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TRANSCRIÇÃO SÍNTESE DE RNA TRANSCRIÇÃO SÍNTESE DE RNA - TRANSCRIÇÃO PROCESSO PELO QUAL UMA MOLÉCULA DE RNA É SINTETIZADA A PARTIR DA INFORMAÇÃO CONTIDA NA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DE UMA MOLÉCULA DE DNA DE FITA DUPLA. DNA É O CONJUNTO DE INFORMAÇÕES GENÉTICAS QUE GOVERNAM TODAS AS ATIVIDADES CELULARES. ESTAS INSTRUÇÕES SÃO REALIZADAS ATRAVÉS DA SÍNTESE DO RNA E DAS PROTEÍNAS. TRANSCRIÇÃO SÍNTESE DE RNA - TRANSCRIÇÃO O funcionamento de uma célula é determinado não apenas por quais genes ela herda, mas também por quais destes são expressos em um dado momento. Células dos músculos Células do fígado CONTÉM OS MESMOS GENES Células da pele As diferenças destas células não são determinadas por diferenças em seus genomas, mas sim por padrões regulados de expressão dos seus genes que direcionam o desenvolvimento e a diferenciação. A regulação da expressão gênica permite às células se adaptarem a mudanças no ambiente e são responsáveis pelas diferentes atividades dos vários tipos celulares. TRANSCRIÇÃO - PROCESSO PARA SÍNTESE DE TODOS OS RNAS DA CÉLULA - REFLETE O ESTADO FISIOLÓGICO DA CÉLULA - O CONJUNTO DE GENES EXPRESSOS EM UMA DADA SITUAÇÃO É VARIÁVEL - PROCESSO CATALISADO PELAS RNAS POLIMERASES (RNAP) SÍNTESE DE DNA: PRECISA, UNIFORME E INVARIÁVEL SÍNTESE DE RNA: VARIÁVEL ( ESTADO FISIOLÓGICO) TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO TRADUÇÃO TRADUÇÃO SÍNTESE DE RNA: VARIÁVEL TRANSCRIÇÃO PRINCIPAIS TIPOS DE RNA mRNA (RNA mensageiro): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos das proteínas (1 a 5% do RNA total) tRNA (RNA transportador): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo (10 a 15% do RNA total) rRNA (RNA ribossômico): constituinte dos ribossomos, local da síntese de proteínas (~75% do RNA total – 100 a 5000 cópias dos genes para rRNA) OUTROS TIPOS DE RNA DE EUCARIOTOS hnRNA (RNAs heterogêneos nucleares): precursores dos mRNAs snRNA (pequenos RNAs nucleares): ligados a proteínas, formando as ribonucleoproteínas (snRNP) com funções na síntese de mRNAs funcionais ribozimas: RNAs pequenos localizados no núcleo e no citoplasma – funções estruturais ou catalíticas. TRANSCRIÇÃO DNA FITA CODIFICADORA DNA FITA MOLDE RNA TRANSCRITO RNA-POLIMERASES (RNAPs): -reconhecem e ligam-se a sequências específicas de DNA - separam (desnaturam) a hélice dupla do DNA , expondo a sequência de nucleotídeos a ser copiada - mantêm as fitas de DNA separadas na região de síntese - mantêm estável o híbrido DNA:RNA na região de síntese - renaturam o DNA na região imediatamente posterior à da síntese - terminam a síntese do RNA sozinhas ou com auxílio de proteínas específicas. TRANSCRIÇÃO REAÇÃO IDÊNTICA À DAS DNA-POLIMERASES. SENTIDO 5’ 3’ SÍNTESE DE RNA: FORMAÇÃO DA LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER ENTRE O GRUPO 3’OH DE UM RIBONUCLEOTÍDEO DA CADEIA CRESCENTE E O GRUPO FOSFATO DO CARBONO 5´ DO RIBONUCLEOSÍDEO TRIFOSFATADO QUE SERÁ INCORPORADO. A FITA DE DNA COPIADA É A DE SENTIDO 3’ 5’ NÃO PRECISAM DE INICIADOR/PRIMER PARA INICIAR A SÍNTESE DO RNA. TRANSCRIÇÃO RNA POLIMERASE DE E.coli Holoenzima = enzima completa 2’ Núcleo Enzimático (enzima core) 2’ Fator (sigma) Polimerização dos ribonucleotídeos/ Síntese de RNA a partir de um DNA molde Reconhece onde se inicia a transcrição TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO subunidade número gene função PM (Daltons) 2 rpoA Ligação ao promotor 40.000 1 rpoB Ligação ao nucleotídeo 155.000 ’ 1 rpoC Ligação ao molde 160.000 1 rpoD iniciação 85.000 RNA POLIMERASE DE E.coli TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO 3 Fases: - INÍCIO: reconhecimento de sequências específicas no DNA (promotor) e formação do complexo de iniciação (abertura do DNA) - ALONGAMENTO: incorporação dos ribonucleotídeos sucessivamente - TERMINAÇÃO: interrupção da síntese pelo reconhecimento de seqüências específicas (terminador) TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO PROCESSO DE TRANSCRIÇÃO INÍCIO: RNAP ligada frouxamente à dupla hélice do DNA, desliza e reconhece sequências específicas no início de um gene, o promotor, que sinaliza exatamente onde a síntese do RNA deve ser iniciada – sítio de início (+1). -10 -5 +1 +5 +10 5’GATAATGGTTGCATGTACTAAGC3’ a montante (upstream) a jusante (downstream) TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO PROMOTOR -primeiro nucleotídeo transcrito (+1 = sítio de início de transcrição) -geralmente purina (A ou G) -duas regiões conservadas: região –10 (TATAAT) – TATA box ou Pribnow box região –35 (TTGACA) -distância entre regiões –10 e –35 - 16 a 18 nucleotídeos, crítica para a ligação da RNA polimerase. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO PROMOTOR - Regiões –10 e –35 definem os promotores de E.coli para a RNAP quando o fator é o 70. DISTINTOS FATORES SIGMA RECONHECEM PROMOTORES DIFERENTES COM SEQÜÊNCIAS CARACTERÍSTICAS NAS REGIÕES – 10 E –35 Fator 70 reconhece a maioria dos genes de E. coli. Fatores específicos para respostas metabólicas rápidas. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO Fatores isoladamente, não se ligam ao DNA. Quando presentes na holoenzima, modificam a afinidade do complexo para reconhecer sequências específicas. Alguns promotores dependem da ligação de proteínas acessórias para serem reconhecidos – elas reconhecem sequências que são próximas aos promotores ou se sobrepõem a eles. TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO Fase de Reconhecimento do promotor pela holoenzima passa por duas etapas: formação do complexo de iniciação e iniciação abortiva. Enquanto o fator permanecer ligado à RNAP, ela não se desloca, permanecendo na iniciação abortiva – enzima reinicia a síntese produzindo oligonucleotídeos de 2 a 9 pb. Início da Transcrição Reconhecimento e Ligação ao promotor Deslocamento da subunidade sigma Complexo fechado: RNAP ligada ao promotor Complexo aberto: abertura das fitas do DNA (formação da bolha de transcrição na região -10) ALONGAMENTO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO ALONGAMENTO O desligamento do fator do complexo permite a RNAP deslocar-se e iniciar a fase de alongamento. Alteração conformacional da RNAP após desligamento do fator . Fase de Após saída início fator cobre 70 pb 30 pb - fator e promotor livres podem iniciar outro ciclo de transcrição em um mesmo gene vários complexos RNAP funcionando simultaneamente, em diferentes estágios. ~18 pb (bolha) ~12 pb (RNA:DNA) hélice do tipo A TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS ALONGAMENTO Bolha de transcrição Fita molde RNA polimerase Direção da transcrição 5´ 3´ RNA-DNA Híbrido (8pb) Durante a etapa de alongamento a RNAP: •abre a dupla hélice à frente; •mantém a hélice aberta e o híbrido DNA:RNA; •reconhece se o ribonucleotídeo a ser incorporado é o correto; •cataliza a reação de incorporação dos ribonucleotídeos; •libera a cadeia de RNA sintetizada; e •refaz o pareamento da dupla hélice do DNA. A inclusão de um ribonucleotídeo à molécula de RNA leva a: • liberação de um nucleotídeo do RNA da bolha de transcrição, desnaturação de um par de bases do DNA à frente da bolha, pareamento, renaturação, de uma par de base do DNAatrás da bolha, movimentação da RNAP um nucleotídeo sobre a fita de DNA. TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS ALONGAMENTO Movimento da RNAP: •Superenrolamentos positivos à frente da bolha de transcrição. •Superenrolamentos negativos na região oposta. TOPOISOMERASES – cortes para liberar tensão gerada. TRANSCRIÇÃO Velocidade de transcrição: Variável seqüências ricas em GC velocidade reduzida – mais resistentes à desnaturação Pausas em algumas regiões ocorrem paradas da transcrição – complexo não é desfeito também podem ocorrer, em procariotos, devido ao acoplamento dos processos de transcrição e tradução TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS Complexo aberto Complexo fechado Início da transcrição Liberação do fator sigma Alongamento da cadeia de RNA Abertura da dupla fita de DNA na região do sítio de início de transcrição Ligação da polimerase às seqüências -35 e -10 TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Seqüências no DNA determinam o fim da transcrição. Desestabilização do complexo de transcrição 2 mecanismos em E. coli: Terminação rho () independente e terminação dependente • 90% da transcrição em E. coli • região 3’ do gene, na fita molde – sequência de terminação com ~40 pb, com porção terminal rica em GC contendo repetições invertidas e sequência de 6 ou