3 horas. 
Para uma execução e interpretação segura da urocultura, são informações úteis a serem consideradas: 
• se o paciente apresenta indícios e/ou sintomas de infecção urinária, bem como leucocitúria; 
• se do sexo feminino, se é gestante, bem como a idade do paciente; 
• independentemente do sexo, o tipo de coleta empregado e o uso prévio de antibióticos.
4.1.1 Tipos de amostra
• Jato médio: considerada a amostra ideal, é aquela colhida por jato médio, espontâneo, do qual 
deve-se inicialmente proceder como uma rigorosa assepsia da região genital, desprezar o primeiro 
jato de urina ou até obter a sensação de esvaziamento parcial da bexiga, e colher a amostra em 
frasco estéril, desprezando o volume residual.
• Saco coletor: comumente utilizado em crianças, sobretudo neonatos e lactentes que não 
respondem a comandos. Nesses casos, utiliza-se de saco coletor estéril apropriado e devidamente 
identificado. Deve-se, para tal, proceder com a assepsia prévia da região genital e aplicar o saco 
coletor de maneira asséptica. Promover a substituição do saco coletor em intervalos que podem 
variar de 45 a 60 minutos, sempre zelando pelo procedimento asséptico, até o momento da coleta 
do material. O setor técnico responsável pelo processamento da amostra deve receber o saco 
69
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
coletor perfeitamente vedado, sob o risco de rejeitar a amostra por contaminação do material. Em 
crianças que utilizam fraldas, é fundamental zelar para que não ocorra contaminação da amostra 
com material fecal. Em pacientes em condições especiais com recém-nascidos e lactentes de 
baixo peso, importante avaliar a indicação de punção vesical suprapúbica.
• Punção vesical suprapúbica: metodologia pouco utilizada, sendo recomendada para crianças 
menores de 2 anos de idade ou para pesquisa de bactérias anaeróbias. Para se colher tal material, 
utiliza-se de agulha e seringa estéril e se procede com a punção vesical.
• Coleta de sonda vesical: embora não recomendada em razão da grande possibilidade de 
contaminação por microrganismos, sobretudo aqueles formadores de biofilme, o procedimento 
pode ser realizado pinçando-se a cânula do coletor, proceder com sua desinfecção com solução 
degerminante (álcool 70%) e, com agulha e seringa estéril, puncionar a cânula e retirar por volta 
de 10 ml de urina, transferindo-a para frasco estéril para posterior processamento da amostra. 
Uma vez colhidas, as amostras são estáveis a temperatura ambiente por no máximo 2 horas 
(passado esse tempo, a amostra deve ser refrigerada a temperatura entre 2 e 8 °C e processadas 
em até 24 horas). Se a amostra for colhida utilizando-se de conservante, como no caso do ácido 
bórico, a amostra pode ser mantida em temperatura ambiente (entre 20-25 °C por até 24 horas 
antes de vir a ser processada). Quanto ao volume recomendado, solicita-se que não seja inferior 
a 2 ml e, se a amostra tiver de ser submetida em paralelo ao exame de urina tipo 1, que não seja 
inferior a 10 ml.
4.1.2 Procedimento
Em amostras de urinas em que a análise microscópica de amostra não centrifugada revela dois 
ou mais microrganismos de mesma característica morfológica por campo, sugere-se uma correlação 
com contagem igual e/ou superior a 105 UFC/ml. A presença de microrganismos de tipos morfológicos 
distintos e numerosas células epiteliais e/ou cristais e/ou cilindros pode indicar contaminação de amostra.
Microscopia de Gram 
Homogeneizar e não 
centrifugara amostra
Deixar secar em temperatura 
ambiente e fixar sobre a 
chama
Retirar 10 µl de amostra e 
aplicar sobre uma lâmina
Reportar o número de 
microrganismos observados 
em aumento de 100x
Figura 39 – Algoritmo para análise microscópica de amostra de urina não centrifugada 
(reportar o número de microrganismos como raros, frequentes ou numerosos)
Para se proceder com a urocultura, deve-se utilizar da semeadura conhecida como semiquantitativa 
em placa, conforme esquema a seguir:
70
Unidade I
Homogeneizar a amostra 
sem centrifugar
Imergir alça calibrada 
de 0,01 ou 0,001 ml
Semear em ágar Cled
Fazer semeadura 
semiquantitativa
Incubar em estufa 
bacteriológica a 35 ± 1 °C 
entre 18-24 horas (contagem)
Semear em ágar 
MacConkey 
Figura 40 – Algoritmo para urocultura (proceder à contagem de colônias)
Existem muitas circunstâncias nas quais é necessário avaliar quantitativamente a população 
bacteriana, entre as quais, na avaliação de um paciente com infecção do trato urinário. Para tal, são 
descritas inúmeras técnicas, como: a partir da contagem através de aparelhos eletrônicos; pela contagem 
por microscopia ou por análise turbidimétrica, na qual considera-se que a turvação é proporcional à 
quantidade de bactérias existentes.
Alguns métodos podem ser empregados para se determinar o número de bactérias viáveis tanto 
quanto não viáveis. Para a determinação do número de bactérias viáveis, o método clássico é conhecido 
como método de contagem de colônias em placas, o qual se baseia que cada bactéria no meio de cultura 
dará origem a uma colônia, assim trabalhando com volumes conhecidos e contando o número de 
colônias que cresceram, é possível avaliar o número de microrganismos viáveis por volume de amostra.
A diluição da amostra não é um requisito obrigatório para o método de contagem, no entanto, pode 
ser utilizado a fim de propiciar uma contagem e identificação mais precisa das colônias bacterianas. 
Nesse caso, deve-se proceder à contagem e, depois, a correção em função da diluição da amostra, 
podendo-se aplicar a seguinte fórmula:
N= C X D X FC
Onde: 
N: número de bactérias viáveis/ml de amostra.
D: diluição.
C: número de colônias contadas na placa.
Fc: fator de correção do volume (quando forem semeados 0,1 ml) multiplica-se por 10.
O resultado é sempre expresso em unidades formadoras de colônias (UFC) por ml.
71
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Para uma interpretação segura e coerente da urocultura, deve-se levar em consideração não apenas 
a contagem de microrganismos, mas também a presença e/ou ausência de leucócitos e, se possível, a 
presença e/ou ausência de sintomas.
Quando as contagens de colônias forem inferiores a 105 UFC/ml, mas houver presença de um único 
microrganismo potencialmente patogênico e ausência de informações clínicas, considerar uma possível 
infecção do trato urinário. São considerados possíveis contaminantes de amostras Lactobacillus, 
Staphylococcus coagulase negativo, difteroides, entre outros. 
Os algoritmos para urocultura com contagem superior a 105 UFC podem ser observados na figura a 
seguir, bem como o algoritmo para urocultura a partir de amostra colhida por punção suprapúbica, que 
pode ser observada na figura 42.
Dois prováveis 
patógenos com 
sintomas de ITU
Identificar o nível 
da epécie
Solicitar nova 
amostra para 
confirmação
Fazer 
antibiograma
Um provável 
patógeno
Identificar o 
nível de espécie
Se paciente 
assintomático 
(bacteriúria 
assintomática)Fazer 
antibiograma
Na presença de 
outras espécies em 
contagens < 104 
relatar número de 
microrganismo
Figura 41 - Algoritmo para urocultura com contagem de colônias ≥ 105 UFC/ml em amostras colhidas por jato médio
72
Unidade I
Um ou dois patógenos 
(identificação e antibiograma)
Três ou mais patógenos 
(identifique a espécie, mantenha 
cultura por segurança por 72 h)
Sem crescimento 
Reexamine após 48 horas. 
Se negativo, reporte com não houve 
crescimento bacteriano (NHCB)
Figura 42 – Algoritmo para urocultura em amostras colhidas por punção suprapúbica
4.1.3 Laminocultivo (sistema comercial)
O laminocultivo consiste de dois meios de cultura. Como os mais utilizados, destacam-se Cled e 
MacConkey e outras combinações. Método bastante utilizado por laboratórios, não necessitando de alça 
calibrada ou técnica específica de semeadura, facilidade no transporte, fácil conservação do produto em 
temperatura ambiente, além de permitir a identificação presuntiva de bactérias mais comuns causadoras 
de infecção do trato urinário, como E. coli.
O Uribac é um exemplo de laminocultivo disponível comercialmente pela Probac do Brasil. É um sistema 
prático de laminocultivo indicado para o diagnóstico presuntivo de microrganismos que causam infecções 
do trato urinário, permitindo a identificação direta de E. coli (microrganismo responsável por 80 a 90% dos 
casos de infecção urinária adquiridas na comunidade e por pelo menos 50% das adquiridas em hospitais). 
É também a identificação presuntiva de outros microrganismos que também são responsáveis por casos 
de infecções do trato urinário, como Morganella spp., Proteus spp. e Providencia spp. O Uribac possui 
três tipos de meios no laminocultivo, o que permite a identificação presuntiva de alguns microrganismos 
envolvidos no processo infeccioso. Na face larga, temos meio CLED, e nas faces divididas, os meios citrato 
de Simmons e indol, acompanha um frasco de reativo de Kovacs para prova do indol.
Homogenizar a urina sem 
centriufugar
Imergir o sistema no frasco de urina 
ou semear com auxilio de ceconete
Incubar em estufa bacteriológica 
35 ±1 °C por 18-24 horas 
Se negativo e sedimenoscopia 
positiva para bactérias e leuocócitos, 
reincubar por mais 18-24 horas
Se positivo identifique espécie e 
realize antibiograma 
Figura 43 – Fluxograma para urocultura processada em laminocultivo comercial
73
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
O crescimento em meio Cled determina a capacidade do microrganismo em fermentar a lactose. 
Sua face larga permite a contagem aproximada em UFC/ml presente na amostra, a contagem pode ser 
realizada comparando com o padrão de crescimento demonstrado na figura a seguir:
102 103 104 105 106
Figura 44 – Lamino cultivo. Esquema indicando crescimento bacteriano em meio Cled
Como principais desvantagens, destaca-se ser um método semiquantitativo, ter uma superfície 
menor de leitura e a dificuldade em visualizar cultura mista.
