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UNIOESTE - UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS – CCA
CURSO DE ZOOTECNIA
RELATÓIO DE AULA PRÁTICA REFERENTE AO DIA 18 E 26 DE SETEMBRO DE 2013.
Discentes: Cléber Luís Sônego
Fernanda Daiele Thomé Brisqueleal
Gabriela Glaeser Sangalli
Guilherme Luis Tesser
Disciplina: Microbiologia
Docente: Emerson Chambó
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
Estado do Paraná
2013
AULA I
Introdução
	No dia 18 de setembro de 2013 foi realizada a aula prática de microbiologia, que foi ministrada pela mestranda Jaqueline Wobeto e o professor Dr. Emerson Chambó.
	A aula teve por finalidade apresentar aos alunos as técnicas de elaboração de placas de Petri com meios de cultura PCA e VRB e também as técnicas de semeadura. As técnicas de semeadura permitem o cultivo de micro-organismos nos meios de cultura. A escolha da técnica para o cultivo de micro-organismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo.
As técnicas de cultivo usadas na aula prática foram técnicas de estrias, espalhamento em placa e pour plate.
O método de estrias também é chamado de esgotamento de alça. Através de uma alça de platina, de um fio de platina ou até mesmo um swab, coleta-se uma pequena parcela do meio de inóculo e o espalha sobre uma placa de Petri com ágar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um caminho na forma de estrias. Existem várias possibilidades de fazer essas estrias, sendo ela descontínua ou contínua (DROVAL, LIMA e HABU, 2001).
Na técnica de espalhamento, um pequeno volume da solução de micro-organismos é transferido para o centro de uma placa de ágar já solidificado com o auxílio de uma pipeta estéril. Em seguida, mergulha-se uma alça de Drigalski em álcool e a flamba de modo a manter todo o material estéril. Com o auxílio dessa alça, espalha-se aquele volume depositado por toda a superfície do ágar. As colônias cresceram espalhadas por toda a superfície do ágar. (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002)
O método de semeadura por derramamento, ou também denominado de pour plate é muito utilizado para bactérias e fungos. Um pequeno volume da melhor diluição é então derramado em uma placa de Petri sem ágar. Em seguida, derrama-se ágar fundido na temperatura de 45ºC e mistura-se os dois com uma agitação leve da placa e deixa-se o meio solidificar ( TORTORA et al., 2006).
	