mais As. Molde (DNA) 5’ –TAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTT- 3’ 3’- ATTAGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAA- 5’ Seqüências repetidas e invertidas Transcrito (RNA) 5’ UAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUUUUUU-OH 3’ TERMINAÇÃO RHO () INDEPENDENTE TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Molde (DNA) 5’ –TAATCCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTT- 3’ 3’- ATTAGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAA- 5’ Seqüências repetidas e invertidas Transcrito (RNA) 5’ UAAUCCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUUUUUU-OH 3’ TERMINAÇÃO RHO () INDEPENDENTE ESTRUTURA FORMADA – GRAMPO DE TERMINAÇÃO - LEVA À LONGA PAUSA. PAUSA ASSOCIADA À REGIÃO A:U DESESTABILIZA DNA:RNA •desligamento do RNA do sistema provoca a ruptura do complexo de transcrição e as fitas do DNA são renaturadas proteína NusA auxilia este processo. Estabiliza o grampo de terminação. Transcrito formando grampo de terminação TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS Terminação da transcrição através da formação do grampo de terminação TERMINAÇÃO RHO () INDEPENDENTE TRANSCRIÇÃO • depende de uma proteína chamada (hexâmero - unidades de ~50 kDa.). •ATPase – na presença de ATP liga-se ao RNA, envolvendo ~80 nt • in vitro helicase – separa DNA:RNA •Não ocorrem estruturas tão evidentes. •Seqüências de terminação nos 100 pb antes do último nucleotídeo a ser incorporado. •Ausência de torna sequências inativas terminação não ocorre. TERMINAÇÃO RHO () DEPENDENTE Proteína e pausa da transcrição desestabilização do complexo de transcrição fim da transcrição TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO TERMINAÇÃO RHO () DEPENDENTE Pausa da RNA polimerase na sequência de terminação . Rho alcança a enzima Rho desfaz o híbrido RNA-DNA TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO Complexo fechado Complexo aberto Fator sigma RNA polimerase promotor TRANSCRIÇÃO RNA é processado no núcleo Tradução no citoplasma 3 RNAPs X 1 RNAP TRANSCRIÇÃO EUCARIOTOS X PROCARIOTOS Transcrição e tradução acopladas TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EUCARIOTOS X PROCARIOTOS Procariotos: + de 1 ORF RNAm policistrônico Eucariotos: 1 ORF RNAm monocistrônico TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS Iniciação Alongamento Terminação PROCESSO MAIS COMPLEXO E MENOS CONHECIDO •Sistemas diversificados e comparações nem sempre possíveis. •Células diferentes transcrevem genes diferentes ou em quantidades diferentes. ASSIM COMO EM PROCARIOTOS A DECISÃO DE INICIAR, OU NÃO, A TRANSCRIÇÃO É UM PASSO IMPORTANTE NO CONTROLE DA EXPRESSÃO. 5 RNAPs: RNAP I, RNAP II, RNAP III, RNAP de mitocôndria e RNAP de cloroplasto TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNA polimerases de eucariotos Polimerase Localização Moléculas por célula Produtos Atividade RNAP I Nucléolo 40.000 35-45S rRNA 50-70 % Várias subunidades RNAP II Nucleoplasma 40.000 hnRNA (transcrito primário) snRNA (U1,U2, U4,U5) 20-40 % Várias subunidades RNAP III Nucleoplasma 20.000 5S rRNA, tRNA snRNA U6 7SRNA outros snRNA 10 % Várias subunidades RNAP de Mitocôndria Mitocôndria ? RNAs mitocondriais ? 01 subunidade RNAP de Cloroplasto Cloroplasto ? RNAs de cloroplasto ? Similar as bacterianas RNAP I, RNAP II E RNAP III 2 SUBUNIDADES MAIORES E 6 A 12 MENORES homologia com subunidades , e ’ de E. coli. Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição Fatores de transcrição ligam-se ao promotor e então a RNAP associa-se ao complexo. TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS Seqüências reguladoras da transcrição em eucariotos: - elementos promotores a montante – 100 a 200 pb, próximos ao sítio +1 possuem TATA box ou elemento TATA - elementos reforçadores (enhancer) – seqüências pequenas, podem ocorrer antes do promotor ou após o terminador ativam a expressão. INÍCIO DE TRANSCRIÇÃO SÍTIO DE LIGAÇÃO DE PROTEÍNAS ATIVADORAS INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAPs nucleares RNAP I – catalisa a síntese de apenas um tipo de pré-rRNA que é o precursor dos rRNAs 18S, 5.8S e 28S – RNA mais abundante na célula – síntese no nucléolo. Complexo RNAP I: - 2 subunidades maiores (130 e 190 kDa) - 4 a 10 subunidades menores (algumas são