4.2 Coprocultura
Um grande número de agentes infecciosos distintos pode ser frequentemente relacionado a síndromes 
diarreicas, às quais persistem ainda como um grave, se não um dos maiores problemas de saúde pública 
do Brasil e do mundo. Calcula-se que cerca de mais de um bilhão de casos ocorram anualmente em 
crianças, sobretudo aquelas menores de 5 anos de idade, e desses, mais de 2 milhões de óbitos.
As causas mais comumente associadas às diarreias e gastroenterites, de uma maneira geral, podem 
ser classificadas como infecciosas e não infecciosas.
Entre as causas infecciosas mais comuns, podemos citar aquelas causadas por bactérias, especialmente 
as pertencentes à família Enterobacteriaceae, como Escherichia coli sp., Salmonella spp., Shigella spp., 
protozoários como Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, vírus, como os enterovírus. De maneira 
especial, rotavírus e vírus da hepatite A (HVA) e, de forma menos comum, os fungos, alguns deles 
produtores de micotoxinas, como Aspergillus flavus, produtor de aflatoxina.
As causas para doenças diarreicas de origem não infecciosas estão normalmente relacionadas a 
quadros alérgicos, como doença celíaca, intolerância à lactose e casos de envenenamento acidental com 
remédios, produtos de limpeza, gasolina, entre outros.
A detecção, sobretudo de bactérias em amostras fecais, nem sempre é um procedimento simples, 
ainda mais em razão da existência da microbiota intestinal residente, a qual configura-se com sendo 
extremamente diversa e complexa. A formação dessa microbiotaocorre gradualmente logo após o 
nascimento, desenvolvendo-se até o primeiro ano de vida e estabelecendo-se dessa forma por toda 
a fase adulta, podendo ser influenciada por terapias antimicrobianas às quais o indivíduo vier a ser 
submetido. Estima-se que cerca de 1/3 do peso seco da amostra fecal seja constituído por bactérias, 
razão da dificuldade já relatada de se determinar em uma situação de patologia quais, entre os 
74
Unidade I
agentes bacterianos presentes na amostra, de fato estariam implicados com o quadro de doença a 
ser investigado.
Grande parte dos microrganismos presentes na microbiota intestinal, algo em torno de 90% ou mais, 
são bactérias anaeróbias estritas, predominantemente pertencente aos gêneros Propionibacterium, 
Bifidobacterium, Bacteroides, entre outras.
Discute-se amplamente qual seria a dose mínima infectante, ou seja, contagem mínima de 
microrganismos para o aparecimento de uma doença e/ou síndrome diarreica, o que se entende é 
que, além da dose mínima, e talvez até de forma mais importante, os fatores de virulência, muitas 
vezes típicos e característicos de um determinado grupo, são os elementos que mais colaboram para o 
surgimento dos sintomas. 
Muitos microrganismos são produtores de toxinas, como é o caso de Aeromonas spp., Bacillus cereus, 
Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e Escherichia 
coli enterohemorrágica (EHEC), Staphylococcus aureus e bactérias do gênero Vibrio, especialmente 
Vibrio cholerae.
Outros apresentam a capacidade de invadir e multiplicar-se em tecidos, como Campylobacter jejuni, 
Salmonella spp., Shigella spp. e outros de se aderirem ao epitélio e mucosa intestinal, como no caso da 
EPEC (Escherichia coli enteropatogênica clássica). 
Os sintomas, bem como sua intensidade, variam nos pacientes, associando-se aos mecanismos 
de patogenicidade, ou seja, de virulência, empregado pelo microrganismo causador do evento. Dessa 
forma, o tempo para início dos sintomas e outros sinais, como número de evacuações, vômitos, febre, 
desidratação, presença de sangue e/ou muco nas fezes pode variar de formas mais simples e até mesmo 
inaparentes, quando de simples processos de aderência ao epitélio e/ou mucosa, até situações mais 
graves, quando de infecção por bactérias cuja produção de toxina é caracterizada por aquelas com 
potencial neurotóxico.
A amostra ideal para a realização de coprocultura constitui-se de cerca de 1,5 a 2 gramas de fezes, 
preferencialmente colhida na fase inicial do quadro diarreico e antes de a antibioticoterapia ser iniciada. 
Recomenda-se que a amostra seja mantida em frasco contendo conservante, pois isso facilita o processo 
de organização e execução dos procedimentos laboratoriais que se farão necessários.
Entre os conservantes mais comuns utilizados na prática laboratorial, no que tange ao exame 
de coprocultura, destaca-se a glicerina tamponada, usualmente utilizada quando da pesquisa de 
Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp. e Vibrio spp. Outro conservante bastante utilizado 
por sua praticidade e custo é o meio de Cary-Blair, conhecido por sua capacidade de conservação de 
amostras contaminadas por Shigella spp. e, especialmente, por Vibrio spp. Nesse caso, especificamente, 
amostras de anal swab devem ser mantidas em temperatura ambiente, 20 a 25 °C .
De todos os procedimentos descritos, atenção especial deve ser dada para a pesquisa de Clostridium spp., 
em que as amostras colhidas obrigatoriamente devem ser mantidas refrigeradas com temperatura 
entre 2-8 °C por até 12 horas e recomenda-se a coleta das fezes em frasco sem conservante.
75
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Algumas situações decorrentes do processo de coleta e/ou falha no processo de orientação do 
paciente podem inviabilizar o processamento do exame, entre elas, destacam-se as amostras colhidas 
sem conservantes, que são mantidas inadvertidamente por período superior a 3 horas em temperatura 
ambiente, amostras colhidas ao longo do dia e misturas em um único frasco coletor, fezes líquidas 
colhidas e enviadas em fraldas muitas vezes contaminadas com amostras de urina.
Para coleta de amostras utilizando de swab ou ceconete de algodão, deve-se tomar cuidados no 
sentido de evitar falhas no processo de coleta. Nesse sentido, deve-se sempre umedecer a ponta de 
algodão com solução salina estéril; nunca usar géis ou pomadas lubrificantes; inserir o ceconete no 
esfíncter retal fazendo movimentos de rotação, e ao retirar o swab, verificar se a ponta do algodão 
apresenta coloração compatível com a presença de fezes, recomenda-se não exceder o tempo de 
30 minutos para envio do material ao laboratório e enviá-lo em meio de transporte adequado.
4.2.1 Procedimento
A bacterioscopia das fezes não é realizada na rotina do laboratório de microbiologia, no entanto, sabe-se 
que, eventualmente, pode fornecer informações bastante valiosas para a identificação de processos 
de infecção, tais como presença de piócitos e hemácias, os quais são indicativos de infecções por 
microrganismos invasores; presença maciça de bactérias Gram-positivas para infecções por Staphylococcus 
aureus e toxinfecções por bacilos encurvados, que sugere fortemente infecção por Campylobacter spp. 
e/ou Vibrio spp. Importante ressaltar que as amostras colhidas com conservante não permitem 
uma visualização perfeita de leucócitos e hemácias, no entanto, a conservação da amostra para a 
cultura é prerrogativa do exame. 
Em linhas gerais, o sistema de cultura de fezes utiliza inúmeros meios seletivos Agar McConkey, 
diferenciais a fim de aperfeiçoar o processo e garantir o isolamento de microrganismos potencialmente 
patogênicos, mesmo em dose ou carga microbiana considerada baixa.
Se a amostra a ser analisada corresponde a fezes líquidas, elas devem ser semeadas diretamente 
nos meios indicados, no entanto, se a amostra se constituir de fezes sólidas ou pastosas, sugere-se que 
se prepare uma suspensão em solução contendo 10% de salina tamponada glicerinada e proceda na 
sequência com a semeadura.
Os meios mais usualmente utilizados para o procedimento são:
• Ágar McConkey, reconhecidamente um dos mais utilizados, sendo considerado um meio 
diferencial, pois permite a identificação de fermentação de lactose. Nesse modelo, as bactérias 
fermentadoras da lactose promovem a acidificação do meio alterando sua cor e deixando-o com 
uma cor amarela.
• Ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar Hektoen entérico (HE) são considerados meios seletivos 
e recomendados para isolamento de diferentes espécies de Salmonella spp., Shigella spp. e 
eventualmente de Vibrio spp., e podem ser utilizados um em substituição ao outro, apesar de a 
qualidade do ágar HE ser considerada superior.
76
Unidade I
• Os caldos como tetrationato e o selenito são considerados meios de enriquecimento e devem 
ser utilizados a fim de promover o crescimento e um perfeito isolamento de microrganismos 
patogênicos, os quais podem estar em pequenas contagens na amostra biológica. Interessante 
ressaltar que, ao se inocular amostra de fezes em caldo tetrationato, é recomendado que se 
adicione ao meio de 3 a 5 gotas de solução de iodo, homogeneizando-o bem, com o objetivo 
de inibir o crescimento de cocos Gram-positivos provenientes da microbiota da pele, os quais 
podem vir a dificultar o isolamento de bactérias patogênicas associadas ao quadro de infecção. 
Meios como AS Campy e ou Karmali devem ser utilizados sempre que há suspeita de infecção por 
Campylobacter spp. Nesse caso, deve-se aguardar uma solicitação específica para tal procedimento. 
Para o isolamento e identificação de enterobactérias enteropatogênicas, deve-se semear a 
suspensão de fezes simultaneamente em dois sistemas compreendidos por um caldo, o qual pode 
ser tetrationato acrescido de iodo e/ou selenito e em placas contendo ágar seletivo McConkey 
(mais recomendado) e/ou Salmonella-Shigella (SS). 
