Biomol Aplicada - resumo P1

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BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA – P1
ENZIMAS:
POLIMERASES: fazem cópias e estendem moléculas.
LIGASES: unem moléculas de ácidos nucleicos.
TOPOISOMERASES: introduzem ou removem superenrolamentos de DNA circular covalentemente fechado.
ENZIMAS MODIFICADORAS: removem ou adicionam grupamentos químicos.
NUCLEASES: clivam, encurtam e degradam ácidos nucleicos.
* A DNA polimerase I é capaz de produzir e degradar.
POLIMERASE:
Sintetiza a partir de uma fita molde;
Para a síntese de DNA, é necessário um iniciador (primer);
Para a síntese de RNA, não precisa de primer;
A síntese é sempre feita no sentido 5’ → 3’ ;
Se há uma lacuna na fita nova, os nucleotídeos pré-existentes são substituídos. Isso é importante na leitura de revisão e evita mutações;
Os 323 aas iniciais da DNA polimerase I são responsáveis pela retirada de nucleotídeos ao longo da polimerização, processo que evita erros de pareamento;
A DNA polimerase I sem esses 323 aas iniciais chama-se fragmento de Klenow;
O fragmento de Klenow, portanto, não substitui os nucleotídeos pré-existentes, apenas preenche a lacuna;
A transcriptase reversa sintetiza uma fita de DNA a partir de um molde de RNA.
LIGASE:
Repara descontinuidades em fitas individuais de DNA durante a replicação (união dos fragmentos de Okasaki);
Refaz ligações fosfodiéster;
Refaz uma ligação pós-quebra;
Faz a união de duas moléculas (interessante na síntese de DNA recombinante e conexão pós-quebra).
* Os fragmentos de Okasaki só ocorrem a nível intracelular, não ocorrem, por exemplo, em uma PCR.
ENZIMAS MODIFICADORAS:
Modifcam o DNA pela adição ou remoção de grupamentos químicos específicos;
Fosfatase alcalina: remove o fosfato da extremidade 5’;
Polinucleotídeo-quinase: insere fosfato na extremidade 5’;
Desoxinucleotidil transferase terminal: adiciona desoxirribonucleotídeos a extremidade 3’.
NUCLEASE:
Degrada moléculas de ácidos nucleicos através da quebra de ligações fosfodiéster;
DNAse I: trabalha de modo aleatório, e quanto mais tempo de contato e mais concentrada a enzima, mais quebras ocorrerão;
Nuclease S1: rompe fosfodiéster em fita simples;
Exonucleases: remoção de um nucleotídeo da extremidade do DNA (conforme se rompem as ligações fosfodiéster, as pontes de hidrogênio não resistem e se quebram);
Endonucleases: quebra da ligação fosfodiéster no interior da molécula de DNA.
* Exonucleases:
Bal31: rompe as ligações fosfodiéster de qualquer extremidade da molécula;
Exonuclease III: rompe das extremidades 3’.
* Bacteriófagos ou fagos são vírus que infectam bactérias.
ENDONUCLEASE DE RESTRIÇÃO:
Grupo especial de endonucleases que clivam DNA de fita dupla em sítios de reconhecimento específicos.
Extremidades geradas após a clivagem: 
Extremidade cega: clivagem no mesmo ponto das duas fitas (“corte reto”);
Extremidade adesiva ou coesiva: clivagem em pontos diferentes das fitas complementares, gerando segmentos de fita simples.
Enzimas diferentes podem gerar as mesmas extremidades adesivas;
Sequência de reconhecimento: região da fita reconhecida pela enzima.
* Restrição controlada pelo hospedeiro:
Restrição do DNA do fago: o fago injeta DNA em uma bactéria → endonucleases de restrição ligam-se ao DNA do fago → o DNA do fago é clivado e inativado.
O DNA bacteriano não é clivado: as sequências de reconhecimento são metiladas → a endonuclease de restrição não é capaz de se ligar às sequências de reconhecimento.
DIGESTÃO DE RESTRIÇÃO:
Tratamento de um DNA com uma enzima de restrição;
Fatores importantes para o processo:
A enzima escolhida;
pH: 7,4 ;
Temperatura: 37°C;
Mg2+ : cofator enzimático;
Ditiotreitol (DTT): evita a redução da enzima.
Ao final, utiliza-se EDTA para quelar o Mg2+ e impedir que a enzima continue atuando; pode-se também aquecer a 70°C.
CLONAGEM GÊNICA:
Cada molécula do vetor é clivada uma única vez e na mesma posição. Isso ocorre em função do reconhecimento da enzima de restrição.