comuns para RNAP II e RNAP III) nucléolo TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAPs nucleares RNAP I – pré-rRNA - precursor dos rRNAs 18S, 5.8S e 28S – Promotores para RNAP I – 2 domínios de atividade: • domínio central ou core (entre –45 e +20) • domínio upstream (UCE) (entre –107 e –186) Organização conservada - 34 +1 - 186 TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAP I Para a RNAP I funcionar são necessários outros fatores ou complexos: UBF1 – liga-se a várias regiões do rDNA, interagindo com o domínio central e com o domínio upstream. SL1 – é composto por 4 proteínas, uma delas a TBP (TATA-box binding protein) que está associada a 3 fatores acessórios (TAFs) Uma vez formado o complexo UBF1 e SL1, a RNAP I liga-se ao domínio central para iniciar a transcrição. A RNAP I é ativada pela ligação à TFIC ou TIFA TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAPs nucleares RNAP II – transcreve todos os pré-mRNAs da célula – hnRNAs – RNAs que serão traduzidos em proteínas Complexo RNAP II: - 2 subunidades maiores (215 e 139 kDa) – e ’ de E. coli - 6 a 8 subunidades menores (~ 50 kDa) Promotores para RNAP II: região seletora que inclui TATA box (ou Hogness box) na região –30 e o sítio de início da síntese determina onde a síntese deve ser iniciada. Fatores gerais de transcrição TFIIA, TFIIB, .... TFIID (TBP) reconhece e se liga ao TATA box outros fatores se ligam e RNApolimeraseII TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAPs nucleares RNAP II – transcreve todos os pré-mRNAs da célula – hnRNAs – RNAs que serão traduzidos em proteínas Promotores para RNAP II: região seletora que inclui TATA box (ou Hogness box) na região –30 e osítio de início da síntese região regulatória upstream – CAAT box (consenso GGNCAATCT) na região –60 a – 80, onde se liga o fator de transcrição CTF. GC box – (consenso GGGCGG) podem ocorrer em cópias múltiplas, na região –40 a –100, onde se liga o fator de transcrição SP1 enhancer, ou seqüência ativadora upstream (UAS) em levedura – aumentam expressão dos genes, independentemente da orientação, localização e distância do promotor. TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAPs nucleares RNAP III – transcreve cerca de 10 % do RNA da célula – rRNA 5S, tRNAs, snRNA U6 (participa do processamento dos hnRNAs) e RNA 7S • é a maior e mais complexa das 3 RNAPs 700 kDa, ~14 subunidades •2 subunidades maiores (160 e 128 kDa) – e ’ de E. coli Promotores para RNAP III: alguns são localizados à 3’ da posição +1, ICRs – regiões controladoras internas (ICRs para tRNA e ICR para RNA 5S). ICR para tRNA: 2 regiões: A (consenso T(A/G)GC-AG(T/C)-GG) entre +8 e +19 B (consenso GGTTCGA-TCC) entre +52 e +62 Distância entre A e B varia de 31 a 93 pb. A e B são bastante conservadas. TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS +1 Promotor da RNAP III para transcrição do tRNA Região A Região B +8 +52 Fator TFIIIC liga-se à A e B, permitindo ligação de TFIIIB (TBP + 2 TAFs)e RNAP III liga-se ao complexo – início síntese RNA Promotores para RNAP III: tRNA TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS RNAP III Promotores para RNAP III: ICR para RNA 5S: localizam-se entre +50 e +97 e possuem 3 regiões conservadas: A (consenso (G/C)(T/C)(T/C)AA-C) em +51 IE-elemento intermediário (consenso GC) em +70 C (consenso (C/T)-G(A/G)TGGG) em +79 +1 Promotor da RNAP III para transcrição do 5S RNA Região IE Região A +70 +51 +79 Região C Fator TFIIIA liga-se à C e potencializa a ligação de TFIIIC, que é seguida pela ligação de TFIIIB. A esse complexo liga-se a RNAP III e a síntese é iniciada. tRNA e rRNA : transcritos pela RNA pol III / RNA pol I TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS Muito pouco se conhece sobre o término da transcrição em eucariotos. Todas as RNAPs terminam a síntese em regiões ricas em T. Em geral, não são encontradas regiões palindrômicas (repetições invertidas) como as que ocorrem em procariotos. Os RNAs sintetizados normalmente não são funcionais e devem ser processado. Terminação em Eucariotos TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS x PROCARIOTOS TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTOS X PROCARIOOTOS Procariotos Eucariotos
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