O fluxograma a seguir ilustra a sequência sugerida para a realização doprocedimento, no qual 
se acrescenta somente por solicitação médica o procedimento também ilustrado para isolamento de 
Campylobacter spp. O fluxograma para coprocultura, desde a escolha dos meios, tempos e critérios 
de diagnóstico também podem ser compreendidos observando o fluxograma apresentado a seguir
Coloração com fucsina de Ziehl 
(0,1%) e provas bioquímicas
48-72 h 
(42 °C em microaerofilia - usar jarra)
Ágar AS Campy ou Karmali 
( sob solicitação específica)
18-24h (35 ± 1 °C) 
sorotipagem por 
técnica de aglutinação **
Transferência de colônias 
suspeitas e identificação ao nivel de 
espécie por provas bioquímicas *
Caracterização 
macroscópica de colônias
Ágar HE ou SS
18-24 h (35 ± 1 °C)
Caldo tetrationato + iodo ou caldo 
selenito 12-18 h (35 ± 1 °C)
Suspensão de fezes ou se fezes 
líquidas semeadas diretamente 
18-24 h (35 ± 1 °C)
sorotipagem por 
técnica de aglutinação **
Transferência de colônias 
suspeitas e identificação ao nível de 
espécie por provas bioquímicas *
Caracterização 
macroscópica de colônias
Ágar MC ou SS
18-24 h (35 ± 1 °C)
*Meios e/ou kits comerciais (Rugai; EPM-Mili) disponíveis 
** Técnica recomendada quando do isolamento de Escherichia coli; Salmonella spp., Shigella spp.
Figura 45 – Fluxograma de identificação de enterobactérias enteropatogênicas 
77
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Para se reportar o resultado de uma coprocultura, é importante se atentar que muitas vezes não é 
possível, em função da diversidade de microrganismos, isolar e identificar todos os prováveis patógenos 
presentes em uma amostra, por isso a importância de se relatarem todos os agentes que puderam ser 
pesquisados, independentemente do resultado encontrado. Deve-se, para tal pesquisa ser feita, levar em 
consideração os agentes etiológicos mais comumente isolados na população, devendo ser pesquisados 
agentes de exposição rara somente quando de situações de surtos e/ou epidemias.
4.3 Hemocultura
A Hemocultura é utilizada para demonstrar a presença de baterias na corrente circulatória. O 
isolamento e identificação rápida de gentes etiológicos de septicemias são procedimentos da maior 
importância na microbiologia clínica.
O termo bacteremia representa a presença de microrganismos viáveis disseminando-se pela corrente 
sanguínea, o que invariavelmente é indício de grande gravidade, pois associa-se essa disseminação com 
um alta taxa de morbimortalidade, tornando hemocultura um exame fundamental para a elucidação e 
controle desses casos.
Grande parte das infecções sépticas tem origem no ambiente hospitalar, o que as torna substancialmente 
mais graves em razão das características em termos de resistência que os microrganismos apresentam. 
A hemocultura, nesse contexto, é extremamente importante, pois, além de nortear a antibioticoterapia, 
será de fundamental importância para limitar a infecção, inclusive para o ambiente hospitalar.
As bacteremias, em linhas gerais, podem ser classificadas em primárias ou secundárias. Quando 
a infecção ocorre a partir do próprio sistema circulatório ou pela entrada através de instrumentos e 
ou fômites como agulhas, cateteres e sondas. A bacteremia secundária ocorre como disseminação a 
partir de outros sítios para a corrente circulatória. Elas ainda podem ser classificadas como transitórias, 
intermitentes, contínuas ou de escape.
São consideradas bacteremias transitórias aquelas que ocorrem de maneira rápida, com duração 
variando entre alguns minutos a poucas horas, comumente associada a feridas como abcessos, 
furunculoses etc. Quando a bacteremia ocorre em intervalos variáveis de tempo, mas por um mesmo 
microrganismo, denominamos o quadro de bacteremia intermitente, normalmente tal situação ocorre 
associada à formação de abcessos intra-abdominais, tais como hepáticos, pélvicos e prostáticos. 
A bacteremia descrita como contínua ocorre comumente associada à endocardite infecciosa e a outras 
complicações vasculares, já a bacteremia de escape ocorre em pacientes que estejam fazendo uso de 
antibioticoterapia em estágio inicial de tratamento, em que pode haver uma menor concentração 
do antibiótico na circulação sanguínea.
São inúmeros os microrganismos causadores de septicemias. Entre os Gram-positivos, geralmente 
destacam-se Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negativa, Enterococcus spp., 
Streptococcus spp.; entre os Gram-negativos, aqueles pertencentes à família Enterobacteriaceae, e os 
bacilos Gram-negativos não fermentadores, como a Pseudomonas aeruginosa, e não deixando de citar 
fungos, como Candida spp., de maneira particular Candida albicans. Apesar da grande variedade de 
78
Unidade I
microrganismos, é comum que as infecções ocorram predominantemente por um único microrganismo, 
apesar de já terem sido relatadas infecções polimicrobianas.
Uma sepse bacteriana ou fúngica certamente remete a uma falha na capacidade de defesa 
do organismo do hospedeiro no sentido de localizar, neutralizar e eliminar a infecção em seu 
sítio inicial. Importante entender que uma sepse pode ocorrer por inúmeros fatores que não se 
tratam exclusivamente da possível falha da resposta imune. Nesse sentido, doenças de base, como 
neoplasias, diabetes mellitus e insuficiência renal, idade, uso de medicamento, sobretudo do grupo 
dos cortiço-esteroides, procedimentos médicos, como cateterismo, pacientes queimados e/ou com 
infecções do trato geniturinário são fatores que podem contribuir ou influenciar o surgimento 
de uma sepse.
Do ponto de vista ideal, a coleta deve ser feita antes de a antibioticoterapia ter sido iniciada, em 
pacientes que apresentem quadro clínico por sinais e sintomas compreendidos por febre maior que 38 °C 
ou hipotermia menor que 36 °C, leucocitose maior que 10.000/mm3 ou granulocitopenia absoluta 
menor que 1.000 leucócitos/mm3; em crianças pequenas com quadro de apatia no estado geral sem 
explicação e em idosos, principalmente acompanhados de mal-estar, mialgia ou sinais.
Quanto a pacientes já internados e sob uso de antibioticoterapia e que apresentem sinais de infecção 
sistêmica, proceder com a coleta de hemocultura. Preferencialmente, colhendo o material antes do 
início de um novo esquema de dose.
Para melhor entendimento do processo de coleta, entende-se que uma amostra de hemocultura 
corresponde à coleta por uma única punção de dois frascos de sangue para adultos e um frasco para 
crianças (até 13 kg). O número mínimo não deve ser inferior a 2, e o máximo, de 4 amostras. Esse limite 
é justificado em razão da necessidade de se confirmar um resultado, seja ele positivo ou negativo e, para 
tal, a análise de uma única amostra poderia deixar dúvidas.
Objetivamente as amostras são coletadas por punção venosa, preferencialmente assim que a 
temperatura do paciente começa se elevar, no entanto, vale a ressalva que não se recomenda a coleta 
durante o pico febril, e o uso de antitérmicos não irá interferir no resultado da hemocultura. A amostra 
deve ser colhida de diferentes pontos ou sítios anatômicos em intervalos de 30 minutos cada.
Tradicionalmente, não se utilizam amostras de sangue obtidas de dispositivos como cateteres, a não 
ser que o objetivo seja avaliar o dispositivo em si. Nesse caso, recomenda-se que, além dessa amostra, 
sejam colhidas outras duas por punção venosa de sítios anatômicos distintos.
Outra variável importante a ser considerada no procedimento é o volume de amostra a ser colhido. 
Sabe-se que, quanto maior o volume, maiores serão as chances de positividade, no entanto, deve-se 
observar a idade e as condições gerais do paciente para não incorrer em um prejuízo maior que os 
benefícios alcançados com o procedimento. Nesse sentido, recomenda-se que, para crianças com até 
13 kg, deve-se colher de 1 a 4 ml em frasco para cultura de aeróbios (excetuando-se em lactentes com 
baixo peso e/ou dificuldade para colhimento, cujo valor a ser colhido pode ser entre 0,5 e 1 ml); em 
crianças com peso entre 13-36 kg, deve-se colher por amostra dois frascoscontendo 5 ml cada, sendo 
79
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
um para cultura de aeróbios e outro para anaeróbios, completando um volume total de 10 ml. Em 
crianças e/ou adultos com peso acima de 36 kg, colhe-se de 5-10 ml em dois frascos, para cultura de 
bactérias aeróbias e anaeróbias totalizando um volume máximo por amostra de 20 ml.
Como já descrito, são inúmeras as situações que podem demandar a realização de uma hemocultura. 
A seguir, recomendações para número de amostras coletadas em razão do quadro clínico apresentado:
• Bacteremia/fungemia primária e/ou secundária:
—― Colher de 2 a 3 amostras consecutivas e de sítios distintos.
• Quadro febril indeterminado:
— Colher de 2 a 3 amostras consecutivas e de dítios distintos.
— Se resultados negativos em até 48 h, colher mais 2 amostras.
• Suspeita de sepse com hemoculturas negativas:
— Investigar possível infecção por micobactérias, fungos e outros microrganismos fastidiosos 
(ex.: Legionella spp.).
Para um procedimento de coleta adequado, a antissepsia é considerada um fator crítico em virtude 
de uma possível contaminação da amostra, caso ela não seja eficientemente executada. Para a realização 
do procedimento, o braço do paciente deve estar devidamente garroteado, e quanto à veia selecionada, 
dar preferência pelas de maior calibre e mais superficiais. Fazer a antissepsia com algodão ou gaze 
embebida em álcool 70%, aplicar uma solução de clorexidina alcoólica a 0,5% ou solução à base de iodo. 
Nesse caso, após a punção, remover o excesso com álcool 70%, a fim de evitar reações alérgicas tardias. 
Promover a limpeza com movimentos circulares e centrífugos, ou seja, do centro para a periferia, a partir 
do local elegido para a punção. Importante deixar separado todos os frascos que serão utilizados, já 
devidamente etiquetados e identificados para evitar intercorrências durante o procedimento.
Os frascos colhidos podem ser mantidos a temperatura ambiente por até 12 horas após o procedimento 
de coleta, prazo máximo para que essa amostra possa ser processada com eficiência, ressaltando-se que 
o resultado do teste depende, em boa parte, da coleta e envio eficiente do material ao laboratório. 
