MICROSCOPIA (resumo de aula)

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Johann Giovanni Faber de Bamberg - Nome Microscópio: 1624 -
Micro = pequeno 
Skopein = ver, examinar
Robert Hook, observa os poros da cortiça e denomina Célula.1625 -
Histórico:
XIV - Lentes para correção de visão
XVI - Galileu criou luneta
XVI - Holandês Antonie van Leeuwnhoek criou primeiro microscópio
XVII - Holandês Zacharias Janssen criou Microscópio composto 
Unidades de medidas em microscopia
MO = micrômetro 
ME = nanômetro 
1 
1 
1 
Níveis microscópicos em biologia
Unid de medida Valor Mét de estudo Estrutura visualizada
Milímetro -3 Olho, lupa Órgãos, tecidos, células grandes
Micrômetro -6 Microscopias de luz Tecidos, células, organoides grandes
Nanômetro -9 ME, microscopia de polarização Componentes subcelulares, vírus, 
macromoléculas
Ângstrom -10 ME, difração de raios X, microscopia 
de efeito túnel 
Estrutura molecular, estrutura atômica
MICROSCÓPIO ÓPTICO OU COMPOSTO (mais usados)
MISCROSÓPIO DE LUZ ÓPTICA:1)
Tem uma parte mecânica e uma parte óptica
Ampliação:
Objetiva X Ocular
Poder de resolução: •
Mais importante.
São os detalhes que podemos observar
PR Comprimento da onda de luz 
 Abertura numérica da objetiva (NA)
Limite de resolução: menor distancia entre dois pontos visto a olho 
humano = 0,1mm ou 
LR é inversamente proporcional ao PR
Quanto < LR da lente > o PR do microscópio
 
 
 
Poder de penetração:
São os diferentes planos de penetração na mesma posição do foco.
É inversamente proporcional à NA e ao aumento da lente
Quanto > poder de penetração, < AN e < Aumento da lente
Poder de definição:
Torna a imagem clara e com contornos definidos
Distância frontal:
Distância entre a preparação da lâmina e a lente inferior da objetiva.
Objetivas secas:
Mais usadas, normalmente são:
4x, 10x, 20x, 40x.
1.Microscópio de luz
2.Microscópio de campo escuro
3.Microscópio de contraste de fase
4.Microscópio de contraste interferencial 
5.Microscópio de polarização
6.Microscópio de fluorescência
7.Microscópio confocal a laser
MICROSCOPIA
 Página 1 de Resumo Júlia Damé Paschoal 
K - constante = 0,61
 - comprimento de onda de radiação
NA - abertura numérica
 M de luz = 0,2 
 M Eletrônico = 2 a 10 
LR para: olho humano = 0,1 mm = 100 
Cálculo do aumento real:
Aumento real x aumento da objetiva
4x10 = 40 40x de aumento com a primeira objetiva
Índice de refração:
Relação entre a velocidade da luz no vácuo e a velocidade da luz em 
determinado meio
Objetiva de imersão:
Evita a dispersão dos raios luminosos, que passam pela "lâmina-óleo"
Óleo de imersão: tem IR (1,5), semelhante ao vidro
 AN = n x sen α
n= índice de refração do espaço entre a preparação e a objetiva
sen α = semi-ângulo de abertura da objetiva
Distância ocular:
Ajustada de acordo com a distância inter-pupilar do observador.
Ajuste da dioptria (grau):
Corrige o foco de acordo com a acuidade visual de cada um
Campo microscópico:
Transportar na posição vertical, uma mão no braço e outra apoiando a base1.
Nunca tocar nas oculares e objetivas2.
Não arrastar3.
Limpar com pano limpo, e/ou álcool-éter4.
Terminar de observar e: diminuir intensidade luminosa, desligar lâmpadas baixar a mesa e girar o 
revolver com a menor objetiva para baixo
5.
Cuidados com o microscópio:
MISCROSÓPIO DE CAMPO ESCURO:2.