Uma vez fragmentado o DNA, as sequências podem ser clonadas e, posteriormente, sequenciadas.
ELETROFORESE:
Separação de moléculas quando submetidas a um campo elétrico;
Difusão em matriz gel:
Agarose: 1 a 30kb (ideal: 10 a 12kb);
Poliacrilamida: 1 a 300pb (os poros são menores).
Tamanho da molécula: as menores migram mais facilmente;
O DNA apresenta carga negativa: migra para o pólo positivo;
Tampão de corrida: azul de metileno (dá peso ao ser misturado com a amostra, impedindo que esta se dissipe no tampão da cuba);
Depois da “corrida” de eletroforese, o gel é corado com brometo de etídio para posterior revelação com UV.
* O brometo de etídio é um intercalante de DNA, logo não deve ser adicionado antes da corrida, pois alteraria o peso molecular das amostras.
Transiluminador: para revelar o gel com incidência de UV.
Auto-radiografia: tratamento com fósforo radioativo, com nucleotídeos marcados na PCR, por exemplo. Depois da eletroforese, o gel é deixado em contato com um filme de raio X; o fósforo radioativo queima o filme e tem-se a revelação do gel.
ELETROFORESE DE TOPOISÔMEROS:
A mesma sequência de nucleotídeos, ou de aas, podem apresentar conformações espaciais distintas, o que interfere em seu padrão de corrida num gel;
Quanto mais enovelada for a estrutura, mais facilmente a amostra passará pela trama, e mais baixa será a banda no gel.
ELETROFORESE EM CAMPO PULSADO:
Utilizada para moléculas muito grandes (fragmentos > 30kb);
Consiste em alternar a origem do campo elétrico e conduzir a amostra em zig-zag para facilitar o seu deslocamento.
* Sequências polimórficas é o que diferencia seres da mesma espécie.
MAPEAMENTO DE RFLP:
RFLP: Polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição;
A identificação dessas regiões polimórficas possibilita:
A análise da variabilidade genética entre indivíduos;
O teste de paternidade;
Avaliar a propensão a doenças.
Como é feito: tratamento com enzima de restrição → eletroforese.
BACTERIÓFAGO: vírus que infecta bactérias.
PLASMÍDEO: DNA circular presente em determinadas bactérias, além do DNA cromossomal.
* Ambos servem como vetores de clonagem; preferencialmente com tamanho inferior a 10kb.
PLASMÍDEOS:
DNA circular;
Portadores de um ou mais genes (que conferem alguma nova característica à bactéria);
Existem independente da célula bacteriana;
Apresentam, pelo menos, uma origem de replicação (que deve ser reconhecida pela bactéria);
Como vetor de clonagem:
Possuem dois ou mais sítios de clivagem para endonucleases de restrição;
Deve apresentar um gene que codifica um produto para distinção da célula transformada.
* Células transformadas são aquelas que receberam o plasmídeo.
* Cada plasmídeo tem um número ideal no interior da bactéria.
PLASMÍDEOS NÃO-INTEGRATIVOS:
Não são incorporados ao DNA bacteriano;
Plasmídeos menores: utilizam enzimas de replicação do DNA cromossomal;
Plasmídeos maiores: possuem genes que codificam suas próprias enzimas.
PLASMÍDEOS INTEGRATIVOS:
Chamados também de epissomos;
Integram-se ao DNA bacteriano durante a replicação, depois retornam à sua condição inicial, como um elemento independente no citoplasma.
PLASMÍDEOS CONJUGATIVOS:
Apresentam genes de transferência (tra);
Promovem a conjugação sexual: formação de uma fímbria que permite a comunicação entre duas bactérias, e, por ela, ocorre a transferência de uma cópia desse plasmídeo, além de outras coisas que podem acabar passando.
OBS.: Nunca DNA cromossomal !
PLASMÍDEOS NÃO-CONJUGATIVOS:
Ausência de genes de transferência;
Podem ser co-transferidos se a bactéria apresentar também um plasmídeo conjugativo.
CLASSIFICAÇÃO DOS PLASMÍDEOS:
Fertilidade (F): promovem a transferência plasmidial;
Resistência (R): conferem resistência à bactéria hospedeira;
Col: codificam colicinas (ptns bactericidas);
Degradativos: permitem a metabolização de moléculas incomuns (ex.: solventes, derivados de petróleo etc. ⟹ aplicação em biorremediação);
Virulência: conferem patogenicidade à bactéria hospedeira.
* Só se conhecem plasmídeos em procariotose em levedura (fungo).