4.3.1 Procedimento
As metodologias para o processamento das amostras vão desde métodos convencionais, 
ditos manuais, a metodologias semiautomatizadas e automatizadas. Apesar de pouco indicadas 
atualmente, as metodologias manuais ainda são muito utilizadas, e os laboratórios de pequeno ou 
médio porte que, em sua maioria, ainda as utilizam, buscaram uma forma de tornar o procedimento 
mais eficiente utilizando-se de meios de culturas comerciais tanto para microrganismos aeróbios 
como anaeróbios, como o caldo meio líquido de infusão cérebro-coração (BHI) ou caldo caseína 
80
Unidade I
digerida de soja (TSB). Ambos podem ser utilizados para pesquisa de aeróbios e caldo columbia 
para anaeróbios e fastidiosos.
O sistema Hemobac Trifásico (ProbacR) é a metodologia semiautomatizada mais utilizada. É um 
laminocultivo contendo duas fases. Na parte inferior, um recipiente plástico contendo caldo suplementado 
com extrato de levedura (caldo de enriquecimento) é acoplado à parte superior que contém as faces 
do laminocultivo, o qual é composto de ágar chocolate, ágar Sabouraud (leveduras) e ágar McConkey. 
Os frascos são incubados em estufa própria, que possibilita sua inversão periódica, procedimento 
importante para a evolução do isolamento. A bacterioscopia e o antibiograma são realizados a partir 
das colônias isoladas.
Sem dúvidas, os métodos automatizados trouxeram um grande avanço e uma melhoria considerável 
dos procedimentos em hemocultura. Tais procedimentos permitem um contínuo monitoramento, 
uma maior sensibilidade, compreendida pelo aumento na positividade da amostra, menor risco de 
contaminação, interfaceamento dos resultados entre as unidades laboratoriais envolvidas, rapidez na 
liberação do resultados negativos e positividade muitas vezes em até 48 horas do início do procedimento, 
menor necessidade de repetição da amostra ou repique do material. Nesse sentido, existem, atualmente, 
diversos equipamentos e representantes que atendem a essa demanda, tal como Bactec modelos FX, 
série 9000 (9050, 9120,9240) ou MGIT (becton dickinson diagnostic instrument systems) e BacT/ALERT 
3D 60/120/240 (BioMerieux), todos tendo como princípio os métodos de detecção estabelecidos por 
fluorescência ou colorimetria.
Os meios comerciais não requerem uso de amostras padrão ou de controle de qualidade, no entanto, 
é importante que o fabricante envie a certificação dos testes de qualidade realizados juntamente como 
os meios e sistemas de cultura.
A coloração de Gram deve ser considerada, dentro do contexto das hemoculturas, uma informação 
descritiva de máxima relevância em razão das características morfotintoriais que essa coloração possibilita 
relatar. Para pacientes acometidos por infecções sistêmicas, tal informação é de extrema relevância, 
pois permite ao clínico o escalonamento de antimicrobianos em um processo que denominado 
de antibioticoterapia primária, e o resultado da cultura a posteriori, pode indicar a manutenção da 
antibioticoterapia iniciada ou seu reescalonamento e início de uma antibioticoterapia direcionada para 
o resultado da cultura.
Diante disso, se houver crescimento de microrganismos após qualquer período de incubação, emitir 
resultado parcial com base na bacterioscopia, prosseguir para a identificação do microrganismo em 
termos de gênero e espécie e fornecer o antibiograma. Se o resultado for negativo, ele deve ser emitido 
informando por escrito a negatividade após as horas decorridas desde a incubação.
Alternativamente, quando de amostras persistentemente negativas, deve-se avaliar as suspeitas 
clínicas e recomendar a pesquisa de fungos e/ou de agentes fastidiosos como Legionella spp., Brucella spp., 
Haemophilus spp., Kingella spp., Bordetella spp., entre outras.
81
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
A seguir, apresenta-se um fluxograma proposto para a análise e processamento de material 
para hemocultura.
Desprezar frasco Se suspeitar de fungo incubar 30 °C (±10 dias)
Manter frascos em estufa 
35 ± 1 °C (jarra de CO2 
até completar 7 dias)
Manter frascos em estufa 
35 ± 1 °C - até completar 48h
Negativo
Negativo
Negativo
Emitir resultado parcial
Emitir resultado parcial
Emitir resultado parcial
Semear em ágar sangue 
e bacterioscopia
Semear em ágar sangue e 
bacterioscopia
Incubar 35 ± 1 °C - 24 h
Frasco de hemocultura
Identificação em termos de 
espécie e antibiograma
Identificação em termos de 
espécie e antibiograma
Identificação em termos de 
espécie e antibiograma
Positivo
Positivo
Positivo
Semear em ágar 
chocolate
Figura 46 – Fluxograma para hemoculturas (resultados preliminares devem ser emitidos a cada 24 horas) 
 Saiba mais
A maioria dos episódios sépticos tem origem hospitalar e, com certa 
frequência, envolvem microrganismos que apresentam grande resistência 
aos antimicrobianos, estando associados a taxas de mortalidade com 
tendência a serem superiores às dos episódios que ocorrem na comunidade. 
Nesse contexto, o laboratório clínico tem um papel extremamente 
importante no manejo de pacientes com bacteremia. Para saber mais sobre 
hemocultura, leia:
ARAÚJO, M. Hemocultura: recomendações de coleta, processamento e 
interpretação dos resultados. Journal of Infection Control, v.1, n 1, 2012. 
Disponível em: https://bit.ly/3ha1WEZ. Acesso em: 1º jul. 2021.
82
Unidade I
4.4 Culturas de secreções e feridas
4.4.1 Cultura de secreção prostática, vaginal, cervical e uretral
Inúmeros fatores podem ser associados ao incremento das infecções genitais em nossa população, os 
fatores associam-se tanto às características intrínsecas dos microrganismos mais fortemente associados 
a esses processos como também às características socioeconômicas, culturais e comportamentais 
do hospedeiro.
Do ponto de vista microbiano, sabe-se que a resistência cada vezmais acentuada aos antibióticos, 
bem como a sua variação antigênica, contribuem fortemente para o aumento do número de infecções. 
Em relação ao hospedeiro, percebe-se que o aumento do número de parceiros sexuais aumenta as 
chances de se contrair doenças como sífilis e gonorreia em uma proporção que chega a ser vinte vezes 
maior em homens que apresentam mais de quatro parceiras sexuais em comparação com aqueles com 
apenas uma parceira.
Os tratos genitais masculinos e femininos podem abrigar diferentes grupos microbianos, os quais 
podem, invariavelmente, ser associados a inúmeros quadros de infecção, os quais podem variar de 
quadros de vaginite/vaginose a situações como epididimite e prostatite. 
Os agentes microbianos mais importantes, por sua alta incidência e pela variedade de processos aos 
quais podem estar associados, são: Neisseria gonorrhoeae associada a infecções como cervicite, uretrite 
e epididimite; Chlamydia trachomatis associada a quadros com doença inflamatória pélvica, bartolinite; 
algumas enterobactérias, estafilococos e estreptococos associados a quadros de prostatite, entre outros.
Muitas dessas infecções podem ser consideradas sexualmente transmissíveis, o que as torna de 
extrema relevância para saúde pública. Pode-se citar, como exemplo, o cancro mole, infecção causada 
pelo Haemophilus ducreyi, uma bactéria fastidiosa capaz de provocar a formação de lesões ulcerativas 
profundas , sensíveis e bastante dolorosas; Treponema pallidum, causadora da sífilis, uma doença de 
extrema relevância por apresentar três fases distintas, reconhecidas como sífilis primária, secundária e 
terciária, que pode acometer o sistema nervoso central (SNC) levando ao óbito e, em gestantes, chega 
ao ponto de prejudicar a formação fetal ou provocar abortos; o Streptococcus agalactiae, também 
conhecido como estreptococo beta-hemolítico do grupo B de Lancefield, encontrado em cerca de 50% 
das mulheres sexualmente ativas e em 10-40% das gestantes, constitui a principal causa de septicemia 
neonatal. Todos esses configuram como agentes de doenças que merecem ser melhor compreendidas, 
estudadas e avaliadas.
As infecções do trato genital podem não permanecer restritas a ele e acabar por evoluir para 
situações mais graves, causando complicações cardíacas, como endocardites, osteoarticulares, como no 
caso de artrites, renais, como pielonefrites, cistites, e até mesmo do SNC, como meningites e encefalites.
Em razão da diversidade de materiais, inúmeros são os procedimentos que podem ser realizados. 
Os mais comuns são os provenientes de secreção vaginal, cervical, uretral e prostática. De maneira geral, 
83
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
o material clínico é coletado por meio de swabs (vaginal, cervical, endocervical e uretral) ou por exame 
de urina ou de massagem prostática (método de Meares e Stamey) nas suspeitas de prostatite.
Na maioria dos materiais coletados, o procedimento inicial é o exame direto ou bacterioscopia pela 
coloração de Gram. O esfregaço deve ser preparado rolando-se o swab sob a lâmina ou gotejando o 
material clínico colhido sobre a lâmina.
No caso de secreção vaginal e/ou cervical, deve-se, após a inserção do especulo, retirar o excesso 
de muco presente na região cervical com um swab de algodão, inseri-lo pelo canal vaginal colhendo a 
amostra do fundo de saco e da parede vaginal. Além da amostra para cultura, colher uma amostra em 
solução fisiológica estéril para a eventual pesquisa sob solicitação de Trichomonas vaginalis e leveduras. 
Para a pesquisa de Streptococcus agalactiae, recomenda-se a coleta de amostra vaginal e anorretal 
concomitantemente.
No exame microscópico de secreções vaginais, de uma maneira geral, deve-se observar a presença de 
microrganismos, descrevendo suas características morfotintoriais, presença de piócitos, se numerosos e/ou 
raros, presença ou ausência de muco, presença ou ausência de células epiteliais e/ou de descamação.
No caso de secreção uretral, deve-se sempre iniciar o processo retirando-se o excesso de material 
secretivo eventualmente presente no meato uretral, introduzir o swab uretral (2-4 cm) no lúmen uretral 
rotativamente e, depois, colocá-lo em meio de transporte (Stuart).
Deve-se, da mesma forma como na secreção vaginal, proceder com uma amostra para bacterioscopia e 
uma amostra em solução fisiológica estéril para a pesquisa de fungos e protozoários, como o Trichomonas.
