Aula pratica de Laboratorio

Prévia do material em texto

Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
 
 
 
 
Apostila de Aulas Práticas 
 
 
 
 
Bacteriologia 
 
 
Nutrição 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Raquel de Souza Sant’Anna 
(Monitora da Disciplina de Bacteriologia em 2007) 
 
 
Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira 
(Professor Adjunto de Bacteriologia) 
 
2007 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
 
Apresentação 
 
 O aprendizado teórico e prático de microbiologia, incluindo a bacteriologia, é muito 
importante para o profissional da área de nutrição. 
 As áreas de atuação em controle microbiológico de alimentos, treinamento de 
manipuladores, tecnologia na produção de alimentos, entre outras, exigem um profundo 
conhecimento desta disciplina. 
 A apostila é o material de apoio às aulas práticas disponibilizado aos alunos. Esta contém 
explicações teóricas e práticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma 
clara e didática. 
 A disciplina já possuía uma apostila de aulas práticas desde 2001, mas é necessária 
constante renovação para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para 
despertar o interesse dos alunos. 
 Cada assunto apresenta uma introdução contendo a teoria do tema abordado, assim como 
a sua aplicação e importância no exercício da profissão, objetivando o melhor entendimento do 
tema, dos materiais a serem utilizados, da execução e dos resultados obtidos. 
 No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões da prática executada e 
encontrará algumas questões de fixação. A apostila apresenta, também, figuras ilustrando a 
atividade a ser realizada, facilitando a compreensão do aluno. 
 Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada prática no contexto 
das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado. 
 
 Esperamos que você, aluno, aproveite ao máximo este recurso didático! 
 
 Lembre-se, qualquer dúvida, não hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores! 
 
 Os autores. 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
 
Índice 
 
Como trabalhar no laboratório de microbiologia ................................................................. 1 
Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura ..................................................... 5 
Assunto 2: Bactérias no Ambiente .................................................................................... 15 
Assunto 3: Controle Microbiano ........................................................................................ 18 
Assunto 4: Coloração de Gram......................................................................................... 27 
Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA (Antibiograma) ................... 34 
Assunto 6: Cocos Gram positivos ..................................................................................... 41 
Assunto 7: Coloração de Zihel-Neelsen (Visualização de Bactérias Espiraladas)............ 52 
Assunto 8: Bacilos Gram-negativos .................................................................................. 59 
Assunto 9: Contagem em Placa e Técnica do Número Mais Provável (NMP).................. 69 
Bibliografia ........................................................................................................................ 80 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
1 
Como trabalhar no laboratório de microbiologia 
 
 É importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um 
laboratório de microbiologia em geral, não importando se o microorganismo estudado será uma 
bactéria, um fungo ou um vírus. 
 
Cuidados fundamentais 
 
 Alguns experimentos que nós realizaremos podem ser perigosos se você manipular os 
materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente. 
 São necessárias algumas medidas de segurança quando se trabalha com 
microorganismos e substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos 
cortantes e outros materiais. 
 Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o 
professor ou o monitor para te auxiliar. 
 
Procedimentos de Precaução e Segurança 
 
 O laboratório de microbiologia é um lugar onde culturas de microorganismos são 
manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com boas 
técnicas assépticas, num local de trabalho limpo e organizado. Também como técnicas 
assépticas, todos os materiais que serão utilizados serão esterilizados para eliminar todos os 
microorganismos presentes ali, e deve-se tomar muito cuidado para não haver recontaminação 
deste material com microorganismos do ambiente. 
 Geralmente, os microorganismos estudados não são patogênicos, mas ainda assim, 
devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como se fosse potencialmente 
patogênico, lembrando que muitos microorganismos que geralmente não são patogênicos podem 
causar doenças oportunistas. 
 Cada estudante deve aprender e praticar as práticas assépticas no laboratório. Isto é 
importante para prevenir a contaminação de suas mãos, cabelos e roupas com material 
contaminado, além de evitar a contaminação do seu trabalho e proteger seus colegas que estarão 
trabalhando na bancada ao lado. 
 A importância da assepsia e desinfecção apropriadas está descrita na apostila e será 
observada em uma das aulas práticas. 
 Em geral, todos os procedimentos de segurança e precauções tomados no laboratório de 
microbiologia se resumem em: 
 1 – restringir os microorganismos presentes em culturas e amostras aos recipientes (vidros 
ou sacos de coleta, placas ou tubos) quando da sua coleta, crescimento (incubação) ou sua 
análise; 
 2 – prevenir a contaminação com microorganismos ambientais (normalmente presentes 
nas mãos, cabelos, roupas, superfícies e no ar) das amostras e culturas analisadas, o que pode 
interferir nos resultados obtidos. 
 Mãos e superficies devem ser higienizados e tratadas com anti-sépticos e desinfetantes 
corretos, jalecos devem ser utilizados, cabelos compridos devem ser presos para trás, e as áreas 
de trabalho devem estar livres de objetos desnecessários. Lembre-se que na hora de transferir os 
microorganismos ou culturas não devemos utilizar a boca (por exemplo, para pipetar). 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
2 
 A conduta pessoal no laboratório de microbiologia deve ser sempre observada. 
 O monitor ou professor deve ser sempre consultado caso haja algum problema. 
 
Conduta geral no laboratório 
 
1 – Sempre identifique e confira o seu material antes de iniciar os trabalhos no laboratório. 
 
2 – Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados 
em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens que não serão utilizados na 
aula prática. 
 
3 – Para entrar no laboratório, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferência 
limpo e branco. 
 
4 – No início e no final de cada aula prática, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada 
com uma solução desinfetante própria. Este espaço deve ser mantido limpo e arrumado durante o 
decorrer de toda a aula prática. 
 
5 – Antes de começar devemos lembrar: 
 - prenda seu cabelo comprido para trás, longe da chama do Bico de Bunsen; 
 - não use jóias e acessórios durante a aula prática; 
 - mantenha seus dedos, lápis, caneta e qualquer objetos longe da sua boca; 
 - não fume, coma ou beba nada no laboratório; 
 - não fique andando pelo laboratório,pois atividades desnecessárias podem causar 
acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminação. 
 
6 – Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.) 
 
7 – Anote todos os detalhes da aula prática e faça os exercícios de fixação de cada assunto. 
 
8 – Se você está em dúvida quanto ao procedimento, confira na apostila. Se a dúvida persistir, 
chame o professor ou monitor. Evite tirar dúvidas com os colegas de outros grupos. 
 
9 – Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer, 
chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha 
desinfetante sobre o local (superfícies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha. 
 
10 – Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra. 
 
11 – Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratório em quaisquer circunstâncias. 
 
12 – antes de sair do laboratório, cuidadosamente lave e faça a anti-sepsia em suas mãos. 
Lembre-se de lavar seu jaleco para a próxima aula prática. 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
3 
Como trabalhar com o microscópio 
 
Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios: 
 
 
 
- Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para 
mantê-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos (Obs: as 
capas devem ser lavadas periodicamente). 
 
- Não manusear o equipamento com as mãos sujas ou molhadas. 
 
- Jamais comer ou beber próximo ao equipamento. 
 
- Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na 
base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de 
trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o 
aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada. 
 
- Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o 
risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com 
papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugar 
imediatamente com papel absorvente macio. 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
4 
- Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para 
focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma: 
 à Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente 
no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para 
evitar o choque com a lamínula. 
 à Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito 
lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com 
o micrométrico. 
 à O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da 
objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada. 
 à Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva 
de menor aumento. 
 à Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e 
coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da 
objetiva; 
 à Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa, 
até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com 
a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem 
aparecer, complete a focalização com o micrométrico. 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
5 
Assunto 1: Meios de cultura e Técnicas de Semeadura 
 
Introdução 
 
 O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizados 
diversos meios de cultura diferentes. 
 Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de 
microorganismos. 
 A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias, 
clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios. 
Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos 
embrionados. 
 Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência 
de um determinado número de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se 
desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios 
envolve várias técnicas de semeadura. 
 Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado) 
requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados 
técnicas assépticas. 
 
Fundamentação teórica 
 
® Meios de Cultura 
 
Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas: 
 
 
Naturais 
São aqueles encontrados na natureza, de origem 
vegetal (p.ex.: pedaço de batata, de abóbora) ou 
animal (p.ex.: gema de ovo, pedaço de carne) 
São aqueles fabricados em laboratório, constituído 
de substâncias químicas, podendo ser definidos ou 
indefinidos (complexos) 
 
Definidos 
Possui composição definida, ou seja, 
se conhece qualitativa e quantitativa 
sua composição. 
 
 
 
 
 
 
Quanto à composição 
 
 
 
 
 
Artificiais 
 
Indefinidos 
A sua composição real não é 
conhecida, apenas é feita uma 
estimativa qualitativa. 
Por exemplo: meios suplementados 
com sangue, gema de ovo, 
alimentos... 
Quanto ao estado Líquido São desprovidos de Agar à caldo 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
6 
Semi-sólido Apresentam em sua composição até 1% de Agar. físico 
Sólido Apresentam em sua composição de 1,5 a 2,5% de 
Agar. 
Simples Só possui os nutrientes básicos para o crescimento 
das bactérias em geral. 
 
Enriquecido 
Além dos nutrientes básicos possui elementos 
nutritivos a mais, como fatores promotores de 
crescimento (sangue...), mas não é específico. 
 
 
De 
enriquecimento 
É suplementado com nutrientes específicos para o 
microorganismo que se deseja pesquisar. Além 
disso, possui nutrientes agentes inibidores de 
determinados microorganismos, mas não permite o 
isolamento da bactéria, pois é um meio líquido. 
Por exemplo: aminoácidos (lisina à Salmonella) 
 
Seletivo 
Possui agentes inibidores de determinados 
microorganismos. Permite a identificação e 
isolamento da bactéria, pois é um meio sólido 
(permite a visualização de UFCs). 
Por exemplo: Agar EMB à inibe Gram+ 
 
 
Diferencial 
Permite a diferenciação de diferentes 
microorganismos. 
Por exemplo: a diferenciação de bactérias 
fermentadoras e não fermentadoras da lactose no 
Agar EMB. 
 
 
Indicadores 
Possuem agentes que indicam determinadas 
reações no meio, para a determinação do 
metabolismo das bactérias. 
Por exemplo: ferro no meio à pode indicar a 
produção de H2S pelo enegrecimento do meio. 
(sulfeto ferroso) 
*** geralmente o agente é um indicador de pH 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Quanto à finalidade e 
características 
 
De estoque 
Meios onde são estocadas culturas puras para 
posterior utilização. Geralmente são meios semi-
sólidos. 
® Técnicas de Semeadura 
 
 As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um 
meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. 
 Para garantir que apenas o microorganismodesejado seja semeado, são utilizadas as 
técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de 
materiais, meios e culturas. 
 As técnicas de assepsia incluem: 
 
è fazer a desinfecção da área de trabalho e anti-sepsia das mãos ANTES e DEPOIS de 
qualquer trabalho. (1) 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
7 
è trabalhar SEMPRE na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da 
chama do bico de Bunsen. (2) 
 
è esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alças e agulhas bacteriológicas) ANTES e 
DEPOIS de seu uso à sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis. 
(3) 
 
è flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a 
contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo 
desejado será inoculado. (4) 
 
 
 
 De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade 
da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação. 
 A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente 
como repique. 
 A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação: 
 
· Semeadura em meios sólidos 
 
Meio inclinado em 
tubos 
 
 
 
 ou 
Estria sinuosa: semear com alça ou agulha 
bacteriológica, em zig-zag, partindo da base para a 
extremidade do bizel (superfície inclinada do 
meio). 
Objetivo: obtenção de intensa massa de 
microorganismos 
 
Estria Reta: semear com agulha bacteriológica, 
fazendo uma linha reta, com cuidado de não ferir o 
Agar, partindo da base para a extremidade do bizel 
(superfície inclinada do meio). 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
8 
 
 
Objetivo: obtenção de pequena massa de 
microorganismos. 
 
Picada Central: semear com agulha 
bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da 
finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo 
ou até o fundo deste. 
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e 
motilidade em algumas técnicas. 
Meio em camada 
alta 
 
Picada em Profundidade: semear com agulha 
bacteriológica, no centro do Agar. Dependendo da 
finalidade, o inóculo deve penetrar até 2/3 do tubo 
ou até o fundo deste. 
 
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e 
motilidade em algumas técnicas. 
 
 
 
Pour-plate ou disseminação (método em 
profundidade): Transferir 1 ml da cultura para 
placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio 
fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a 
cultura e homogeneizar suavemente com 
movimentos circulares. 
 
Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado 
também para análise de microorganismos 
anaeróbios, adicionando uma outra camada de 
meio fundido após o endurecimento da primeira 
camada. 
 
 
Estria simples: transferir uma alçada da cultura 
para meio sólido em placa e estriar com a alça 
bacteriológica sobre o meio. 
A estria pode ser realizada em movimento de zig-
zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre 
o meio (estria reta). 
 
Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para 
visualização de determinadas propriedades 
metabólicas, como a produção de enzimas 
hidrolíticas (hidrólise de substâncias do meio - 
gema de ovo, sangue...), e produção de 
pigmentos. 
Meio em placa de 
Petri 
 
Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: 
transferir uma alçada da cultura para meio sólido 
em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre 
o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a 
inoculação pode ser feita de 2 tipos: 
à em 3 estrias: estriar em metade da placa, com 
movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
9 
 
 
 ou 
 
 
 
 
girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da 
placa), girar mais 90° e estriar o meio restante. 
à em 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da 
placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante 
(1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do 
próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e 
estriar o restante do meio. 
 
Objetivo: obtenção de colônias isoladas. 
 
É importante não cruzar as estrias (não tocar a 
alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a 
cada estria e obter as colônias isoladas. 
Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as 
estrias e tocar a ponta da estria anterior, 
arrastando um pequeno inóculo para a próxima 
estria. 
 
 
 
Spread-plate ou distensão: Transferir 0,1 ml da 
cultura para o meio sólido na placa e espalhar 
uniformemente com a própria ponta da pipeta, ou 
alça bacteriológica / swab / alça Drigalsky. 
 
Objetivo: obtenção de crescimento confluente, ou 
para contagem bacteriana. Esta técnica é muito 
utilizada na realização de antibiogramas. 
 
· Semeadura em meios semi-sólidos 
 
 
Picada em Profundidade: semear com agulha bacteriológica, no 
centro do Agar. Dependendo da finalidade, o inóculo deve 
penetrar até 2/3 do tubo ou até o fundo deste. 
 