Usado um condensador especial que inclina a luz, ela não atravessa o objeto estudado
A luz é dispersada pela superfície dos materiais que tem diferentes índices de refração, fazendo com que somente os raios 
luminosos que atingirem o objeto na lâmina entrem na objetiva.
Quando a luz atinge o objeto ela desvia pelo resto do sistema (objetivas e oculares) formando a imagem
Usado para estudar material NÃO CORADO SUSPENSOS EM LÍQUIDOS: organismos vivos como células, bactérias, plâncton, etc.
FICA TUDO EM 
PRETO E BRANCO, 
MUITO PRETO
MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE FASE3.
Holandes Zerniké
Baseado na difração da luz
O caminho do feixe luminoso na formação da imagem sofre um retardo óptico permitindo a visualização de materiais sem coloração
Retardo da luz é feito por 2 anéis metálicos colocados no caminho da luz, um no condensador e outro nas objetivas.
Usado para estudar: células vivas, bactérias, algas, protozoários, etc.
TUDO MEIO 
ESCURO COMO SE 
FOSSE SOMBRAS,
MOSTRA OS 
CONTORNOS 
"BRUSCOS"
 Página 2 de Resumo Júlia Damé Paschoal 
MICROSCÓPIO DE CONTRASTE DE INTERFERENCIAL/ NOMARSKI4.
É o interferêncial mais conhecido, permite o aumento do relevo das superfícies do abjeto analisado
Tem dois prismas ópticos colocados no caminho da luz, para modificar a fase da onda luminosa, que contrasta com o meio onde está o material analisado.
Usado em materiais não corados como cultura de células e parasitologia
MOSTRA CONTORNOS, 
MELHOR DETALHADO, 
MEIO SOMBREADO
Fótons da fonte de 
luz de alta pressão
Anisotrópicio: são birrefringente (IR diferente)
Isotrópico: não é refringente (mesmo IR)
MICROSCÓPIO DE FLUORESCÊNCIA6.
Parecido com o M. de luz com mais dois prismas ou dois discos polaroides
Polarizador: fica entre a fonte de luz e o condensador
Analisador: Fica entre a objetiva e a ocular
Os filtros conduzem o feixe luminoso em uma só direção, é o PPL, plano de luz polarizada.
Baseado na captação de ondas evanescentes emitidas pelas células, já que estas se dispersão e se perdem com o tempo.
Para estudar células no meio aquoso, onde a lâmina tem IR maior que a célula.
Permite observação dos pontos de contato entre a célula-viva e o substrato, ou processos dinâmicos da membrana e vesículas.
As amostras preparadas para o MO fluorescente perde a fluorescência em até 2 dias
Com o TIRF as chances de as amostras não sofrer alteração é maior = 80-90%
 polarizador
 analisador
Permite visualizar até 50nm (0,00000005m), mostrando nanoscópio.
Amostra é iluminada por um feixe de laser.
Os fluorocromos se combinam com estruturas celulares, tornando-se fluorescentes, permitindo sua identificação 
e localização.
Ex. alaranjado de acridina se liga ao DNA e fica amarelo e ao RNA que fica vermelho.
MOSTRA ALGUMAS 
LINHAS E CONTORNOS, 
COLORIDOS
IMAGENS BEM 
COLORIDAS, CORES 
FLUORESCENTES, 
BEM VIVAS
Usado para o estudo do músculo estriado, parede celular, espermatozoides, osso, esmalte dentário, 
dentina e DNA
Filtro de excitação
Fótons de comprimento determinado
MICROSCÓPIO TIRF (TOTAL INTRNAL REFLECTION FLUORESCENCE)6.
MICROSCOPIO DE POLARIZAÇÃO5.
Quando a amostra é iluminada por baixo com um feixe de laser, que incide com determinado ângulo, toda luz que passa pela lâmina é refletida e NÃO 
atravessa a amostra devido às diferenças nos índices de refração.