A coleta de secreção prostática deve ser realizada implementando-se em conjunto a técnica de 
Meares e Stamey, a qual é reconhecidamente útil no diagnóstico dos casos de prostatite crônica e 
de infecções do trato urinário de repetição.
Nessa técnica, colhem-se duas amostras de urina conhecidas como amostra de primeiro e segundo 
jato, interrompe-se a micção, procede-se com a massagem prostática e colhe-se na sequência uma 
amostra de secreção prostática e uma amostra de urina pós-massagem, denominada de urina primeiro 
jato (pós-massagem prostática).
O resultado da coloração de Gram deve ser sempre considerado quando da avaliação das culturas 
realizadas, independentemente da solicitação do clínico. A análise bacterioscópica fornece informações 
substanciais no processo de identificação dos agentes associados aos processos patogênicos, revelando 
informações muitas vezes bastante próprias de cada grupo bacteriano envolvido, como forma, cor, 
aspecto, entre outros. A título de exemplificação, pode-se citar as características típicas de N. gonorrhoeae, 
as quais se revelam em ágar chocolate como colônias pequenas, brilhantes e convexas.
84
Unidade I
Importante, sempre que possível, que se possa estabelecer o número e tipos de elementos 
encontrados nas amostras analisadas com os microrganismos isolados em cultura, como a presença de 
clue-cells, nome fornecido às células de característica escamosa nas quais nota-se uma grande presença 
de cocobacilos aderidos, típica de infecção por Gardnerella vaginalis. 
Outro exemplo típico é a associação que se estabelece entre a presença de numerosos leucócitos na 
amostra com a infecção por Trichomonas vaginalis.
Nos casos de secreção vaginal e cervical, os processos melhor esclarecidos, do ponto de vista etiológico, 
são aqueles causados por Candida albicans e Trichomonas vaginalis, entretanto, atualmente, tem-se 
verificado elevada frequência de infecção por G. vaginalis, normalmente em associação com bactérias 
anaeróbias. Outras espécies bacterianas, particularmente os membros da família Enterobacteriaceae, 
raramente são consideradas patógenos causadores de vaginites e/ou vaginoses. Para a bacterioscopia, 
preparar o esfregaço como o material colhido, deixar secar em temperatura ambiente e fixar sob a ação 
da chama do bico de Bunsen, corar pela técnica de Gram.
Relatar a presença de piócitos (se raros, frequentes ou numerosos), presença de bacilos de Doderlein 
típicos da microbiota vaginal normal, presença de leveduras em brotamento ou na formação de 
pseudo-hifas, a qual é indicador de infecção por Candida albicans. Verificar a presença de clue-cells 
típicas de infecção por G. vaginalis e por Trichomonas vaginalis facilmente visualizadas pela 
coloração de Gram.
Para a pesquisa de G. vaginalis, colher 3 swabs e avaliar o pH vaginal com fita reativa. Com o primeiro 
swab, preparar lâmina para bacterioscopia corando o esfregaço pela coloração de Gram, em que se 
irá avaliar a presença de clue-cells. Com o segundo swab, fazer o teste do odor, imergindo-o em 
um tubo contendo KOH a 10%, verificar a liberação de odor fétido. Com o terceiro swab, semear 
em ágar sangue em anaerobiose por período entre 24-48 horas e, se crescimento positivo, partir 
para as provas de identificação confirmatórias. Se resultados negativos para Gardnerella vaginalis, 
investigar outros possíveis patógenos. Tais como Haemophilus ducreyi se houver presença de lesão, 
N. gonorrhoeae, Estreptococos do grupo B de Lancefield e Candida spp.
Para a pesquisa de candidíase vaginal, sobretudo em situações de vulvovaginites,tipicamente 
caracterizadas por irritação, prurido intenso e corrimento vaginal, recomenda-se a bacterioscopia por 
coloração de Gram, em que se revelará a presença de células leveduriformes, Gram-positivas com 
formação de pseudo-hifas. Deve-se proceder o cultivo semeando a amostra em ágar Sabouraud 
a 36 ± 1 °C durante 24-48 horas. Após esse período, se a cultura for positiva, se notará a presença 
de colônias grandes, brancas, de aspecto mucoide, as quais, para confirmação em nível de espécie, 
exigem-se provas bioquímicas específicas. A figura seguinte apresenta um fluxograma sugerido para 
processamento, análise e interpretação de cultura e bacterioscopia de secreção vaginal/cervical. 
As figuras 57 e 58 apresentam, respectivamente, um fluxograma para processamento de amostra de 
secreção uretral e de amostra de urina e um fluxograma para processamento de amostra de secreção 
prostática e de amostra de esperma obtida por manipulação direta.
85
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Secreção vaginal e cervical
1° swab 
bacterioscopia clue-cells/ 
Trichomonas /elementos 
celulares
Colher 3 swabs
2° swab
teste do “odor” em 
solução de KOH
Positivo para G. vaginalis se 
odor fétido (peixe) 
3° swab 
Semear ágar sangue 
Thayer-Martin e TOOD-VA
24-48 h / 36 ± 1 °C
identificação em 
nível de espécie
Figura 47 – Fluxograma para processamento, análise e interpretação 
 de cultura e bacterioscopia de secreção vaginal/cervical
Semeadura com alça 
calibrada de 0,01 mL em 
AS/TM 24 - 48 h 35 ± 1°C
Identificação em 
nível de espécie
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
(exame direto)
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
Amostra obtida por manipulação 
direta (esperma) massagem prostática 
ou técnica de Meares e Stamey 
Figura 48 – Fluxograma para processamento de amostra 
de secreção uretral e de amostra de urina
Semeadura com alça 
calibrada de 0,01 ml em 
AS/TM 24 - 48 h 35 ± 1 °C
Identificação em 
nível de espécie
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
(exame direto)
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
Amostra obtida por manipulação 
direta (esperma) massagem prostática 
ou técnica de Meares e Stamey 
Figura 49 – Fluxograma para processamento de amostra de secreção 
prostática e de amostra de esperma obtida por manipulação direta
4.4.2 Cultura de secreções de oro e nasofaringe
A maioria das infecções de orofaringe são de origem virótica, variando entre 5 e 10% em pacientes 
adultos e de 15 a 20% em crianças, em casos associados a bactérias. Tipicamente, as infecções 
bacterianas apresentam-se com características bastantes secretivas de coloração amarelo-acinzentadas 
sob o palato, tonsilas e faringe.
São inúmeros os agentes bacterianos associados, entre os quais destacam-se Streptococcus 
pyogenes, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus 
86
Unidade I
influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae e, entre os fungos, destaque especial para 
Candida albicans.
Tais microrganismos frequentemente estão associados a quadros de infecção, como faringite, 
tonsilite, sinusites, entre outras. Para a coleta de secreção orofaríngea, recomenda-se a utilização de 
abaixadores de língua e o uso de swab, o qual deve ser “rolado” por sobre as tonsilas e faringe posterior, 
de maneira especial sobre as áreas edemaciadas e hiperemiadas quando de sua existência. Amostras de swabs 
nasais ou de nasofaringe devem ser obtidas introduzindo o swab nas narinas e fazendo movimentos 
rotatórios por aproximadamente 15 segundos restrito às narinas ou introduzindo até a nasofaringe, 
respectivamente.
Na análise de secreção de oro e nasofaringe, a bacterioscopia tem pouco valor diagnóstico em 
virtude da intensa microbiota oral, no entanto, esse exame pode sugerir infecção por Fusobacterium spp., 
normalmente associado à angina de Vincent, uma gengivite ulcerativa necrosante aguda (Guna), a 
qual normalmente não envolve o acometimento de outros tecidos da área periodontal, caso ocorra tal 
envolvimento, a doença passa a ser conhecida como periodontite ulcerativa necrosante.
Semeadura AS/CHOC
24 - 48 h 35 ± 1 °C
jarra de anaerobiose
Coleta da amostra com swab 
Identificação em 
nível de espécie
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
(exame direto)
Angina de Vincent (Guna)
Numerosos leucócitos 
PMNs espiroquetas e/ou 
bacilos fusiformes
Figura 50 – Fluxograma para processamento de amostra de secreção de oro e nasofaringe 
4.4.3 Cultura de escarro
Exsudatos brônquicos e pulmonares são estudados quase sempre por meio de exame de escarro. 
Há inúmeras dificuldades na execução desses exames, em virtude da contaminação, quase sempre 
inevitável, por microrganismos pertencentes à microbiota oral e salivar. A presença de numerosas células 
de descamação sugere a contaminação por saliva.
A amostra de escarro normalmente é solicitada quando da suspeita de pneumonias bacterianas, as 
quais têm como agentes etiológicos mais comuns o Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, 
Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, entre outros.
Nos casos suspeitos de tuberculose e nas infecções fúngicas causadoras de infecções pulmonares, 
como histoplasmose, paracoccidioidomicose e aspergilose, por exemplo, deve-se sempre proceder à 
coloração de Ziehl-Neelsen e exame a fresco para pesquisa de fungos. 
87
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Identificação em 
nível de espécie
Bacterioscopia por 
técnica de Gram 
Bacilos alongados tortuosos 
(indicativo de infecção por 
M. tuberculosis)
Confirmação por cultura em 
meio de Lowestein-Jensen 
(lab. de referência)
Semeadura AS/CHOC e MC
24-48 h 35 ± 1 °C
jarra de anaerobiose
Coleta escarro
 (esforço de tosse)
Bacterioscopia / Vaciloscopia por 
técnica de Ziehl-Neelsen e pesquisa 
de fungos (exame direto)
Positivo para 
presença de fungos 
Cultura em meio de ágar 
Sabouraud - identificação 
em termos de espécie
Figura 51 – Fluxograma para identificação de patógenos em amostras de escarro
4.4.4 Cultura de aspirado traqueal, lavado bronco alveolar (BAL) e escovado brônquico
Para a cultura de aspirado traqueal, deve-se utilizar a técnica da diluição seriada e é altamente 
recomendada a utilização de agentes mucolíticos a fim de facilitar o resgate de patógenos presentes na 
amostra. Entre os agentes mucolíticos mais utilizados, destaca-se a N-acetil-L-cisteína a 1%, utilizada 
antes de se proceder com as diluições recomendadas.