Objetivo: é utilizado para verificar fermentação e motilidade em 
algumas técnicas. Além disso, o meio também é utilizado para 
estocar culturas puras. 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
10 
· Semeadura em meios líquidos 
 
 
Difusão: uma alçada da colônia (Agar em placa) ou da cultura 
(de outro meio ou líquido) é introduzida no meio líquido, com 
agitação da alça, para maior difusão dos microorganismos (da 
alça para o meio e homogeneização no meio). Pode-se inclinar o 
tubo a 30° e esfregar o inóculo na parede do mesmo, quando o 
tubo retornar à posição original o inóculo se difundirá no meio. 
 
Objetivo: é um repique genérico para crescimento bacteriano em 
meio líquido. 
 
Objetivos 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
 
è executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias em 
diferentes meios (líquidos, semi-sólidos e sólidos), tanto em tubos quanto em placas; 
 
è caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um; 
 
è identificar e executar as técnicas de assepsia em laboratório. 
 
Material 
 
Para a atividade prática serão utilizados: 
 
- Placa de Petri com Agar 
- Tubo com Agar inclinado 
- Placa de Petri estéril 
- Tubo com Agar semi-sólido 
- Tubo com Agar em camada alta 
- Cultura bacteriana em caldo e em Agar 
- Amostra de água em tubo (para a técnica do pour plate) 
- Pipetas estéreis 
- Alça e agulha bacteriológicas 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
11 
Execução da prática 
 
® A partir de cultura em placa: 
 
- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça 
bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão. 
 
 
 
® A partir de cultura em caldo: 
 
- a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculações: 
 
1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com caldo, através da 
técnica de difusão. 
 
2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar 
inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta). 
 
3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para a placa com Agar, através da 
técnica de esgotamento em estrias (3 ou4 estrias). 
 
4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semi-
sólido, através da técnica de picada central. 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
12 
 
 
® A partir da amostra de água: 
 
- com o auxílio de uma pipeta estéril, transferir 1 ml da amostra de água para uma placa estéril e 
adicionar o meio fundido, realizando a técnica do pour plate. 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
13 
 Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 
 Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no 
isolamento de colônias (esgotamento em estrias). 
 
Exercícios de fixação 
 
1. Qual a diferença entre os meios “de enriquecimento” e “seletivo”? 
2. Qual a finalidade da técnica do “spread plate” ou técnica do espalhamento? 
3. Por que não devemos cruzar as estrias na técnica do esgotamento em estrias? 
4. Por que devem ser realizadas as técnicas assépticas? 
5. Por que utilizamos diferentes meios durante a análise de um determinado material (p.ex.: 
alimento)? 
6. Para uma cultura que esteja guardada há muito tempo (sob refrigeração), qual o tipo de meio 
devemos utilizar para retornar a utilizá-la numa atividade prática? 
7. Para determinar a presença de um microorganismo específico num material que esteja muito 
contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar? 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
14 
Observações 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
15 
Assunto 2: Bactérias no Ambiente 
 
Introdução 
 
 A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes. 
 A exposição de alimentos, sua manipulação e conservação incorretas, são fatores que 
levam à sua contaminação por microorganismos. 
 Os microorganismos podem ter relação com o alimento de três formas: 
 è adicionados intencionalmente: são aqueles que provocam alterações desejáveis nos 
alimentos, como os lactobacilos, que fermentam o leite, transformando-o em iogurte, queijo (etc). 
 è deterioradores: durante o seu desenvolvimento, estes microorganismos causam 
mudanças desagradáveis nos alimentos, tornando-os impróprios para o consumo, como os 
coliformes, que deterioram alimentos como queijos frescais, leite (etc). 
 è patogênicos: podem colonizar o alimento e representam um risco à saúde de quem 
ingerir este alimento (com o microorganismo ou com toxinas formadas por este), como Salmonella 
sp., Staphylococcus aureus e outros. 
 
Fundamentação teórica 
 
 As bactérias estão presentes em todos os ambientes. 
 Muitas vezes, sua presença não é prejudicial, como os microorganismos que colonizam a 
nossa pele e o nosso trato gastrintestinal. 
 Algumas vezes esta presença é até benéfica, como a utilização de microorganismos na 
indústria de alimentos na produção de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem 
nunca ouviu falar em alimentos pré e pró bióticos? São alimentos que contém em sua composição 
microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reações benéficas (como 
auxiliar a regulação do trânsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa 
microbiota normal a exercer seu papel benéfico no nosso organismo (como a produção de 
vitamina K pelas bactérias do nosso trato gastrintestinal). 
 Mas, nem sempre a relação alimento x microorganismos x homem é benéfica. Diversos 
microorganismos têm a capacidade de nos causar doenças, até mesmo os microorganismos da 
nossa microbiota normal (em casos de redução da atividade imunológica, causando doenças 
oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos. 
 É importante ressaltar que os alimentos por si só não são fontes de contaminação, mas 
podem veicular esta contaminação adquirida, podendo causar doenças. As principais fontes de 
contaminação são o solo e a água, as plantas, os utensílios utilizados na preparação do alimento 
(contaminação cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os próprios 
manipuladores de alimentos, a ração animal, a pele dos animais, e até o ar. 
 A indústria de alimentos vem crescendo e a preocupação com a obtenção de alimentos 
com qualidade tanto do ponto de vista tecnológico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo, 
aceitável no mercado, etc.) quanto microbiológico (segurança alimentar) está cada vez mais 
desenvolvida. 
 O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulação, preparo e 
conservação inadequados estão freqüentemente associados a doenças (intoxicações ou 
infecções) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que não 
contamine o alimento com técnicas e hábitos anti-higiênicos. 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
16 
 É dever do nutricionista conhecer os riscos associados à precariedade no cuidado com os 
alimentos para melhor orientação e supervisão das atividades de qualquer UAN (Unidade de 
Alimentação e Nutrição), restaurante ou indústria, evitando a disseminação de doenças através 
dos alimentos. 
 
Objetivos 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
 
è constatar a presença de bactérias no ambiente; 
 
è compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação de 
alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais ou por portadores 
de microorganismos patogênicos; 
 
è diferenciar fontes de contaminação e veículos de contaminação; 
 
è comentar sobre o papel de bactérias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos. 
 
Material 
 
- 2 Placas de Petri com Agar 
- swab estéril 
 
Execução da prática 
 
® Bactérias no ambiente: 
 
- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da área de segurança. Cada grupo deixará 
a placa em exposição por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos) 
 
 
- após o tempo de exposição, a placa deve ser tampada novamente. 
® Bactérias nas superfícies: 
 
- 1 placa com Agar deve ser dividida em 4 quadrantes 
 
- em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificação de bactérias em 
diversas superfícies, de acordo com o diagrama representado a seguir: 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
17 
 
Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 
 
Observar e interpretar o crescimento nos meios. 
 
Exercícios de fixação 
 
1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiológica dos alimentos? 
2. Por que é necessário tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou 
manipulam alimentos? 
3. O que é contaminação cruzada? 
4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminação? 
5. Quais são as principais fontes de contaminação dos alimentos? 
 
Observações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
18 
Assunto 3: Controle Microbiano 
 
Introdução 
 
 Como já vimos, as bactérias estão em quase todos os ambientes e superfícies, e não é 
desejável que muitos materiais se contaminem com elas, como os alimentos, os utensílios 
utilizados na sua preparação, medicamentos, e outros. 
 Para tanto, podemos aplicar diversos métodos de controle microbiano. 
 O crescimento microbiano é fortemente influenciado por fatores ambientais (fatores 
extrínsecos), quais sejam: temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente,composição 
gasosa do ambiente. 
 O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de 
reduzir a quantidade, eliminar, diminuir / impedir a multiplicação de microorganismos existente em 
ambientes, utensílios, e superfícies vivas ou inanimadas. 
 A conservação de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas empregadas 
no controle microbiano. 
 