BACTERIÓFAGOS:
Podem ser:
Cabeça e cauda: estruturas proteicas; DNA armazenado na cabeça ⟹ FAGO λ
Filamentosos: apenas um capsídeo proteico contendo o DNA ⟹ FAGO M13
Fixação do fago e inserção do cromossomo na célula;
Replicação do DNA do fago por enzimas específicas: para tal, o DNA deverá ser circular, ou circularizado. DNA linear é degradado pela bactéria;
Genes do fago sintetizam componentes proteicos do envoltório do fago.
CICLO LÍTICO:
Liberação de partículas virais na lise da bactéria;
Processo rápido, leva algumas horas;
A bactéria morre ao final do processo.
CICLO LISOGÊNICO:
Retenção do DNA do fago nas divisões celulares;
DNA do fago é incorporado ao DNA cromossomal durante a replicação (formação do profago) e retorna ao citoplasma depois da divisão, assim como o plasmídeo integrativos;
A bactéria não é lisada ao final do processo.
FAGO λ:
DNA linear dupla fita com extremidades coesivas complementares entre si, que permitem a sua circularização ao ser inserido na bactéria;
* Cosmídeo: forma aberta da molécula de DNA.
Na presença de nutrientes, o fago λ realiza o ciclo lisogênico;
Queda na [nutrientes] → queda na [ptn repressora] → sinal para ativação do ciclo lítico;
Apresenta em seu DNA uma região de 7kb não-essencial, chamada região b2, na qual pode ser adicionado fragmento de DNA a ser clonado.
Em outra região, modificaria sua estrutura, ou sua característica infecciosa;
Sítio cos:
Permite que o DNA seja circularizado (extremidades adesivas);
União de genomas de λ através do sítio cos após círculo rolante (processo de replicação do DNA circular dupla fita);
Como veículo de clonagem:
Sequência de DNA conhecida;
Agrupamento de genes é importante na construção de vetores (indica produtos relacionados);
Presença de sítios cos é relevante na construção de vetores de clonagem;
DNA inserido no fago é empacotado in vitro (principalmente se ultrapassar 7kb).
* Círculo rolante: enzimas quebram a dupla fita, polimerase reconhece a parte fora do círculo como primer e sintetiza, alongando a cadeia; enzimas de restrição clivam as duplas fitas, separando-as.
Importância do agrupamento de genes:
Controle da expressão gênica (ativação ou inativação em grupo);
Construção de vetores de clonagem (inserção de DNA a ser clonado).
FAGO M13:
DNA circular fita simples;
Tamanho de 6,4kb ;
Envoltório constituído de apenas 3 tipos de ptns;
DNA fita dupla (circular): forma replicativa;
A forma replicativa replica pelo mecanismo de círculo rolante para produzir DNA de fita simples linear, que é depois circularizado;
Durante toda a vida da bactéria, haverá produção e eliminação de fagos M13, pois a célula hospedeira tem seu metabolismo e divisão celular lentos;
Como veículo de clonagem:
Genoma menor que 10kb;
Forma replicativa similar a um plasmídeo;
Fácil obtenção em cultura de células (fica no sobrenadante);
Reintrodução por transfecção;
Genes clonados de um vetor M13 são obtidos em fita simples de fácil recuperação.
CLONAGEM GÊNICA:
Utlizada para amplificar sequências desconhecidas de DNA;
Pode ser utilizada com fragmentos superiores a 40kb;
Obtem-se DNA em grande quantidade;
Separação de fragmentos de DNA em uma mistura;
Demora dias ou até semanas;
* PCR: amplificação de sequências conhecidas, pois é necessário desenhar os primers, e menores que 40kb; leva poucas horas.
Adição do fragmento de DNA de interesse em um vetor (plasmídeo ou bacteriófago) (enzima de restrição + ligases) e sua incorporação a uma bactéria, que multiplicará o fragmento ao longo de suas divisões;
Não se pode alterar a origem de replicação do DNA recombinante (plasmídeo ou fago), do contrário a bactéria não irá reconhecer;
A transferência de uma colônia gerada para o meio sólido permite sua amplificação. Para o meio líquido, esta amplificação é maior ainda;
Separação: cada recombinante carrega um fragmento diferente do DNA de interesse;
O que pode dar errado no processo: 
Não ocorrer a inserção do fragmento no vetor (o plasmídeo circulariza sem o fragmento);
Inserção de um fragmento errado (outros fragmentos que não o de interesse).
* Os fragmentos de DNA lineares não-ligados são degradados pela bactéria, não geram problema.
* Todas as moléculas circulares serão clonadas.