Amostras de lavado broncoalveolar, bem como de escovado brônquico, podem ser processadas 
utilizando da mesma metodologia para a cultura de aspirado, variando apenas em termos de quantidade 
de amostra e da diluição empregada.
Na bacterioscopia, a microbiota presente nesse material costuma reproduzir exatamente o processo 
infeccioso das vias respiratórias inferiores, como descrito anteriormente para a cultura de escarro. A 
bacterioscopia e/ou baciloscopia devem ser feitas seguindo os mesmos critérios e cuidados.
O aspirado traqueal normalmente é obtido de pacientes internos em unidade hospitalar, muitas 
vezes de unidades de terapia intensiva e sob uso contínuo de aparelhos artificiais de respiração. Para se 
colher o material, deve-se aspirar o conteúdo com instrumental adequado, e a amostra, ser preservada 
em tubo estéril.
Em razão da diversidade de microrganismos que podem estar presentes na microbiota oral, o 
resultado da cultura de aspirado, BAL e ou escovado, obrigatoriamente, passa pela necessidade de ser 
quantificado. Para tal, deve-se levar em consideração a quantidade de placas semeadas e multiplicar-se 
o número de microrganismos contados (colônias) pelo fator da diluição. No caso de amostras de BAL 
e/ou escovado, nas placas semeadas a partir da diluição 1:1.000, uma colônia bacteriana equivale a 
103 UFC/ml; em placas semeadas com alça calibrada de 0,01 ml ou de 0,001 ml, respectivamente, uma 
colônia equivale a 100 ou 102 UFC/ml ou uma colônia equivalea 1.000 ou 103 UFC/ml. No caso de 
aspirado traqueal, sendo o material semeado com alça calibrada de 0,001 ml, uma colônia equivale a 
20.000 bactérias ou 2x104 UFC/ml.
88
Unidade I
Se os valores encontrados forem iguais ou superiores aos citados, obrigatoriamente deve-se 
proceder com a identificação em nível de espécie e com o antibiograma para início da terapia 
antibacteriana específica.
Diluir 1: 2 com agente 
mucolítico (se aspirado)
Confirmação por cultura em 
meio de Lowestein-Jensen 
(lab. de referência)
Bacilos alongados tortuosos 
(indicativo de infecção 
por M. tuberculosis)
Coleta do aspirado, 
BAL ou escovado
Bacterioscopia / Baciloscopia por 
Técnica de Ziehl-Neelsen e 
pesquisa de fungos (exame direto)
Cultura em meio de ágar 
Sabouraud - identificação em 
termos de espécie
Positivo para 
presença de fungos 
Semear 0,01 mL em AS/ CHOC e 
MC 35 ± 1 °C 24-48 h 
(jarra de anaerobiose)
Bacterioscopia e identificação 
em nível de espécie
Diluir 0,1 mL em 9,9 ml de 
solução fisiológia estéril ( **)
** Para amostras de BAL ou de escovado, diluir 0,1 ml de amostra em 0,9 ml de solução fisiológica estéril 
(1:10), semear dessa diluição, 0,01 ml nas placas recomendadas. 
Figura 52 – Fluxograma para processamento de amostra de aspirado, BAL e escovado brônquico
4.4.5 Cultura de secreção ocular e de ouvido
O material supurativo do olho infectado deve ser colhido do fundo do saco inferior ou do canto 
interno. Associa-se tal solicitação com a suspeita de infecções oculares, como as conjuntivites, cujos 
agentes bacterianos mais comuns são o Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus 
spp., Pseudomonas spp., Neisseria gonorrhoeae, sobretudo em recém-nascidos, e Chlamydia trachomatis.
Para diagnóstico de infecção por Chlamydia trachomatis, é altamente recomendável que se faça o 
raspado da conjuntiva e a amostra seja submetida ao teste de imunofluorescência direta ou à pesquisa 
de inclusões citoplasmáticas com a utilização de solução de lugol ou de solução contendo 5% de iodo 
e 10 % de iodeto de potássio.
As culturas de material do canal auditivo externo geralmente não refletem a causa bacteriana de 
uma otite média, a menos que tenha ocorrido ruptura da membrana timpânica. Os principais agentes 
associados à infecção são Streptococcus pyogenes e Haemophilus spp. 
As amostras devem ser semeadas em AS, CHOC e caldoTHIO (tioglicolato) e mantidas a 35 ± 1 °C em 
jarra de anaerobiose por 24 horas, período após o qual, se as placas forem positivas, as colônias deverão 
ser identificadas e deverá se realizar o antibiograma. Se negativas, as placas devem ser reincubadas 
e acompanhadas por mais 48 horas, sendo avaliadas a cada 24 horas. O caldo tioglicolato deve ser 
utilizado quando nas primeiras 24 horas de incubação não houver crescimento em placas. Nesse caso, 
89
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
semeia-se a partir do caldo e, se positivo, procede-se com a identificação e antibiograma. Se negativo, 
aguardam-se as mesmas 48 horas para finalizar o procedimento e reportar o resultado como negativo.
4.5 Cultura de ponta de catéter
Os catéteres venosos centrais de longa duração ou permanência são utilizados quando da necessidade 
contínua e, portanto, prolongada de acesso ao sistema vascular, isto é, prática comum em pacientes 
que clinicamente necessitem desse dispositivo para hemodiálise, hemoterapia, quimioterapia e nutrição 
parenteral prolongada. Tais dispositivos podem ser produzidos em material de silicone ou poliuretano.
Pacientes imunossuprimidos, como no caso daqueles em tratamento quimioterápico, apresentam 
um aumento significativo de infecções associadas ao uso do dispositivo, o que acaba por favorecer uma 
elevação dos níveis de morbimortalidade com riscos e agravos adicionais.
A infecção é a complicação mais importante associada ao uso de catéteres. Epidemiologicamente a 
infecção ocorre em cerca de 19% dos pacientes em uso desse dispositivo, dessas, 7% são caracterizadas 
como infecções locais, e, em 12%, são responsáveis por quadros de bacteremia associada ao catéter.
As infecções normalmente associadas a catéter vêm acompanhadas de sinais e sintomas locais 
bastante característicos, como edema ou inchaço local, eritema, presença de material secretivo (pus), 
com ou sem a presença de febre.
A bacteremia relacionada ao catéter é confirmada pela presença de sintomas como febre e/ou 
calafrios em pacientes com catéter venoso central sem outro foco infeccioso aparente. Nesses casos, a 
conduta adequada exige que o paciente seja submetido à coleta de hemoculturas, as quais devem ser 
colhidas tanto de pontos periféricos quanto do próprio catéter. Entre as técnicas de investigação 
de catéteres existentes, destaca-se a técnica de Maki, a qual considera valores positivos quando há 
mais de 15 UFC/placa de determinado microrganismo.
As infecções do sítio de inserção dos acessos vasculares geralmente são de menor importância e 
gravidade se comparadas àquelas que ocorrem diretamente na corrente sanguínea. No entanto, tais 
infecções conduzem a duas reflexões bastante significativas: a primeira indica uma necessidade óbvia 
de intervenção preventiva e específica, a segunda utiliza tal processo infeccioso como indicador de 
qualidade da assistência/atendimento.
Entre os agentes infecciosos normalmente associados a infecções em catéteres periféricos, os 
quais invariavelmente estão fortemente associados a bacteremias, destacam-se as bactérias do gênero 
Staphylococcus spp., precisamente S. aureus e Staphylococcus coagulase negativos (SCoN), que 
por muito tempo foram consideradas unicamente contaminantes de amostras e, atualmente, estão 
fortemente associadas a bacteremias bactérias da família Enterobacteriaceae, bacilos Gram-negativos 
não fermentadores como Pseudomonas spp. e fungos como do gênero Candida spp.
Para se retirar o catéter a fim de avaliar possível sítio de infecção, os cuidados para sua retirada são 
tão importantes quanto aqueles adotados quando de sua inserção. Inicialmente, deve-se proceder com 
90
Unidade I
uma antissepsia perfeita na pele ao entorno do catéter, tal procedimento deve ser feito utilizando-se de 
solução iodada de clorexidina. Depois, retira-se o catéter, e a porção distal dele (parte que estava inserida 
na veia do paciente), é cortada com o auxílio de tesoura e pinças estéreis (o tamanho do fragmento deve 
ser de aproximadamente 5 cm). A ponta de catéter colhida é, então, colocada em tubo ou frasco seco e 
estéril (nota-se que, para tal processo, a amostra não deve ser transportada em meios de cultura e/ou 
caldos de enriquecimento, bem como meios de transporte, a fim de evitar a proliferação de possíveis 
microrganismos provenientes da microbiota da pele ou que tenham iniciado a formação de biofilmes 
sobre o material do cateter) e enviada ao laboratório, preferencialmente, em um prazo não superior a 
uma hora desde sua coleta, para que possa, assim que entregue, ser imediatamente processada.
O método mais empregado para a avaliação de infecção em ponta de cateter é conhecido como 
técnica de Maki. Nessa técnica, o fragmento de cateter (5 cm), retirado da porção distal, a qual 
encontrava-se inserida no paciente, é rolado por sobre a superfície de uma placa contendo meio de 
ágar sangue com o auxílio de uma pinça estéril. Importante lembrar que, apesar de parecer mais simples, 
deve-se evitar, a todo custo, esfregar o cateter na placa. Na sequência, a placa deve ser colocada em 
estufa por 18-24 horas a 35 ± 1 °C preferencialmente em jarra de anaerobiose. Depois desse período, as 
colônias devem ser contadas, e crescimentos iguais ou superiores a 15 UFC por placa são considerados 
positivos. Placas que não apresentarem crescimento nas primeiras 24 horas devem ser acompanhadas 
por 48-72 horas para confirmação do resultado. Em todos os casos positivos, independentemente do 
microrganismo isolado, deve-se proceder ao antibiograma.
Algumas observações são importantes na análise dos resultados:• Inicialmente, deve-se sempre reportar a contagem de microrganismos, mesmo que eles se 
apresentem em números inferiores a 15 UFC. Portanto deve-se relatar que, de acordo com a 
técnica de Maki, valores significativos são considerados acima de 15 UFC, cujo esquema foi 
representado na figura seguinte, e protocolo de cultura, representado no fluxograma a seguir.