Fundamentação teórica 
 
 Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu 
modo de ação, é importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos: 
 
è Desinfecção: redução do número de microorganismos em uma matéria inanimada (ambientes, 
superfícies, objetos, alimentos) 
 
è Sanitização: igual a desinfecção (termo utilizado na indústria de alimentos) 
 
è Esterilização: destruição total de microorganismos em um material 
 
è Anti-sepsia: redução do número de microorganismos em matéria viva (pele) 
 
è Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não contaminação de 
algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo) 
 
 Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle 
microbiano, que pode ser feito através de agentes químicos ou físicos. 
 
® Controle Microbiano por Agentes Físicos 
 
· Calor 
 Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor úmido. 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
19 
 É o método mais empregado para destruição de microorganismos devido ao seu baixo 
custo de aplicação, fácil aplicação, eficácia e praticidade. 
 
Flambagem 
- Definição: contato direto do material a ser tratado com o fogo. É 
esterilizante 
- Aplicação: materiais metálicos (p.ex.: alça bacteriológica) 
Forno ou estufa 
- Definição: o material é submetido a uma temperatura de 170 – 
180°C por 1 – 2 horas. É esterilizante 
- Aplicação: vidrarias e metais (material cirúrgico) 
Calor 
seco 
Modo de ação: 
Oxidação de 
componentes 
celulares 
Incineração 
- Definição: queima total do material. É esterilizante. 
- Aplicação: materiais descartáveis (principalmente materiais 
hospitalares) 
Pasteurização 
- Definição: aplicação de calor inferior a 100°C. É desinfetante (não 
elimina formas esporuladas). Pode ser classificada em: 
à lenta: 63°C / 30 minutos 
à rápida: 72°C / 15segundos 
- Aplicação: diversos alimentos são pasteurizados, como sucos, 
leite, etc. 
Fervura 
- Definição: aplicação de calor a 100°C por 15 minutos. É 
desinfetante (não elimina formas esporuladas). 
- Aplicação: alimentos em geral, p.ex.: leite 
Autoclavação 
- Definição: aplicação de calor a 121°C a uma pressão de 1 atm, 
por 15 – 30 minutos. 
- Aplicação: materiais, meios, utensílios. Diversos alimentos são 
tratados por este processo, p.ex.: alimentos enlatados 
(apertização). 
Calor 
úmido 
Modo de ação: 
Desnaturação de 
componentes 
celulares 
Esterilização 
- Definição: aplicação de calor maior que 100°C. Alimentos 
denominados UAT (UHT) são submetidos a uma temperatura de 
140 – 150°C por 2 – 4 segundos e rapidamente resfriados e 
acondicionados em recipientes estéreis. 
- Aplicação: diversos alimentos, como o leite UAT 
 
O calor úmido é mais eficaz que o calor seco, pois a água é melhor condutora de calor quando 
comparada com o ar. 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
20 
· Radiações 
Não ionizantes Luz Ultravioleta 
- possui atividade máxima num comprimento de onda de 260 nm 
- é desinfetante 
- geralmente é utilizado em ambientes 
- não é penetrante à desinfecção apenas superficial 
- a lâmpada tem vida útil de 200 horas (aproximadamente) 
- age no DNA microbiano, gerando mutações letais 
Ionizantes Radiação Gama 
- é esterilizante 
- mais energético que UV, atua num comprimento de onda menor 
- age ionizando componentes celulares, levando à morte 
- muito utilizado em produtos hospitalares descartáveis 
- seu uso nas indústrias de alimentos está crescendo 
- possui baixo poder de penetração à desinfecção apenas superficial 
 
· Filtração 
Clarificante - retém as impurezas grosseiras 
- é desinfetante 
Esterilizante - possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vírus. 
 
· Outros 
Adição de NaCl 
- também conhecida como salga 
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo 
microbiano. Também pode causar lise osmótica da célula bacteriana. 
- muito utilizada em produtos cárneos (carne seca, pescado) 
Pressão osmótica 
Adição de outros sólidos (açúcares) 
- utilizado na fabricação de compotas e alimentos em calda 
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo 
microbiano 
- muito empregado para conservação de frutas e hortaliças 
Dessecação - retirada umidade do alimento em maior ou menor grau 
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo 
microbiano 
Liofilização - aplicação de dessecação em vácuo (pressão negativa) 
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo 
microbiano 
- seu emprego na indústria de alimentos é crescente 
Baixas temperaturas Refrigeração 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
21 
- temperatura entre 0 e 10°C 
- reduz a atividade metabólica de alguns microorganismos (mesófilos e 
termófilos) 
Congelamento 
- temperaturas inferiores a 0°C 
- impede a atividade metabólica da maioria dos microorganismos 
- em alguns casos, causa a morte dos microorganismos 
 
® Controle Microbiano por Agentes Químicos 
 
· Álcool Etílico 
 É um dos métodos químicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo 
custo, relativa eficácia e fácil aplicação. Pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. 
 Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 – 70%), pois nessa condição 
possui maior poder penetrante. 
 O álcool absoluto possui poder bacteriostático, enquanto o álcool hidratado a 70% possui 
poder bactericida. 
 São apontados diversos mecanismos de ação para o etanol: 
 - ação detergente: solvente de lipídeos 
 - ação desidratante: retira água das células 
 - ação desnaturante: agindo sobre proteínas celulares 
 
· Fenóis e Derivados 
 O fenol é um desinfetante fraco, porém é utilizado como um desinfetante de referência 
para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais 
ativo que o fenol. 
 Atua como desnaturantes de componentes protéicos 
 Dentre os cresóis, o mais importante é a creolina, uma mistura de cresóis muito utilizada 
para pisos e sanitários. 
 O hexaclorofeno é muito utilizado na antissepsia cirúrgica. 
 
· Halogênios 
 Os principais halogênios utilizados no controle microbiano são o Cloro e o Iodo. 
 
è Cloro: É usado como desinfetante de águas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ação é 
dado pela reação: 
Cl2 + H2O à HCl + HClO 
O ácido hipocloroso é instável, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminará 
os microorganismos através de oxidação de componentes celulares. 
 
è Iodo: reage de forma irreversível com aminoácidos aromáticos de proteínas celulares 
(fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido à grande possibilidade de alergias, seu uso 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
22 
como anti-séptico na prática cirúrgica vem diminuindo, sendo substituído por clorexidine e 
similares. 
 
· Detergentes catiônicos 
 Alteram a permeabilidade da membrana. É mais ativo contra Gram negativos. 
Exemplo: compostos quaternários de amônio à cloreto de benzalcônio. 
 
· Sais de Metais Pesados 
 Os metais pesados agem na inativação de enzimas, por sua alta afinidade porapoproteínas. Os principais metais pesados utilizados no controle microbiano são: 
 
è Mercúrio (Hg): já foi muito utilizado como anti-séptico, mas seu uso está decaindo devido ao 
risco de intoxicação por absorção cutânea. 
 
è Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para águas de recreação 
 
è Nitrato de Prata (AgNO3): é um anti-séptico altamente eficiente contra gonococos, que 
causam oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa. 
 
