9. ANÁLISE DE PROTEÍNAS

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ANÁLISE DE PROTEÍNAS 
INTRODUÇÃO: 
• Visa separar proteínas na forma pura 
• Determinar a seqüência de aminoácidos 
 objetivando 
 CONFORMAÇÃO 
 
 ATIVIDADE BIOLÓGICA 
 
 REGULAÇÃO DA ATIVIDADE 
 
 
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Métodos de separação 
DIÁLISE 
 Separa as proteínas de 
 moléculas pequenas 
 (aminoácidos,sais,oses) 
 
FRACIONAMENTO POR 
PRECIPITAÇÃO 
 
 
 
 
Sating out 
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FRACIONAMENTO POR PRECIPITAÇÃO 
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• GEL FILTRAÇÃO: (Peneira Molecular) 
 separa de acordo com o tamanho da molécula. 
 A mistura de proteínas com pesos diferentes é 
aplicada na coluna cromatográfica  Proteínas 
maiores são eluídas primeiro por não serem 
retidas nos poros da resina 
Ex. de resinas: sephadex; sepharose; biogel 
 
 
 
 
Métodos Cromatográficos 
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CROMATOGRAFIA TROCA IÔNICA: 
 Separa de acordo com a carga; 
 O suporte é uma resina com carga positiva ou 
negativa: 
Suporte + : troca ânions proteínas carregadas 
negativamente são retidas 
Suporte - : troca cátions  proteínas carregadas 
positivamente ficam retidas. 
 
ex.: DEAE-celulose (+); CM-celulose (-); 
 DOWEX 
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AFINIDADE 
Separa de acordo com as propriedades das 
proteínas ligarem-se a moléculas 
específicas. 
Suporte possui molécula com a qual a 
proteína de interesse tem afinidade, ligada 
covalentemente. Ao passar a mistura de 
proteínas a que tem afinidade fica retida. 
 
 
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MÉTODOS ELETROFORÉTICOS 
• Existem várias modalidades de eletroforese, 
e dependendo do tipo de problema em 
estudo deve-se escolher uma adequada ao 
seu experimento. 
 
• PRINCÍPIO DA TÉCNICA 
• A eletroforese está baseada no fenômeno do 
movimento que é produzido em uma 
determinada molécula carregada quando um 
campo elétrico é aplicado sob a mesma. 
Desta forma moléculas carregadas 
negativamente são arrastadas para o pólo 
positivo do campo elétrico e as positivas para 
o pólo negativo. 
 
• Eletroforese em Gel de Poliacrilamida-SDS 
 
– O gel de eletroforese consiste de uma matriz 
porosa que oferece uma pequena resistência 
ao movimento das moléculas através do 
mesmo; 
– As proteínas são separadas segundo a sua 
massa na eletroforese com detergente 
dodecilsulfato de sódio (SDS). 
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Eletroforese em condições desnaturantes 
SDS-PAGE 
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FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA 
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• A carga líquida de uma proteína é função da 
soma de suas cargas negativas e positivas. A 
carga é zero no seu ponto isoelétrico (pI) 
 
• O pI de uma proteína pode ser alterado por 
modificações químicas como fosforilações 
 
• O pré-requisito para uma boa IEF é a 
formação de gradiente de pH estável e 
reprodutível 
Gradientes de pH 
•A focalização isoelétrica é realizada em géis 
de poliacrilamida contendo um gradiente de 
pH que pode ser de dois tipos: 
 
•Tampões anfotéricos (“free carrier 
ampholytes”) 
 
•Gradientes imobilizados de pH (IPG) 
 
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Eletroforese Bidimensional 
(2D-PAGE) 
 
• 1975 - surge a 2D-PAGE . Trabalhos de 
O´Farrel; Klose ; MacGillivray et al. 
 