• Estar atento a culturas aparentemente negativas, mas que podem estar contaminadas por 
microrganismos de crescimento lento. Em alguns casos, a técnica de Maki não permite o isolamento 
de tais microrganismos.
• Recomenda-se a coleta de hemocultura em paralelo com a cultura de cateter para melhor 
elucidação dos casos suspeitos de bacteremia.
Cateter
Ágar sangue
Figura 53 – Representação da técnica de Maki (a ilustração demonstra a aplicação do 
cateter na superfície da placa de ágar sangue e o processo de rolamento preconizado)
91
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Ponta de cateter
Técnica de Maki 
(35 ± 1 °C em jarra de 
anaerobiose por 18-24 h) 
Crescimento de colônias positivo Crescimento de colônias negativo(reportar negativo após 72 h)
Contagem, identificação em nível de 
espécie e antibiograma
Crescimento de colônias positivo
Contagem, identificação em nível de 
espécie e antibiograma
Crescimento de colônias negativo
Reincubar por mais 24-48 h
Figura 54 – Fluxograma para processamento de amostra de ponta de cateter 
4.6 Culturas de liquor e de líquidos especiais 
Infecções no SNC são reconhecidamente perigosas e inspiram grande preocupação, muitas delas têm 
elevadas taxas de morbimortalidade. Os processos infecciosos que atingem o SNC podem ser causadas 
por diferentes grupos etiológicos, desde bactérias a vírus, fungos e protozoários.
Os processos infecciosos podem ocorrer por meio da via hematogênica, ou seja, pela circulação 
sanguínea – normalmente a principal via de infecção –, por via direta através de situações que envolvam 
trauma direto ao SNC, como nos casos de acidentes e/ou procedimentos cirúrgicos por situações de 
contiguidade através dos espaços retroperitoneais, por exemplo, e ainda por invasão de vírus disseminados 
por nervos periféricos.
As infecções podem variar desde quadros de meningite aguda ou crônica a situações como 
encefalite, empiemas a abscessos e expõem significativamente o paciente a risco de óbito ou de sequelas 
permanentes. Como principais agentes bacterianos causadores de meningite aguda, destacam-se 
S. pneumoniae, H. influenzae e N. meningitidis. Mycobacterium tuberculosis pode ser considerada causa 
de meningite aguda e crônica assim como o Treponema pallidum (bactéria causadora da sífilis), outros 
agentes fúngicos como Cryptococcus spp., Candida spp., Histoplasma capsulatum também podem ser 
associados a processos tanto agudos quanto crônicos. Associados a quadros de encefalite destacam-se 
vírus como o Citomegalovirus (CMV), vírus do sarampo, Herpes simplex virus dos tipos 1 e 2 (HSV) 
e Enterovirus. Protozoários como Naegleria spp., Acanthamoeba sp., Toxoplasma gondii também são 
associados com certa frequência epidemiológica a quadros de encefalite.
Epidemiologicamente, algumas doenças se manifestam de maneira sazonal, ou seja, são 
influenciadas por clima, e em outras muitas vezes, influenciadas pelo fator idade e porcentagem de 
fatores de exposição. No caso das meningites ditas comunitárias, é muito comum a relação entre a 
frequência de infecção específica por faixa etária. Nesse sentido, no período neonatal, é bastante 
comum que ocorram quadros de meningite por bactérias, como S. agalactiae, Escherichia coli e Listeria 
monocytogenes. Em menores de 2 anos, nota-se o predomínio de infecções por S. pneumoniae e por 
92
Unidade I
N. meningitidis. A partir dos 2 anos de idade até início da fase adulta, ou seja, próximo dos 18 anos, 
percebe-se o aumento de casos de infecção das meninges associadas quase que exclusivamente a N. 
meningitidis e, a partir dessa idade, o predomínio absoluto da infecção é por S. pneumoniae. A infecção 
por H. influenzae reduziu significativamente após a introdução da vacinação compulsória, sendo que 
alguns estudos sugerem redução variando de 94-96%, e a infecção por Cryptococcus neoformans em 
pacientes imunodeprimidos, sobretudo aqueles infectados pelo vírus da imunodeficiência humana 
(HIV), ainda constitui uma grande preocupação.
O exame microbiológico do LCR em pacientes sob suspeita clínica de apresentarem quadros de 
meningites ou encefalites é um dos procedimentos mais urgentes dentro da rotina do laboratório 
hospitalar, em virtude da magnitude que tais processos podem alcançar se não forem diagnosticados e 
tratados rápida e eficientemente.
O LCR deve ser colhido preferencialmente por punção lombar ou de reservatório de próteses, e por 
equipe médica responsável. É uma convenção e uma necessidade que se colha três amostras em três 
tubos estéreis, sempre que possível. Tais amostras são utilizadas para uma melhor interpretação do 
quadro clínico. 
Das três amostras colhidas, uma é destinada a exames de bioquímica e de sorologia, outra à 
microbiologia e a terceira à citologia. É altamente recomendável que se colha uma amostra de sangue 
venoso concomitante com a punção lombar para que se possa avaliar os níveis glicêmicos e compará-los 
com os níveis de glicorraquia (sabe-se que infecções meníngeas de origem bacteriana comumente 
costumam causar depleção dos níveis de glicorraquia, o que normalmente não ocorre nas infecções 
virais). Outro parâmetro bastante importante é a observação da presença de infiltrado leucocitário 
e a presença de hemácias na amostra de liquor, cujo valor de referência para esses elementos é a 
ausência. Assim, sua presença indica claramente processo infeccioso/inflamatório com possibilidade de 
rompimento de barreira hematoencefálica.
4.6.1 Processamento da amostra e análise dos resultados da cultura de LCR
Uma vez enviada a amostra correspondente ao laboratório de microbiologia, a amostra de 
liquor deve ser observada. Se ela apresentar-se límpida e com volume superior a 1 ml, deve ser 
centrifugada a 3.000 r.p.m. por aproximadamente 15 minutos. Depois, separa-se sobrenadante 
de sedimento. Do sobrenadante, realiza-se prova do látex (a qual indica se positivo processo 
inflamatório agudo), e, do sedimento, realizam-se microscopia e cultura. Se a amostra de liquor 
colhida apresentar-se turva ou com volume igual ou inferior a 1 ml, proceder diretamente sem 
centrifugar a amostra.
93
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Liquor límpido volume 
superior a 1 ml
Centrifugar a amostra 
(15 min - 3.000 r.p.m.)
Sobrenadante
realizar prova do látex
Cultura AS e CHOC 35 ± 1 °C 
em anaerobiose por 24 h 
Coleta de liquor 
(tubo seco estéril)
Liquor turvo e/ou com 
volume inferior a 1 ml
Mircoscopia (Gram/Ziehl-Neelsen/
tinta da China)
Cultura AS e CHOC 35 ± 1 °C 
em anaerobiose por 24 h 
Se negativo -reincubar 
por até 72 h e fornecer 
resultados parciais 
Se negativo -reincubar por até 
72 h e fornecer resultados parciais 
Sedimento - microscopia 
(Gram/Ziehl-Neelsen e 
tinta da China)
Se positivo - identficação 
em nível de espécie e 
antibiograma
Se positivo - identficação em 
nível de espécie e antibiograma
Figura 55 – Fluxograma para processamento de amostras de LCR
A microscopia a que nos referimos é a técnica de Gram, de Ziehl-Neelsen (para bacilos álcool-ácido 
resistentes [Baar], como Mycobacterium tuberculosis) e a de tinta da China, especialmente utilizada para 
diagnóstico de infecção por C. neoformans, levedura considerada causadora oportunista de meningite, 
identificada por uma cápsula que a reveste, a qual não se cora pelo corante empregado.
É de fundamental importância que se realize a hemocultura nos casos mais graves, pois a bacteremia 
é demonstrável em até 50% dos casos de meningite pelo meningococo ou pneumococo.
4.6.2 Coleta, processamento e análise da cultura de fluidos biológicos
São considerados fluidos biológicos especiais o líquido pleural,peritoneal, ascítico, pericárdico, 
sinovial e a medula óssea. Todos, indistintamente, podem ser sítios de infecção para bactérias e outros 
agentes infecciosos. São, todos, conhecidos por serem fluidos estéreis que revestem, banham e protegem 
os órgãos e tecidos das cavidades e áreas com as quais se relacionam. Por serem áreas desprovidas de 
microbiota, a presença de qualquer número e/ou espécie de microrganismos deve ser tratada como 
patogênica e, portanto, requer imediata avaliação, tipificação e tratamento.
Para a coleta de tais materiais, em linhas gerais, preconiza-se a antissepsia com álcool 70% e com 
solução de iodo, a qual sempre deve ser removida ao término de qualquer procedimento, evitando, como 
dito anteriormente, processos alérgicos e até mesmo situações de queimadura. A coleta da amostra 
deve ser feita por meio de punção percutânea ou de procedimento cirúrgico específico, ressaltando 
que, quanto maior o volume de amostra colhida e processada, maior a possibilidade de isolamento e 
identificação do possível microrganismo associado. A amostra deve ser colhida em tubo seco e estéril 
e, assim que colhida, enviada imediatamente ao laboratório com a solicitação precisa de que tipo de 
cultura se deseja fazer.
94
Unidade I
Tal recomendação se justifica em razão de as infecções associada a tais líquidos serem inúmeras, 
destacando-se situações de pericardite, artrite séptica, peritonite etc., nas quais associam-se 
diferentes microrganismos, como Staphylococcus aureus, Acinetobacter sp., Mycoplasma pneumoniae, 
Enterobactérias e outros Gram-negativos, bactérias anaeróbias, como Propionibacterium spp., entre 
outros, o que torna todo processo de identificação bastante complexo e diversificado.