· Ácidos 
 Tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos são muito utilizados na conservação de 
alimentos. São mais utilizados os ácidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior 
solubilidade. 
 A atividade antimicrobiológica dos ácidos fracos é atribuída a sua forma não dissociada 
(HA), pois esta penetra através da membrana tornando-se ionizada após alcançar o interior da 
célula. A concentração intracelular destes ácidos orgânicos altera o funcionamento normal do 
gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular. 
 A concentração da forma não dissociada do conservante químico no alimento é 
determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molécula está na forma dissociada) do ácido e do pH do 
meio, como mostra a fórmula a seguir: 
 
 
 
 
 
 
 Portanto, a concentração da forma não dissociada aumenta com a elevação da acidez do 
alimento, ou seja, o pH do alimento deve ser menor que o pKa, de forma a garantir alta 
concentração da forma não dissociada. 
 Os valores de pKa da maioria dos ácidos encontra-se na faixa de pH entre 3,0 e 5,0. 
 O pKa é usado na medição de sua eficiência no alimento em determinado pH. 
 Exemplos de ácidos orgânicos utilizados na indústria de alimentos: ácido tartárico (tartarato 
de sódio, tartarato potássio), ácido cítrico (citrato de sódio, citrato de potássio), ácido propiônico 
(propionato de cálcio). 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
23 
· Álcalis 
 Os principais álcalis utilizados são o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente, 
está presente nos sabões, conferindo-lhes relativa ação anti-séptica. 
 
· Corantes básicos 
 São mais eficiente contra Gram-positivos. 
Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno. 
 
· Redutores 
Reduzem compostos celulares, levando as células à morte. 
Aldeídos e derivados: formaldeído e formalina são utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas 
causam irritações cutâneas. 
 
· Oxidantes 
 Oxidam componentes celulares levando à morte das células. São muito utilizados como 
desinfetantes. 
Exemplo: Ozônio, água oxigenada, permanganato de potássio, peróxido de zinco. 
Óxido de etileno (gás): é um agente alquilante, age inativando proteínas e ácidos nucléicos. À 
temperatura de 52°C o óxido de etileno passa do estado líquido para o gasoso. Seus vapores são 
utilizados para esterilização de materiais de borracha ou plástico. 
 
· Antimicrobianos 
 Possuem ação seletiva contra microorganismos, ao contrário dos anteriores. São um 
método biológico de controle microbiano. Serão abordados num próximo assunto. 
 
Objetivos 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
 
è conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiológico; 
 
è descrever os agentes físicos e químicos utilizados no controle microbiano; 
 
è entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilização, diferenciando calor úmido 
de calor seco 
 
è compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos de anti-sepsia 
utilizados. 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
24 
Material 
 
- Culturas bacterianas 
- 2 Placas de Petri com Agar 
- Soluções anti-sépticas 
- Gaze estéril 
- Tripé e tela de amianto 
- Recipiente com água em ebulição 
 
Execução da prática 
 
® Agentes Químicos 
 
- dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes 
- semear os 4 quadrantes da seguinte forma: 
- 1º quadrante: um aluno encosta o dedo suavemente no Agar 
- 2º quadrante: outro aluno lava o dedo com água e sabão por 1 minuto, seca com gaze estéril e 
faz a impressão do dedo 
- 3º quadrante: outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool etílico a 
70%, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo 
- 4º quadrante: um outro aluno faz a anti-sepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool 
iodado, seca com gaze estéril e faz a impressão do dedo 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
25 
® Agentes Físicos - calor 
 
- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espaço respectivo ao 
tempo 0 
- para os próximos espaços, colocar as culturas em banho-maria fervente até atingir o tempo 
especificado: 
 - 5 minutos à reinocular 
 - 10 minutos à reinocular 
 - 20 minutos à reinocular 
 
 
 
- Após a execução de todas as inoculações, incubar os meios a 37°C por 24 horas. 
 
- Observar e interpretar o crescimento nos meios. 
 
Exercícios de fixação 
 
1. Qual a diferença entre anti-sepsia e assepsia? 
2. Qual o modo de ação do calor seco? E do calor úmido? Qual o mais eficaz? 
3. Qual é o tipo de calor mais utilizado para a indústria de alimentos? Por quê? 
4. Por que o álcool etílico utilizado como desinfetante e anti-séptico deve ser hidratado? 
5. Qual o mecanismo de ação dos ácidos utilizados na conservação de alimentos? 
6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou 
estufas de esterilização, também possuem ação esterilizante? 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
26 
Observações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
27 
Assunto 4: Coloração de Gram 
 
Introdução 
 
 Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso 
não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma 
coloração diferencial. 
 Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, 
o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas 
seqüências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias 
em 2 grandes grupos. 
 O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado 
Gram positivo. 
 O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante 
utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo. 
 Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um 
corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para 
a primeira etapa da coloração. 
 Há também um agente descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se 
utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool 
etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. 
 Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5), obtendo uma 
velocidade de descoloração intermediária. 
 A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que 
são os únicos Gram negativos. 
 Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos 
Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, 
Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram-negativos. 
 A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das 
bactérias é etapa inicial de grande importânciano isolamento e identificação de bactérias de 
material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria 
sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma. 
 
Fundamentação teórica 
 
 A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias 
e como estas serão coradas de forma distinta. 
 As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína 
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias 
lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de 
glicoproteína. 
 Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia 
previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for 
utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%, 
homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da 
coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
28 
o esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se 
perca durante as etapas da coloração. 
 Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O 
corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram 
negativa. 
 Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande 
complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. 
 O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço 
corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias: 
 à as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão 
desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e 
tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I). 
 à as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima 
desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros 
componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada 
de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula 
descorada neste momento. 
 É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum 
resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão 
ser alterados. 
 O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram 
positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células 
Gram negativas, corando-as de vermelho. 
 
 Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que não se coram 
por este método, como as micobactérias, as bactérias espiraladas e as bactérias que não 
possuem parede celular. Para estes, há outros métodos de coloração, como o método de Zihel-
Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método de visualização em campo escuro. 
 
 Alguns fatores podem influenciar nos resultados obtidos na coloração: 
 
 à Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar resíduos (cristais) 
na lâmina. 
 
 à Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciação da 
bactéria pelo álcool. 
 
 à A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em 
culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram-negativas. 
Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à 
membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade aos solventes. 
Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula. 
 
Objetivos 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
29 
è executar a técnica da coloração de Gram; 
è utilizar a objetiva de imersão; 
 
è relacionar a composição química da parede celular das bactérias com os corantes de Gram; 
 
è compreender a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material submetido 
a exame microbiológico; 
 
è descrever as formas, arranjos e coloração das bactérias. 
 
Material 
 
- Lâminas 
- Culturas bacterianas em meio líquido e sólido 
- Alças e agulhas 
- Bateria da coloração de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, álcool, água) 
- Papel de filtro 
- Óleo de cedro (óleo de imersão) 
- Microscópio 
- Bico de Bunsen 
 
Execução da prática 
 
® Preparo e fixação do esfregaço 
 
Etapas Observações 
Transferir uma alçada da cultura ou uma colônia 
da placa para uma lâmina de microscópio limpa. 
 
Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes 
culturas deve-se observar alguns detalhes: 
 
è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, 
espalhando-a pela lâmina à isso evitará a 
observação de colônias diferentes na lâmina e 
que seja coletado um inóculo muito carregado, o 
que dificultará a visualização das células 
coradas. 
 
è de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada 
e espalhá-la na lâmina à isso evita que seja 
coletado um inóculo muito carregado. 
Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. 
Se tiver sido colhida colônia da placa, adicionar 
salina estéril para facilitar o espalhamento. 
Para o inóculo coletado de caldo não é 
necessário adicionar solução salina. Mas para 
colônia coletada de placa é necessário fazer a 
diluição na lâmina, evitando que o esfregaço 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
30 
 
fique muito concentrado o que dificulta a 
visualização das células coradas ao 
microscópio. 
Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama 
do Bico de Bunsen, até que este esteja 
completamente seco. 
 