Etapas Básicas: 
 1- Focalização Isoelétrica (IEF) 
2-Eletroforese desnaturante em gel de 
poliacrilamida (SDS-PAGE) 
 
 
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL 
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SEQUENCIAMENTO DE PROTEÍNAS 
Etapas 
(a) Determinação da composição de aminoácidos: ex. Hidrólise ácida 
(b) Identificação da extremidade amino-terminal: ex.Reagente de Sanger 
(c) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: Degradação de Edman 
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(a) Determinação da composição de aminoácidos: Hidrólise ácida 
 seguida da separação dos 
 Aas por cromatografia 
 toca-ionica e identificação 
 dos Aas (HPLC 
Fig 7-6 (Voet 3ed). Análise de aminoácidos. 
*A hidrólise também pode ser realizada em meio básico, utilizando 2-4 M de 
NaOH 
**A hidrólise também pode ser realizada por digestão enzimática: Ex. 
Pronase (mistura de proteases) 
(a) Determinação da composição de aminoácidos: Hidrólise ácida 
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(b) Identificação da extremidade amino-terminal utilizando 
 b.1 Reagente de Sanger (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno); 
 b.2 Reagente: Cloreto de Dansila 
 b.3 Reagente de Edman ( Fenilisotiocianato) 
(b) Identificação Extremidade Amino-terminal 
b.1 Identificação da extremidade amino-terminal utilizando Reagente de 
 Sanger 
 (1-fluor-2,4-dinitrobenzeno) 
(b) Identificação Extremidade Amino-terminal 
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b.2 Identificação da extremidade amino-terminal utilizando Cloreto de Dansila 
 
 b.2 Identificação da extremidade amino-terminal utilizando: Degradação de 
 Edman 
Aduto feniltiocarbamil (PTC) 
Fenilisotiocianato (PITC) 
Derivado Tiazolinona 
Derivado Feniltioidantoína 
* A hidrólise final libera apenas o 
resínuo aminoterminal, deixando o 
resto da cadeia com um 
aminoácido a menos. 
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(c) Análise do grupamento C-terminal 
 Carboxipeptidases 
 
 
(d) Sequenciamento de toda a cadeia polipetídica: 
 Degradação de Edman 
 
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Sequenciamento de proteínas 
maiores requer a clivagem da 
cadeia polipeptídica 
1. Rompimento de Pontes de Dissulfeto 
2. Clivagem da cadeia polipeptídica 
3. Sequenciamento dos peptídeos 
4. Ordenamento dos fragmentos de peptídeos 
Etapas 
Rompimento de Ligações de Dissulfeto 
Mercaptoetanol 
(HSCH2CH2OH) 
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Clivagem da Cadeia polipeptidica 
• Métodos químicos: 
– Reagentes químicos clivam ligações peptídicas de 
forma específica  entre aminoácidos específicos 
 
• Métodos Enzimáticos: 
– Enzimas (proteases) clivam ligações peptídicas 
específicas 
Clivagem da Cadeia polipeptidica 
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Brometo de Cianogênio 
• Rompe a ligação peptídica onde a Carbonila 
pertence a Metionina 
 
 
 T – G – A – R – M – E – P – K – S – N 
 
 T – G – A – R – M E – P – K – S - N 
 
Pode-se prever o número de fragmentos sabendo-se o número de Lys ou Arg 
Tripsina cliva ligações peptídicas adjacentes a resíduos de Lys e Arg 
Se uma proteína tem 5 Lys ou Arg a clivagem com a Tripsina resultará em 
 
? fragmentos.... 
(resposta:6 fragmentos) 
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Tripsina (enzimático) 
• Rompe a ligação peptídica onde a Carbonila 
pertence a Lisina (K) ou Arginina (R) 
 
 
 T – G – A – R – M – E – P – K – S – N 
 
 T – G – A – R M – E – P – K S – N 
 
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Ordenamento de Fragmentos Peptídicos 
Faz-se através do ordenamento (sobreposição de segmentos iguais) de 
fragmentos obtidos por clivagens diferentes. 
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Qual a importância de se determinar a sequência dos aminoácidos? 
A sequência de aminoácidos é importante para: 
 
-Prever a estrutura 3D 
 
-Obter informações sobre o funcionamento da Proteína 
 
-Localização da Proteína-Evolução Molecular : alinhamento de sequências (“a sequência de aa na 
proteína pode elucidar a história da vida na terra”) 
 
-Diagnóstico de doenças