Objetivos
	O objetivo da aula prática foi demonstrar aos acadêmicos as técnicas de elaboração de uma placa de Petri com os meios de cultura PCA e VRB, como também as técnicas de semeadura por estrias, pour plate e espalhamento.
Materiais
Balança analítica – para pesar as amostras utilizadas com mais precisão;
Bico de Bunsen – chama de fogo, utilizado para que não ocorra contaminação na manipulação das culturas;
Béquer e Erlenmeyer – utilizado para dissolver soluções;
Tubo de ensaio – usado para experiências de pouco volume;
Placas de Petri – servem para colocar os meios de culturas sólidos para obter o crescimento de micro-organismos;
Pipetas automáticas e graduadas – utilizada na transferência de quantidades exatas de amostras de um local para o outro;
Alça de platina – alça de transferência que também é utilizada para fazer estrias nos meios de cultura.
Alça de Drigalski – alça de vidro usada para espalhar o meio de cultura na placa;
Lâmina – usada para analisar os micro-organismos em microscópios.
Lamínula – coloca-se em cima do material da lâmina.
Metodologia
O meio PCA utilizado nesta aula foi preparado na aula anterior, já o meio VRB teve de ser preparado:
Pesou-se 20,27 gramas do meio VRB para diluição em 500 ml de água;
Aqueceu-se o vidro com PCA no micro-ondas até atingir temperatura morna, ou até que o manipulador conseguisse segurá-lo. Depois de aquecido os vidros com PCA ficaram em banho maria para não endurecer novamente;
Pesou-se 25 gramas de amostra de silagem em um béquer;
Transferiu-se a amostra um erlenmeyer contendo 225 ml de água destilada, misturando-a bem;
Colocou-se 9 ml de água destilada em 4 tubos de ensaio com auxilio de pipeta volumétrica;
Retirou-se 1 ml do liquido do erlenmeyer e transferiu-o ao primeiro tubo de ensaio denominado 10² ou segunda diluição.
Retirou-se 1 ml do tubo de ensaio com a segunda diluição e transferiu-o ao segundo tudo de ensaio denominado 10³ ou terceira diluição.
Retirou-se 1 ml do tubo de ensaio com a terceira diluição e transferiu-o ao terceiro tubo de ensaio denominado 104 ou quarta diluição.
Retirou-se 1 ml do tubo de ensaio com a quarta diluição e transferiu-o ao quarto tubo de ensaio denominado 105 ou quinta diluição. 
As diluições foram entregues aos alunos e cada um deles recebeu 3 placas de Petri para fazer seus meios de cultivo. 
Identificou-se as placas de Petri com o nome do aluno, número da amostra, número da diluição e nome da técnica usada para cultivar o meio.
1ª Placa: Meio de cultivo com VRB com técnica Pour Plate – Adição do inóculo em placa sem meio, adição de ágar fundido misturando-o com agitação suave.
Cada aluno colocou 1 ml de sua diluição em sua placa com auxilio de pipeta automática.
Posteriormente foi colocado meio de cultivo VRB até completar o fundo da placa e movimentou-a sobre a bancada num movimento suave em formato de oito. 
2ª Placa: Meio de cultivo com PCA com técnica de espalhamento em estrias – Adição do inóculo em meio de cultura PCA com espalhamento em estrias. 
Colocou-se meio PCA na placa até cobrir o fundo e esperou endurecer. 
Cada aluno pegou uma gota de sua diluição com auxilio da alça de metal e transferiu-a suavemente sobre o meio de cultura fazendo estrias em zigue-zague. Primeiramente foram feiras estrias na parte lateral direita, depois na parte superior e por ultimo na parte lateral esquerda. 
As estrias devem ser feitas suavemente para não danificar o meio de cultura. 
3ª Placa: Meio de cultivo PCA com técnica de espalhamento em placa – Adição de inóculo em placa contendo meio de cultivo PCA com espalhamento em toda a superfície.
Colocou-se meio PCA na placa até cobrir o fundo e esperou endurecer. 
Cada aluno pegou uma 1 ml da sua diluição com pipeta automática e adicionou-a na placa. 
Espalhou-se a amostra com auxilio da alça de Drigalski. 
Depois de prontas as placas com meio de cultivo PCA permaneceram em estufa a 35ºC por 42 horas e as placas com meio de cultivo VRB por 72 horas. 
Conclusão
Podemos concluir que a finalidade básica das técnicas de semeadura é permitir a transferência (inoculação) de bactérias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreção, alimento, etc) ou de um meio de cultura para outro garantindo que apenas os micro-organismos em questão sejam semeados.
Concluiu-se também que a forma com que é feito o meio de cultivo é de crucial importância para a qualidade do desenvolvimento da colônia, já que os alunos não tinham experiência com tal atividade, a maioria das placas não desenvolveu colônias corretamente. 
Aula II 
Introdução
Nesta aula prática fez-se a preparação e coloração das lâminas para análise de colônias no microscópio e a contagem das mesmas, através do aparelho Quebec. 
Os microbiologistas usam técnicas de coloração para mostrar as várias estruturas dos micro-organismos, para identificar suas estruturas internas e para ajudar a identificar e separar micro-organismos similares (PELCZAR JR, 1996). 
Objetivo 
O objetivo da aula prática foi apresentar as técnicas de contagem de micro-organismos, identificação de bacilos e cocos de bactérias gram-positivas e a coloração de lâminas com utilização de um kit com os seguintes reagentes: violeta de genciana, lugol fraco, solução descolorante e fucsina fenicada. 
Materiais
Kit com 4 reagentes (violeta de genciana, lugol fraco, solução descolorante e fucsina fenicada);
Bico de Bunsen;
Colônia de bactéria e de fungo; 
Lâminas e lamínulas;
Alça de metal;
Soro fisiológico;
Água destilada;
Microscópio;
Quebec – utilizado na contagem de colônias bacterianas. 
MetodologiaPreparação de lâmina de Bactéria:
Flambou-se a alça de metal até mudar de cor;
Pegou-se uma gota de soro fisiológico e colocou-a na lâmina;
Flambou-se a alça novamente e pegou uma colônia de bactéria com cuidado para não pegar o meio de cultura;
Esfregou-se a alça contendo a colônia sobre o soro e esperou secar naturalmente. 
 
Coloração da lâmina de bactéria:
Colocou-se o primeiro reagente – violeta de genciana – com o conta gotas até cobrir a amostra, deixando-o agir por um minuto. Em seguida enxaguou-se com água destilada;
Colocou-se o segundo reagente – lugol fraco – até cobrir a amostra, deixando-o agir por um minuto. Em enxáguo-o com água destilada;
Colocou-se o terceiro reagente – solução descolorante – em gotejamento até descolorir a lâmina. 
Colocou-se o quarto reagente – fucsina fenicada – que caracteriza a bactéria como gram-positiva ou gram-negativa. Esperou-se um minuto, deixando-o agir e depois a lâmina foi enxaguada com água destilada. 
Preparação de lâmina de Fungo:
Colocou-se apenas uma gota de lugol sobre a lâmina;
Flambou-se a alça de metal e passou-a sobre a placa contendo o fungo. Pegou-se o centro do fungo, pois é o local onde ele esta se desenvolvendo.
Colocou-se o material na lâmina com lugol.
Colocou-se a lamínula sobre a amostra, apertando-a.
A Lâmina de fungo não precisa passar pelo processo de coloração. 
Contagem de colônias de bactéria 
Materiais
Aparelho Quebec; 
Lâmina com proliferação bacteriana;
Metodologia
Pegou-se a lâmina e colocou-a no contador;
Foram feitos 4 quadrados com caneta sobre a placa;
Contou-se as colônias presentes dentro destes quadrados;
O numero de colônias dos quatro quadrados dividiu-se por 4;
Multiplicou-se por 62, que é a área da placa; 
O resultado desta multiplicação é a quantidade de colônias nesta placa, que deve ser comparado com os valores aceitáveis na literatura.
Conclusão:
 Podemos concluir que a finalidade básica da técnica de coloração é a diferenciação da coloração da parede de bactérias gram positivas e gram negativas. Bem como a diferença na preparação de lâminas de fungos e bactérias. 
Já a técnica de contagem nos possibilitou uma estimativa total de bactérias em UFC/g. Concluindo que a estimativa de bactérias ultrapassou a estimativa permitida que varia de 30 – 300 UFC/g.

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