É importante fixar o esfregaço para que este não 
se perca durante as etapas de lavagem entre a 
utilização de um e outro corantes 
 
® Coloração do esfregaço 
 
Etapas da Coloração O que está acontecendo na parede da bactéria? 
Cobrir o esfregaço com solução de Cristal 
Violeta por cerca de 1 minuto. 
 
O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os 
tipos de células (Gram + e Gram -) 
 
 
 
A seguir, lavar em água corrente com o 
pissete. 
A lavagem com água é importante após cada 
etapa para que uma substância utilizada não 
interfira na ação da próxima. 
 
Nesse caso, a lavagem serve para retirar o 
excesso de corante. 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
31 
 
Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco 
por cerca de 1 minuto. 
 
 
O Lugol é uma solução de Iodo e funciona como 
mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele 
fixa o corante Cristal Violeta na parede da célula, 
pois forma um complexo grande: o CV-I 
 
 
 
Novamente lavar com água, e então lavar com 
álcool absoluto até que não saia mais corante 
da lâmina (10 – 15 segundos). 
 
 
O álcool absoluto, ou solução de álcool-acetona, 
funciona como diferenciador da coloração: 
è nas Gram +, o álcool desidrata a matriz 
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os 
poros da parede e impedindo a saída do 
complexo CV-I, corando a célula de roxo: 
 
è nas Gram -, o álcool dissolve a membrana 
externa, de caráter lipídico (lipoproteínas, 
fosfolipídeos,LPS), fazendo com que o 
complexo CV-I saia da parede, deixando a célula 
descorada e com os poros da matriz 
glicoproteica abertos: 
 
Lavar com água corrente em abundância, É importante prestar com bastante atenção nesta 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
32 
para que não reste álcool sobre a lâmina. 
 
etapa, pois se restar algum álcool na lâmina a 
coloração não prosseguirá, já que o próximo 
corante não se fixará na lâmina. 
Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de 
30 segundos. 
 
 
 
A fucsina age de diferentes formas nas 
diferentes células: 
è nas Gram +, os poros estão reduzidos, 
impedindo que a fucsina penetre na parede 
celular, não alterando a cor roxa: 
 
è nas Gram -, os poros da camada de 
peptidoglicano estão abertos, permitindo que a 
fucsina penetre na célula, corando-as de 
vermelho: 
 
Lavar com água e secar suavemente com 
papel. 
 
Após secar suavemente a lâmina, observar ao 
microscópio na objetiva de imersão (100x), com 
óleo de cedro/mineral e identificar a célula 
corada. 
Para decorar!!! 
 
 Vi Lulu Ali A Fumar 
(Cristal Violeta) (Lugol) (Álcool) (Água) (Fucsina) 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
33 
Exercícios de fixação 
 
1. Em que se baseia o método da coloração de Gram? 
2. Por que o álcool é considerado como agente diferenciador da coloração de Gram? 
3. Qual é o papel do mordente (lugol)? 
 
Observações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
34 
Assunto 5: Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos – TSA 
(Antibiograma) 
 
Introdução 
 
 O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da 
sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de 
sensibilidade previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao 
desenvolvimento ou aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso 
adequado e criterioso de antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de 
amostras bacterianas multirresistentes. 
 O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o esclarecimento 
objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no tratamento. 
 O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao processo 
infeccioso, mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente empregadas na 
terapia não seja previsível como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos não 
fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc. 
 A seleção dos antimicrobianos para a realização dos antibiogramas de rotina deve seguir 
alguns princípios. Uma das estratégias adotadas é o reconhecimento que alguns agentes 
antimicrobianos podem ser agrupados em classes, baseando-se no seu espectro de atividade. 
Assim, um só representante de classe necessita ser testado, a não ser quando dentro de uma 
mesma classe de antimicrobianos não exista a possibilidade de equivalência. 
 
Fundamentação teórica 
 
 Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é 
inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano 
atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias 
moderadamente resistentes) é dado por aquela cujo crescimento é inibido por concentrações 
intermediárias. Na interpretação dos resultados, consideramos as bactérias intermediariamente 
resistentes como resistentes. 
 A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente. 
A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo método de 
difusão em placa com discos impregnados com as drogas. 
 - Método de Diluição (MIC): No método de diluição, concentrações variadas do 
antibiótico, obtidas pela diluição em Caldo ou Agar, são inoculadas com o microrganismo. A 
concentração mais baixa do antibiótico que evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 
horas é a concentração inibitória mínima, é a medida da sensibilidade. 
 - Método da Difusão do Disco: Nos testes pelo método de difusão, discos de papel 
impregnados com o antibiótico são colocados uniformemente na superfície do Agar semeado com 
o microrganismo. Forma-se, então, um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a 
partir do disco para o Agar com conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível 
ao determinado (os) antibiótico (os). 
 Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de 
difusão com disco (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de 
rotina, mas é indispensável que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presença de algumas 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
35 
substâncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição. Para minimizar os riscos 
de resultados errôneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este é 
um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar 
que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma 
coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da cultura. 
 A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem 
crescimento em volta dos discos de antibiótico). O tamanho do halo sozinho não é uma medida 
quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais 
potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos 
produzidos por antibióticos não relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se 
interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação 
aos dados da tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na 
terapêutica clínica. 
 Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ação na célula bacteriana: 
 
Sítio de ação Mecanismo de ação Classes de antimicrobianos 
Antimicrobianos 
que atuam a nível 
da parede celular 
- agem na etapa da síntese da parede que 
ocorre externamente à membrana plasmática 
- impedem a união de cadeias peptídicas 
- aumentam atividade das autolisinas 
- se ligam à face externa da membrana 
- b-lactâmicos (penicilina, 
monobactâmicos) 
Antimicrobianos 
que atuam a nível 
da membrana 
citoplasmática 
- possuem NH3
+ (fica na superfície da 
membrana, formando poros) e Ag+ (se insere 
na membrana) na sua molécula 
- desorganizam a membrana plasmática 
- provocam a saída de componentes 
celulares 
- Polimixinas (não reagem 
com fosfatídeos de colina 
das células animais) 
Antimicrobianos 
que atuam a nível 
dos ribossomos 
- aminoglicosídeos e tetraciclinas: se ligam à 
subunidade 30s do ribossomo, tornando-o 
não funcional, impedindo a incorporação de 
aminoácidos 
- cloranfenicol, lincomicina e clindamicina: se 
ligam à subunidade 50s do ribossomo, 
impedindo a união de novos aminoácidos 
- eritromicina: se liga à subunidade 50s do 
ribossomo e impede a translocação 
- Aminoglicosídeos 
(estrptomicina, gentamicina) 
- Tetraciclinas (tetraciclina, 
doxiciclina) 
- Cloranfenicol 
- Macrolídeos (eritromicina 
- Estreptograminas 
(lincomicina, clindamicina) 
Antimicrobianos 
que atuam a nível 
do DNA 
-metronidazol: é reduzido, se tornando tóxico 
e quebrando a molécula de DNA 
- rifampicina: combinam-se com RNA-
polimerases, bloqueando a transcrição do 
DNA 
- derivados quinolônicos: inibem a ação das 
girases 
- Metronidazol 
- Derivados quinolônicos 
(ácido naxadílico, 
ciprofloxacino) 
- Macrolídeos (rifampicinas) 
Antimicrobianos 
que atuam a nível 
do metabolismo 
intermediário 
- sulfonamidas: bloqueiam a síntese de ácido 
fólico (competem com o PABA) 
- trimetoprina: interfere na síntese de purinas, 
metionina, serina e timina 
- Sulfonamidas 
- Trimetoprina 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
36 
 Na escolha do antimicrobiano a ser utilizado, devem ser avaliados os seguintes critérios: 
toxicidade seletiva, bactericida, amplo espectro, não deve ser alergênico, não deve provocar 
efeitos colaterais e não devem ter microorganismos resistentes. 
 É necessário que se observe o tempo mínimo para uso do agente antimicrobiano, para 
evitar a seleção de microrganismos resistentes. Graças ao uso descuidado de agentes 
antimicrobianos, a taxa de casos de microrganismos multirresistentes vem aumentando nos 
últimos anos. Um exemplo é o tratamento da tuberculose, que consiste na administração de uma 
combinação de antibióticos (2 a 3) por um longo período (6 meses). O abandono precoce do 
tratamento acaba por selecionar cepas MDR (multi drug resistent). 
 Durante a execução da prática utilizaremos a Escala Mac Farland, que consiste num 
método de quantificação de microorganismos através de turbidez. A escala é preparada com 
ácido sulfúrico e cloreto de bário em diversas concentrações, que reagem formando cloreto de 
bário obtendo diversos graus de turbidez. A concentração aproximada de microorganismos é dada 
conforme a leitura de absorbância realizada, de acordo com a tabela a seguir. 
 Geralmente utilizamos uma concentração de microrganismos equivalentes ao padrão 0,5 
da escala MacFarland, ou seja, 1,5x108/ml. 
 