Quando a luz chega nas proximidades da amostra ela é capaz de gerar um campo eletromagnético, a partir do fluorocromo. O campo eletromagnético 
permite que a luz se propague no meio de menor IR "campo evanescence"
Tem um sistema óptico que interage pouco com a luz. A luz é de mercúrio de alta pressão, com picos de 312 e 579 nm
Tem um sistema de filtros que detectam o brilho do material contra um fundo negro.
Filtro de excitação: ficam logo após a saída da fonte de luz e antes do condensador, selecionam o comprimento de onda desejado
Filtro de barragem: Ficam entre a objetiva e a ocular, permitem a passagem da luz fluorescente emitida pelo espécime analisado, barrando a luz de
excitação. O material floresce contra um fundo escuro.
Os filtros de barragem são selecionados pelo observador na hora do uso de acordo com o fluorocromo usado.
Filtro de barragem
Luz fluorescente emitida pelo objeto
 Página 3 de Resumo Júlia Damé Paschoal 
Acima da objetiva há um orifício chamado "pinhole ou íris" que bloqueia a luz provenientede objetos que estejam fora do 
plano focal.
SÓ UM plano de corte é analisado de cada vez
Estuda-se o detalhe das estruturas subcelulares que não tem limite de resolução compatível com o MO fluorescente 
convencional
Ex. microtúbulos, elementos fibrilares do citoesqueleto e elementos finos da matriz extracelular.
MICROSCÓPIO CONFOCAL POR VARREDURA A LASER7.
1987, usado em materiais espessos, sem coloração, vivos ou pré-fixados
Microscópio tradicional = imagem analógicas, confocal a laser = imagem digital
A óptica = microscópio de fluorescência, mas usa laser como fonte de luz.
A iluminação não ocorre em todo campo, só em pequenos pontos de iluminação pelo laser (como se fosse pixels)
IMAGENS 
COLORIDAS MUITO 
BONITAS
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
1931, Max Knoll e Ernest Ruska construíram o primeiro microscópio eletrônico
Princípio da ME são os mesmos do Microscópio de luz exceto:
-Fonte geradora dos feixes de elétrons fica na porção superior do aparelho
-Imagem não é invertida
ME TRANSMIÇÃO1.
Os elétrons devem interagir com o objeto extremamente fino para gerar a imagem
Uma fonte geradora disposta em uma coluna um sistema de alto vácuo, libera os elétrons que passam por lentes ou bobinas 
eletromagnéticas.
Os feixes de elétrons são acelerados e se desprendem do filamento por diferença de potencial
Os elétrons saem da fonte geradora, são encaminhados para a Lente condensadora dos feixes, que os direciona para o objeto
A lente intermediária e a lente protetora ampliam o padrão de transparência dos elétrons
A imagem ampliada é projetada sobre:
Um anteparo fluorescente, uma placa fluorescente, um negativo fotográfico ou câmera CCD 
(monitor)
Quando os elétron encontram elementos como ferro, ósmio, chumbo ou ouro, formam uma 
imagem eletrodensa ou escura.
Quando encontra elementos como o hidrogênio, carbono, nitrogênio ou oxigênio a imagem é 
eletrolúcida ou clara.
PRETO E BRANCO
MOSTA OS CONTORNOS E OS MEIOS BEM DEFINIDOS 
TONS DE CINZA
 Página 4 de Resumo Júlia Damé Paschoal 
ME VARREDURA2.
Revela superfícies topográficas com grande nitidez de detalhes
As imagens são 3D e são obtidas por elétrons secundários ou refletidos
A imagem se forma quando a superfície da amostra é bombardeada pelo feixe de eletrônico
Um sistema de captação de elétrons secundários coleta o sinal e o amplifica
Finalmente, imagem é visualizada em um monitor.
3D
MO X ME
Aspectos de comparação Microscopia de luz convencional Microscopia eletrônica de transmissão
Fonte Luz Visível Elétrons
Lentes De vidro Eletromagnéticas
Limite de resolução 200nm 0,2nm
Formação de imagem Absorção Elétron-opacidade
Tamanho do objeto x microscópio
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 Página 6 de Resumo Júlia Damé Paschoal