Em linhas gerais, a amostra é colhida e centrifugada a 3.000 r.p.m. por aproximadamente 15 minutos, 
semelhante ao procedimento descrito para amostra de LCR. Com o material centrifugado, a amostra 
deve ser semeada preferencialmente em ágar sangue e chocolate, e proceder simultaneamente com 
a bacterioscopia direta da amostra. As placas devem ser incubadas por 24 h a 35 ± 1 °C em jarra de 
anaerobiose. Se positivas, deve-se proceder com a identificação em nível de espécie e antibiograma, se 
negativas, as placas devem ser reincubadas até completar 72 horas e, se negativas novamente, reportar 
o resultado. Alternativamente, pode-se fornecer resultados parciais a cada 24 horas para melhor 
conduta clínica.
 Resumo
Foram abordados os principais equipamentos e materiais necessários 
à pratica da microbiologia clínica e reconhecida a importância das 
diferentes formas de se semear um material biológico, otimizando não 
somente o procedimento, mas facilitando a padronização dos métodos e 
reprodutibilidade dos ensaios. 
Reconheceu-se a importância da automação, percebendo sua 
aplicabilidade e facilidade, para a obtenção de resultados, mas o papel do 
profissional de laboratório será ainda maior à medida que dependerá dele 
estabelecer os critérios de análises da automação em questão e ainda saber 
interpretar os resultados por ela fornecidos.
Abordaram-se os diferentes métodos aplicados ao diagnóstico de 
infecção por bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, anaeróbias, quer 
sejam elas bactérias cocoides, bacilares ou encurvadas. Ainda reconheceu-se 
a importância dos diferentes protocolos estabelecidos a fim de garantir 
eficiência na realização dos ensaios e qualidade de resultados. Nesse 
sentido, diferentes protocolos foram reconhecidos, como de urocultura, 
hemocultura, cultura de secreções, de líquidos especiais, como o LCR, 
entre outros.
95
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
 Exercícios
Questão 1. Leia o texto a seguir.
“A competitividade e o alto custo tornam, a cada momento, mais difícil pensar em desenvolvimento 
de processos sem agregar uma metodologia científica de estudo. A necessidade crescente da otimização de 
processos, minimizando custos e tempo, maximizando rendimento, produtividade e qualidade, entre 
outros objetivos, tem levado profissionais de diferentes formações a buscarem técnicas e ferramentas 
sistemáticas de planejamento gerencial e de experimentos.
O laboratório clínico é uma estrutura prestadora de serviço especializado, presente na grande 
maioria das instituições de assistência médica, com a finalidade de fornecer recursos diagnósticos 
complementares. Além da realização das análises laboratoriais necessárias ao atendimento médico, 
o laboratório contribui para a formação médica e de outros profissionais que atuam em laboratório 
(farmacêutico, veterinário e biomédico) no que se refere ao bom uso dos recursos diagnósticos disponíveis 
ou potenciais.”
SAMPAIO, T. L. Mapeamento do conhecimento nos processos de rotina de laboratório de microbiologia clínica. Dissertação. 
Universidade Federal de Santa Catarina, 2017. Disponível em: https://bit.ly/3AmRWj9. Acesso em: 17 jun. 2021 (com adaptações).
A rotina e os procedimentos realizados em um laboratório clínico são fundamentais tanto para 
o atendimento aos clientes/pacientes quanto para o sucesso do empreendimento. Nesse contexto, o 
conhecimento sobre os equipamentos e suas funções é essencial. 
A respeito desse tema, avalie as afirmativas:
I – A autoclave fornece a temperatura ideal para a incubação dos microrganismos, o que favorece o 
crescimento deles.
II – A estufa bacteriológica é um equipamento que faz a esterilização usando o calor úmido do vapor 
(temperatura de ebulição de 121 °C), o que causa a desnaturação de proteínas dos microrganismos.
III – A mesa agitadora é empregada em trabalhos com microrganismos aeróbios, pois os movimentos 
rotatórios realizados por ela dissolvem o oxigênio do meio de cultura.
IV – A capela de fluxo laminar é uma câmara asséptica com exaustor e lâmpada fluorescente, na qual 
se realiza o procedimento de repicagem de microrganismos.
96
Unidade I
Assinale a alternativa correta:
A) Apenas a afirmativa I é correta.
B) Apenas a afirmativa III é correta.
C) Apenas as afirmativas III e IV são corretas.
D)Todas as afirmativas são corretas.
E) Nenhuma afirmativa é correta.
Resposta correta: alternativa C.
Análise das afirmativas
I – Afirmativa incorreta.
Justificativa: a definição de autoclave dada na afirmativa está errada, pois esse equipamento é 
responsável pela esterilização a partir do calor úmido; por meio do vapor, promove-se a desnaturação de 
proteínas dos microrganismos. O equipamento consiste em uma câmara de vapor, com temperatura de ebulição 
em torno de 121 °C. A autoclave é um equipamento indispensável ao laboratório de microbiologia para 
a esterilização de meios de cultura, água e suspensões, entre outros.
II – Afirmativa incorreta.
Justificativa: a definição de estufa bacteriológica dada na afirmativa está errada, pois, ao contrário do 
que foi dito, tal equipamento não extermina microrganismos. Estufas desse tipo auxiliam o crescimento 
dos microrganismos devido ao fato de a incubação ser em temperatura ideal.
III – Afirmativa correta.
Justificativa: equipamentos como o citado na afirmativa são agitadores usados para homogeneizar 
soluções ou para agitar substâncias viscosas por longos períodos. São especialmente importantes 
para trabalhos com organismos aeróbicos, pois podem garantir o suprimento regular de oxigênio no 
meio de cultura.
IV – Afirmativa correta.
Justificativa: as capelas de fluxo laminar têm como objetivo proporcionar um ambiente limpo 
para a manipulação segura de materiais biológicos ou estéreis, que não podem sofrer qualquer tipo 
de contaminação vinda do meio externo ou de contaminações cruzadas. Por tais características, são 
especialmente importantes para o procedimento de repicagem de microrganismos.
97
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA CLÍNICA
Questão 2. Leia o texto a seguir.
“O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram positiva pertencente ao gênero Staphylococcus e 
à família Staphylococcaceae. Geralmente, essas bactérias agrupam-se em formato de cocos que têm a 
aparência de cachos de uva. Trata-sede bactérias imóveis, não esporogênicas, catalase positiva e oxidase 
usualmente negativa. Por serem microrganismos químio-organotróficos, apresentam metabolismo de 
carboidratos respiratórios e fermentativos. São susceptíveis à lise por lisostafina e resistentes à lisozima. 
Predominantemente, são associados à pele, às glândulas e às mucosas de animais de sangue quente. 
O diâmetro da sua célula situa-se entre 0,5 e 1,5 μm e, pelo menos, 11 sorotipos possuem em sua 
estrutura cápsula de natureza polissacarídea, em que os sorotipos 6 e 7 são os mais associados às 
infecções em seres humanos. São aeróbios ou anaeróbios facultativos e crescem em ambientes a 
temperaturas estabelecidas entre 18 e 40 ºC e com elevado teor de cloreto de sódio (10%). O S. aureus 
é a principal espécie do grupo de Staphylococcus spp. coagulase positiva (SCP) e é um patógeno 
frequentemente associado à mastite contagiosa bovina. Esses microrganismos fazem parte da 
microbiota humana e podem provocar doenças que vão desde uma infecção simples, como espinhas e 
furúnculos, até infecções mais graves, como pneumonia, meningite, endocardite, síndrome do choque 
tóxico e septicemia. Nos seres humanos, são as bactérias mais frequentemente encontradas na mucosa 
nasal, as quais contaminam as mãos e desempenham papel importante na disseminação de infecções 
por meio dos alimentos.”
FREITAS, G. D. et al. Uso de diferentes métodos no controle do desenvolvimento do Staphylococcus aureus: 
uma revisão da literatura. Research, Society and Development, 10(2). 2021. Disponível em: https://bit.ly/3AkdVHx. 
Acesso em: 18 jun. 2021 (com adaptações).
Com base na leitura e nos seus conhecimentos, avalie as afirmativas.
I – A elevada interação e adaptação ao homem, ao animal e ao meio ambiente e a fácil aquisição de 
genes responsáveis por potencializar seus fatores de patogenicidade fazem com que o Staphylococcus 
aureus seja um grande problema de saúde pública.
II – Estudos têm demonstrado que algumas cepas de S. aureus apresentaram resistências a diferentes 
antibióticos, o que reforça a tese de que, muitas vezes, o uso de antibióticos pode não ser eficaz no 
tratamento de patogenias causadas por esses microrganismos.
III – Alguns dos principais testes utilizados na identificação dos microrganismos aqui em 
discussão são a prova da catalase, o teste da resistência a novobiocina, o teste da DNase e o teste 
da coagulase em lâmina.
98
Unidade I
Assinale a alternativa correta:
A) Apenas a afirmativa I é correta.
B) Apenas a afirmativa II é correta.
C) Apenas as afirmativas II e III são corretas.
D) Todas as afirmativas são corretas.
E) Nenhuma afirmativa é correta.
Resposta correta: alternativa D.
Análise das afirmativas
I – Afirmativa correta.
Justificativa: estudos demonstram que esse microrganismo patogênico tem acompanhado o ser 
humano ao longo de parte de sua evolução. As doenças causadas vão desde uma infecção simples 
(por exemplo, espinhas e furúnculos) até infecções mais graves (por exemplo, pneumonia, meningite, 
endocardite e septicemia). Embora faça parte da microbiota de humanos e outros vertebrados, a 
intensidade de sua patogenicidade é bastante variável devido, provavelmente, às interações, às 
adaptações e às alterações genéticas responsáveis por essas ações. Sendo assim, essa bactéria deve ser 
encarada como um grande problema de saúde pública.
II – Afirmativa correta.
Justificativa: não bastassem as diferentes doenças associadas ao S. aureus, esse patógeno também 
está se tornando resistente a antibióticos. Já foram encontradas cepas com essa característica de 
resistência. Ressalta-se que o uso incorreto de antibióticos convencionais pode estar relacionado à 
resistência bacteriana.
III – Afirmativa correta.
Justificativa: os testes mencionados fazem parte de um conjunto denominado métodos para 
identificação presuntiva dos estafilococos. Juntamente com outros testes, tornam possível a identificação 
de Staphylococcus spp. em lâminas ou em meios de cultura.