Padrão da 
escala 
MacFarland 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
Concentração 
aproximada de 
microrganismos 
(x106/ml) 
300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000 
 
 O Nutricionista deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos antibióticos 
que são utilizados para o tratamento de infecções a partir do conhecimento à sensibilidade das 
bactérias aos mesmos, para então acompanhar a dieta do indivíduo, fazendo as devidas 
modificações necessárias devido as inúmeras interações fármaco-nutrientes e a biodisponibilidade 
dos fármacos, sem esquecer as possíveis deficiências de vitaminas e minerais que podem vir a 
acontecer devido as introdução de alguns antibióticos. 
 
Objetivos 
 
Após a realização da atividade prática você será capaz de: 
 
è conceituar antibiograma (TSA) e identificar os grupos ou quadros clínicos nos quais o 
antibiograma é indicado; 
 
è diferenciar os métodos de diluição (CIM ou MIC) do método de difusão e descrever as etapas 
para a realização deste último; 
 
è compreender a influência de alguns fatores no diâmetro do halo e inibição; 
 
è ler e interpretar resultados possíveis de um antibiograma; 
 
è citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito através de outras técnicas. 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
37 
Material 
 
- Cultura bacteriana 
- Tubo com solução salina estéril 
- Swab estéril 
- Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland 
- Pipeta estéril 
- Placa de Agar Mueller-Hinton 
- 4 discos de antibióticos diferentes 
- Pinça 
- Régua graduada 
 
Execução da prática 
 
- ajustar a densidade do inóculo acrescentando a cultura à solução salina até esta se igualar à 
turvação do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste é feito por turbidez, e não 
pela cor que o caldo se apresenta). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de 
modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direções) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
38 
- aguardar um tempo para que o Agar absorva o inóculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o 
auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de antibióticos sobre o Agar, pressionando 
levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles à borda da 
placa um espaço não inferior a 15 mm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Incubar 18-24 horas a 35o C. 
Medir com régua o diâmetro do halo de inibição, comparar com os dados da tabela e expressar 
seus resultados. 
 
® Meios utilizados na prática 
 
Agar Mueller-Hinton 
Composição do Meio (g/L) Observações 
Infusão desidratada de carne 
Caseína hidrolisada 
Amido 
Agar 
300,0 
17,5 
1,5 
17,0 
pH do meio: 7,4 ± 0,2 
O meio não apresenta nenhum agente seletivo 
ou inibidor que possa interferir nos resultados 
do Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos. 
 
® Limites para Interpretação do Antibiograma com 32 Antimicrobianos de 
uso corrente na Terapêutica Clínica 
 
Antimicrobiano Símb. Conc. 
disco 
Diâmetro do Halo de Inibição 
 Resistente Intermediário Sensível 
Amicacina BB 30 mcg ≤ 14 15-18 ≥ 17 
Ampicilina ao testar microorganismos 
gram-negativos e enterococos 
AP 10mcg ≤ 11 12-13 ≥ 14 
Ampicilina ao testar estafilococos e 
microorganismos sensíveis à 
penicilina G 
AP 10 mcg ≤ 20 21-28 ≥ 29 
Ampicilina ao testar 
Haemophilus sp. 
AP 10 mcg ≤ 19 - ≥20 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
39 
Ácido Nalidíxico NA 30 mcg ≤ 13 14 -18 ≥ 19 
Bacitracina BC 10 un. ≤ 8 9-12 ≥13 
Carbenicilina ao testar Proteus sp. e 
E. coli 
CR 100 mcg ≤ 17 18-22 ≥ 23 
Carbenicilina ao testar Pseudomonas 
aeruginosa 
CR 100 mcg ≤ 13 14-16 ≥ 17 
Cefalotina ao relatar sensibilidade a 
todas as cefalosporinas 
CF 30 mcg ≤ 14 15-17 ≥ 18 
Cefoxitina CT - ≤ 14 15-17 ≥ 18 
Clindamicina ao relatar sensibilidade à 
clindamicina e à lindomicina 
CI 2 mcg ≤ 14 15-16 ≥ 17 
Cloranfenicol CO 30 mcg ≤ 12 13 -17 ≥ 18 
Colistina CL 10 mcg ≤ 8 9-10 ≥ 11 
Eritromicina EL 15 mcg ≤ 13 14-17 ≥ 18 
Estreptomicina ET 10 mcg ≤ 11 12 -14 ≥ 15 
Gentamicina GN 10 mcg ≤ 12 13-14 ≥ 15 
Konanilcina KN 30 mcg ≤ 13 14-17 ≥ 18 
Nalidíxico ácido AN 30 mcg ≤ 13 14-18 ≥ 19 
Neomicina NO 30 mcg ≤ 12 13-16 ≥ 17 
Nitrofurantoína NT 300 mcg ≤ 14 15-16 ≥ 17 
Novoblocina NV 30 mcg ≤ 17 18-21 ≥ 22 
Oxocilina OX 6 mcg ≤ 9 10-13 ≥ 14 
Penicilina G. ao testar 
Estafilococos 
PN 10 un. ≤ 20 21-28 ≥ 29 
Penicilina G. ao testar outros 
microorganismos 
PN 10 un. ≤ 11 12-21 ≥ 22 
Penicilina G. PL 500 un. ≤ 8 0-11 ≥ 12 
Polimixina - - ≤ 8 09-11 ≥ 12 
Sulfa-Trimetropim STX 30 mcg ≤ 10 11-15 ≥ 16 
Sulfazotrim (Sulfamotoxazol + 
Trimetoprim) 
SFT 25 mcg ≤ 10 11 -15 ≥ 16 
Sulfonamidas SF 300 mcg ≤ 12 13-16 ≥ 17 
Tetraciclina TT 30 mcg ≤ 14 15-18 ≥ 19 
Tobramicina TB 10 mcg ≤ 12 13-14 ≥ 15 
Vancomicina VC 30 mcg ≤ 9 10-11 ≥ 12 
 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
40 
Exercícios de fixação 
 
1. Qual a diferença entre os métodos de difusão e impregnação em discos? 
2. Por que o método de impregnação do antimicrobiano em discos é mais utilizada? 
3. Qual a importância da inoculação ser realizada de modo correto, permitindo crescimento 
confluente? 
4. Podemos comparar os halos de inibição obtidos com antimicrobianos diferentes ou em 
diferentes concentrações? 
 