TRANSFORMAÇÃO:
Incorporação do plasmídeo com o DNA recombinante na bactéria;
A transformação possui um baixo rendimento, mas garante que apenas um plasmídeo entre.
CÉLULAS COMPETENTES:
Aquelas submetidas ao processo de incorporação do DNA;
Tratamento com CaCl2 torna a bactéria competente.
CÉLULAS TRANSFORMADAS:
Aquelas contendo o plasmídeo;
42°C por 2min permite a entrada do plasmídeo.
IDENTIFICAÇÃO DO RECOMBINANTE:
Para diferenciar uma colônia que apresente o plasmídeo com DNA recombinante de outra que apresente o plasmídeo sem o DNA recombinante deve-se utilizar uma enzima de restrição que permita a inserção do DNA em um gene com função conhecida, como um que confere cor ou resistência a antibiótico, por exemplo. Desse modo, as bactérias que perderem tal característica são aquelas com o DNA recombinante.
Utilização de um meio seletivo (contendo antibiótico, por exemplo);
Complicador: saber qual enzima de restrição utilizar.
MARCADOR DE SELEÇÃO:
Característica do plasmídeo, que quando colocado em uma bactéria, permite sua identificação.
Exemplo:
Resistência a determinado antibiótico (ampicilina, tetraciclina, estreptomicina, penicilina etc.);
LacZ é um gene bacteriano responsável pela produção de parte da enzima β-galactosidase. LacZ’ é um gene plasmidial responsável pela produção da outra parte desta enzima. Os dois juntos permitem a formação da enzima completa.
Adicionando-se o substrato X-gal ao meio, ele deve ser metabolizado pela enzima, conferindo cor à colônia (azul).
SELEÇÃO DE RECOMBINANTE: 
ESTRATÉGIAS PARA OBTENÇÃO DO CLONE DESEJADO:
Seleção direta do gene desejado;
Identificação do clone a partir de uma biblioteca genômica.
TRANSFECÇÃO:
Equivalente à transformação, só que para bacteriófagos.
INFECÇÃO:
Montagem do bacteriófago in vitro com a inserção do DNA (empacotamento in vitro);
É feito in vitro pois o ideal é 40kb de DNA recombinante, mas o fago só tem espaço livre para 7kb (região não-essencial).
O material genético do bacteriófago é purificado isolando-o do capsídeo; faz-se a inserção do fragmento de DNA recombinante; para se obter novos capsídeos, utiliza-se uma cepa infectada que foi modificada para interromper o processo em determinado ponto que permite a obtenção dos componentes proteicos do vírus: cabeça e cauda; juntam-se esses componentes com o DNA recombinante.
MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO:
Manual (Sanger & Coulson);
Automatizado.
CLONAGEM GÊNICA
 DNA fita simples
PCR MODIFICADO
Molécula a ser sequenciada é clonada em M13;
Para a síntese da fita complementar, utiliza-se o fragmento de Klenow (para evitar que a enzima desfaça algum trecho);
Desoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP): dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
Didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddXTP): ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP.
Este é marcado com isótopo radioativo, revelação com raio X;
Não apresenta hidroxila no carbono 3’ ⟹ terminador de cadeia.
São feitos 4 tubos:
ddATP + dNTPs
ddTTP + dNTPS
ddGTP + dNTPs
ddCTP + dNTPs
* Proporção: ddXTP 1:100 dNTP.
* O terminador de cadeia é um só por tubo, logo é possível identificar o nucleotídeo terminal.
Serão gerados vários fragmentos de tamanhos variados;
Análise por eletroforese. Condições (para desnaturação e obtenção de ssDNA):
Gel de poliacrilamida ( < 0,5mm);
Uréia ou formamida;
Voltagem elevada;
Aquecimento a 60°C.
OBS.: A menor banda é de primer.
Análise manual com régua; capacidade de discernimento das bandas até 400 nucleotídeos, aproximadamente.
SEQUENCIAMENTO EM CICLOS TÉRMICOS:
Combinação PCR X Sequenciamento;
Interessante para avaliar variabilidadegenética;
Apenas um primer ⟹ geração de ssDNA;
Taq polimerase (ideal para altas temperaturas);
4 reações distintas;
dNTP + ddXTP.
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO:
Diferentes marcadores fluorescentes ligados aos ddXTPs ⟹ a reação pode ser feita em um único tubo;
Detecção com o uso de laser;
A própria máquina faz a extensão dos fragmentos (como uma PCR), uma eletroforese capilar e a detecção pela incidência de um laser.
* Eletroforese capilar: coloca em ordem os fragmentos de acordo com seu peso molecular (sem régua!).