Observações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal FluminenseInstituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
41 
Assunto 6: Cocos Gram positivos 
 
Introdução 
 
 Os principais gêneros de Cocos Gram positivos de interesse na área de saúde são o 
Staphylococcus e o Streptococcus, membros da família Micrococcaceae. 
 Em ambos os gêneros, podemos encontrar espécies que compõem a microbiota normal de 
diversas pessoas, como Staphylococcus epidermidis e Enterococcus (antigamente denominado 
Streptococcus faecalis), mas também existem espécies altamente patogênicas, como 
Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. É importante ressaltar que os enterococos não 
são considerados como estreptococos, mas um gênero à parte. Como este gênero foi por muito 
tempo estudado como sendo parte do gênero Streptococcus, ainda hoje é comum estuda-lo junto 
com este, identificando as principais diferenças entre ambos. 
 São gêneros bastante parecidos, causadores de doenças denominadas piogênicas (com 
produção de pus), a principal diferença entre ambos é a produção de catalase por 
Staphylococcus. 
 Ambos os gêneros, Staphylococcus e Streptococcus, são importantes na área de 
alimentos já que podem ser veiculados por alimentos. 
 
Fundamentação teórica 
 
® Staphylococcus 
 
 As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram-positivos, que quando vistos ao 
microscópio aparecem na forma de cachos de uva. São anaeróbias facultativas, com maior 
crescimento em condições aeróbias, quando produzem catalase. São amplamente distribuídos na 
natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves 
(encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). 
 De todas as espécies existentes, as de maior interesse humano são Staphylococcus 
aureus, Staphylococcus epidermidis, e Staphylococcus saprophyticus. 
Para diferenciação d a espécie, utilizamos as provas de fermentação do manitol, da coagulase, 
DNAse, sensibilidade à novobiocina e redução de nitrato. 
 A espécie S. aureus é a que está mais freqüentemente associada a doenças 
estafilocócicas, sendo de origem alimentar ou não, está geralmente envolvida em infecções 
humanas (de origem comunitária e hospitalar) e apresenta uma freqüência de 30 a 40% de 
portadores na população. 
 São bactérias mesófilas, com crescimento na faixa de 7ºC a 47,8ºC, e as toxinas são 
produzidas entre 10ºC e 46ºC, com ótimo entre 40ºC e 45ºC. Quanto mais baixa for a 
temperatura, mais tempo será necessário para produzir enterotoxinas. 
 São bactérias tolerantes a concentrações de 10% a 20% de NaCl, sendo este um fator de 
estimulação da produção da coagulase. Também são tolerantes a altas concentrações de nitratos. 
 Crescem em faixa de pH de 4 a 9,8, com ótimo entre 6 e 7. E possuem capacidade de 
crescer em valores de atividade aquosa inferior à muitas bactérias, até entre 0,86-0,83. 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
42 
 São inibidos pela presença de corantes do tipo azul de metileno e violeta de genciana. 
Crescem em meio de Agar simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colônias são redondas, 
elevadas, opacas e de coloração amarelo dourado a branca. 
 A intoxicação por S. aureus é causada quando se ingerem alimentos onde haja a toxina 
pré-formada, que só é liberada em concentrações entre 105 a 106 UFC/ g do alimento. Logo, se for 
controlada a proliferação do microorganismo não haverá risco de intoxicação. As enterotoxinas 
produzidas por S. aureus são proteínas simples, higroscópicas, facilmente solúveis em água e 
soluções salinas, resistentes a tripsina, quimiotripsina, renina, papaína e pepsina, e algumas 
cepas são resistentes até a vancomicina. São também termorresistentes. É importante observar 
esse detalhe, já que a maioria dos alimentos sofre um tratamento térmico durante o 
processamento, mas se já houver a toxina formada no alimento, esta não será inativada. 
 Como já foi dito, mecanismo de prevenção deve ser feito no sentido de evitar a proliferação 
do microorganismo para a não formação das enterotoxinas, o que pode ser feito através da 
manutenção dos alimentos sob refrigeração, ou manter os alimentos a uma temperatura ≥ 60ºC 
pós-preparo. 
 As principais provas para identificação das principais espécies de Staphylococcus estão 
descritas na tabela a seguir: 
 
Provas Bioquímicas S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus 
Cocos Gram-positivos + + + 
Pigmentação Colonial Amarela ou Branca Branca Branca 
Catalase + + + 
Coagulase + / - - - 
Fermentação do Manitol + - - 
DNAse + - - 
Sensibilidade a Novobiocina R S R 
Redução de Nitratos + - 
 
® Streptococcus 
 
 As bactérias do gênero Streptococcus também são cocos Gram-positivos, mas dispostos 
em pares ou fileiras, ao contrário de Staphylococcus. Outra diferença entre Streptococcus e 
Staphylococcus é a não produção de catalase por Streptococcus. 
 Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na orofaringe), 
apesar disso, muitos deles são responsáveis por uma variedade de manifestações clínicas, sendo 
considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A 
maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adição de sangue para o crescimento. 
 São utilizadas dois tipos de classificação para diferenciar as espécies: potencial hemolítico 
(a, b e g) e os grupos de Lancefield (determinado por um carboidrato da parede celular), cujos 
principais grupo são o A e o B. 
 O gênero apresenta espécies de interesse médico como: Streptococcus viridans, 
Streptococcus b hemolíticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e 
Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um gênero separado e 
possuem características peculiares: são resistentes a variações de temperatura (15-45ºC) e a 
Universidade Federal Fluminense 
Instituto biomédico 
Departamento de Microbiologia e Parasitologia 
 
43 
pressão osmótica (até 6,5 % de NaCl). São membros da microbiota normal do trato gastrintestinal 
de diversas pessoas. 
 O gênero Streptococcus é composto de bactérias anaeróbias facultativas, com maior 
crescimento em atmosfera com 10% de CO2. 
 Possuem atividade hemolítica, fator importante para a classificação das cepas patogênicas 
em a (hemólise parcial), b (hemólise total) e g (anemolítico). 
 Os estreptococos a hemolíticos apresentam zonas de hemólise, possuindo hemácias 
íntegras na parte mais interna junto a colônia, e hemólise maior na parte mais externa. 
Freqüentemente, aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da 
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana e conseqüente liberação de biliverdina 
e bilirrubina), que originou a qualificação "estreptococos do grupo esverdescente" ou 
Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de 
pneumonia, apresentam hemólise a, uma colônia puntiforme com um aprofundamento no ápice da 
colônia (parecendo um pequeno vulcão). 
 Os estreptococos b hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se observando 
hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes 
apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio 
atmosférico e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar sangue. 
 A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias 
crescidas na superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam 
hemolisina O, se torna necessária a semeadura do germe pela técnica em profundidade ("pour-
plate") , ou a realização de perfurações ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubação 
em atmosfera pobre em oxigênio (técnica da jarra com vela). 
 Os estreptococos g não produzem hemólise, são anemolíticos, isso significa que não têm