Picos de tamanhos diferentes equivalem à variação no tamanho das bandas em um gel ⟹ concentração do fragmento.
Capacidade de discernimento em torno de 750 nucleotídeos.
COMO SEQUENCIAR UM GENOMA?
Tratamento com várias endonucleases de restrição (4 a 5 enzimas);
Sonicação da amostra de DNA (ultra-som).
* Contigs:
EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
Lise das células → Desproteinização → Concentração do DNA.
Rompimento da parede celular: ação enzimática (ex.: lisozima);
Rompimento da membrana celular: detergente (ex.: SDS), EDTA (quelante de Ca2+ e Mg2+);
O Ca2+ é essencial para a estruturação da membrana celular;
O Mg2+ é um cofator enzimático (ex.: DNAse ⟹ EDTA quela Mg, inativa DNAse, mantendo o DNA íntegropara ser extraído).
* Outra opção é a utilização de vapor fluente (tipo panela de pressão).
* É necessário um tampão para manter o pH em torno de 7,0 (até 7,4): estabilidade do DNA, evita sua desnaturação.
Centrifugação para a remoção dos resíduos celulares: deve ser feita a frio para evitar o choque entre as moléculas e sua possível desnaturação;
* A melhor forma de expressar a velocidade da centrifugação é em RPM.
* Nomograma Força G / RPM: traçar uma reta que ligue o valor do raio da centrífuga (1ª coluna) com o valor em RPM (2ª coluna). O ponto alcançado na 3ª coluna será seu equivalente em forças G.
Desproteinização: separação de ptns, lipídeos e restos celulares.
Protease: quebra ptns;
Mistura fenol-clorofórmio: solubiliza ptns, mas não solubiliza DNA.
Fenol: desnatura ptns;
Clorofórmio: estabiliza a junção entre as fases orgânica (ptns e lipídeos) e aquosa (DNA e RNA).
Centrifugação: sobrenadante contém DNA e RNA.
Para isolar DNA, adiciona-se RNAses para degradar o RNA;
Para isolar o RNA, não adiciona-se EDTA, para este quelar o Mg2+ e deixar as DNAses ativas.
Concentração do DNA: precipitação do DNA através do etanol absoluto gelado.
Absoluto: menor quantidade de água, pois o DNA é solúvel em água;
Gelado: dificulta ainda mais a solubilidade do DNA.
Centrifugação.
SOLUBILIZAÇÃO:
Em água: overnight a 4°C (demora pois o DNA está aderido à parede do tubo, e esta solubilização será feita em repouso);
Ou em NaOH 8mM: para uso imediato.
ESTOCAGEM DO DNA:
Em água: dura 1 semana a 4°C;
Em etanol absoluto: dura 1 ano a -70°C (pela ausência de critais de água).
QUANTIFICAÇÃO:
Representa a quantidade de DNA dupla fita;
Não necessariamente uma única dupla fita, pode estar quebrada;
Pela absorbância da luz UV;
DNA A260 = 1 (50μg/ml de DNA)
Proteína A280 = 0,5 (25μg/ml de ptn)
A260 / A280 ≥ 1,8 ( < 1,8 ⟹ contaminação com ptns ou fenol)
EXTRAÇÃO DE DNA COM CTAB:
CTAB = brometo de cetiltrimetilamônio;
CTAB complexa com DNA;
Técnica muito utilizada para extrair DNA de plantas.
EXTRAÇÃO DE DNA COM TIOCIANATO DE GUANIDINA:
DNA fica aderido a partículas de sílica de uma coluna cromatográfica;
Eluição com água.
EXTRAÇÃO DE RNA:
RNA é suscetível à degradação e autodegradação (em virtude da presença de uma hidroxila no carbono 2 da ribose);
Ribonucleases (RNAses) são estáveis, de difícil inativação e não precisam de cofatores;
São necessários equipamentos e reagentes isentos de RNAses.
* É bom manter as amostras sempre no gelo; evitar falar durante o procedimento.
* É utilizado o β-mercaptoetanol pois ele impede que as RNAses retomem sua estrutura original após inativação por aquecimento e retorno à temperatura ambiente; evita formação de pontes de dissulfeto.
Detergente: lise;
Tampão pH < 7,0 (levemente ácido): RNA se mantém estável, desestabiliza DNA (não adicionar EDTA);
Inibidor de RNAses.
Desproteinização;
Concentração em etanol absoluto;
Solubilização com água + inibidor (overnight a 4°C)
Estocagem:
Em etanol a -20°C: dura 1 mês;
Em etanol ou água + inibidor a -70°C: dura alguns anos.