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Métodos de estudo em 
biologia celular
Profa.: Ana Beatriz Graça Duarte
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Introdução
• Seres vivos  células
Unidades limitadas por 
membranas
Solução aquosa 
concentrada de 
compostos orgânicos
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Seres 
vivos
Seres vivos mais 
simples
unicelulares
pluricelulares
Oriundos de 
1 célula
pluricelulares
Vasta colônia de 
células 
individuais 
especializadas
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• As células variam em sua forma e 
função e são muito diversas nas suas 
necessidades bioquímicas e atividades
• Modificações especializam as células e 
algumas até perdem capacidade de se 
dividir
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• Não são vistas a olho nu
• Século XVII
• Invenção do microscópio
• Utilização da luz visível para iluminar espécimes
• Essenciais para laboratório biologia celular
• Microscopia ótica
• Robert Hook, 1665
• Observou cortiça no microscópio 
• Definiu “célula”
• 1930
• Microscopia eletrônica
• Uso de feixes de elétrons como fonte iluminação
• Aumento da capacidade de ver detalhes
• 1988 – 1990
• Microscopia confocal a laser
Tamanho das células
o microscópio usado pra observar cortiça
Robert Hook
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• Século XVII
• Invenção do microscópio
• Zacharias Jansen, 1595
• 1683
• Descobertas significativas
• Alemão Leeuwenhoek - Magnificação entre 50 a 200x
• Século XVIII
• Melhorias nas lentes
• Estabilidade
• Precisão de foco
• Facilidades de uso
• 1742 – projeção de imagens
• Século XIX
• Modelos compostos de várias lentes
1º microscópio, 1600
Histórico
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Microscópio de Robert Hook - 1665 8
Microscópio - 1760
Microscópio - 1700
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• Século XIX
• Técnicas para fabricação de lentes
• Uso de espelhos curvos e melhoria da 
capacidade de foco
• 1840
• Fabricação de microscópios nos EUA
• 1880
• Resolução de 0,2um (limites até hj)
Histórico
Microscópio com espelhos e conjunto 
de acessórios. Modelo construído pelo 
italiano Giovan Battista em 1813
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O microscópio na atualidade
• Técnicas de observação 
avançadas
• Modelos confocais
• Precisão de foco e capacidade de 
ampliação
• Microscopia eletrônica
• Nível atômico
• Aumento de centenas de milhares 
de vezes
• Século XX
• Física, engenharia, medicina, 
química
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O microscópio confocal de fluorescência por varredura laser
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Areia – microscopia confocal 4x 13
Cabeça de formiga – microscopia confocal aumento 20x
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HeLa Cells – microscopia confocal 15
Microscópio eletrônico
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As observações ao microscópio levaram a compreensão de que todas as células vivas eram formadas pela divisão de células 
existentes (teoria celular). Em 1880 Edward Strasburger desenhou uma célula vegetal viva (a) a qual ele observou por 2,5 hs. 
observe em (b) a mesma célula fotografada recentemente por um microscópio ótico 17
O surgimento da biologia celular foi marcado por estudos sistemáticos de tecidos vegetais e animais
com microscópio óptico, mostrando que as células eram os blocos universais de construção de todos os
seres vivos 18
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microscopia
• Visualização ao microscópio
• Cada célula  5 a 20 m de diâmetro
• Condições adequadas para observação
• Cortes de tecidos animais e vegetais podem ser 
observados
• Milhares de células
• Matriz extracelular
• Fibras de proteínas e polissacarídeos
• Visualização de Estruturas internas
• Pequenas partes incolores
• Corantes específicos para componentes celulares
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Sistema de lentes combinadas para ampliar a imagem do objeto
Microscopia ótica - princípios
Interação da luz com o espécime
Absorção ou refração da luz 
Cria contrastes entre o objeto e o meio que o envolve
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• 2 sistemas de lentes convergentes (composto)
• Objetiva
• Possui determinada distancia focal
• Fornece imagem real e aumentada do objeto observado
• Ocular
• lentes convergentes, funciona como uma lupa
• Imagem virutal aumentada da imagem que se formou na objetiva
• Dispostas na extremidade de um cilindro oco (coluna)
• Coluna 
• se afasta ou aproxima da amostra e focaliza
• Cremalheira
• Sistema associado a uma roda dentada que aproxima ou 
afasta a amostra para focar o objeto
Microscopia ótica - princípios
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• Formação da imagem 
Microscopia ótica - princípios
Fonte de luz → Lente condensadora → Lente objetiva → Lente Ocular 
O posicionamento estratégio das lentes proporcionam formação 
da imagem invertida
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Partes ópticas
Condensador e Diafragma
Condensador - Conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e 
espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa
Diafragma - É constituído por palhetas que podem ser aproximadas ou afastadas 
do centro permitindo regular a intensidade da luz.
Lentes Objetivas
Ampliam a imagem do objeto 10x, 20x, 40x ou 100x. 
• As objetivas de 10x, 20x e 40x são secas pois entre a preparação e a objetiva existe somente ar.
• As objetivas de imersão (100x) é necessário colocar uma gota de óleo de imersão entre elas e a 
preparação evita o desvio do feixe luminoso para fora da objetiva.
Lentes Oculares
permitem ampliar a imagem real fornecida pela objetiva, formando uma imagem 
virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador. As 
oculares mais utilizadas são as de ampliação 10x, mas nos microscópios 
binoculares também existem oculares de 12,5, 8x e 6x.
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As objetivas corrigem aberrações e podem ser de vários tipos: acromáticas, 
apocromáticas, semi-apocromáticas, planapocromaticas
Fabricante
apocromática
aumento
Abertura numérica
Código de cor
Distancia de trabalho ou distancia focal 
Extensão do tubo
Código de cores
Vermelha – 4x
Amarela – 10x
Azul claro – 40x
Azul escuro – 60x
Preta ou branca – 100x (imersão)
Espessura da lâmina
Lentes protegidas
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Tipos de objetivas
• Acromáticas
• são a mais simples sem nenhuma sofisticação, que os microscópios comuns 
possuem.
• Semi-apocromática
• são também chamadas de fluorita, porque este material entra na sua 
constituição, dando alguma correção para as aberrações.
• Apocromáticas
• possuem correção ampla. Abrangem todo o espectro.
• Planapocromática
• possui imersão, com aumento de 63 X e abertura numérica de 1,4.Com ela se 
consegue o máximo de resolução de um microscópio óptico
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• A abertura numérica (AN) é calculada multiplicando o índice de 
refração da substância interposta entre o objeto e a lente objetiva (n) 
pelo seno do semiângulo do cone de luz captado pela objetiva (u), ou 
seja:
• NA = n senθ
• Nas objetivas de 5 a 40x, o ar é esta substância, e o seu índice de refração é 
igual a 1
• Na objetiva de 100x, o óleo de imersão tem índice de refração de 1,515, o que 
aumenta a abertura numérica e a qualidade da imagem
Abertura numérica
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• NA = n senθ
• Objetivas 5 a 40x - índice de refração do ar (n) = 1
• objetiva de 100x, índice de refração do óleo de imersão (n)= 1,515
Abertura numérica
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Lentes objetivas
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• Abertura numérica
• Depende do índice 
de refração do 
meio
• Ângulo de abertura 
do cone de luz
• Distância de Foco
• distância do objeto 
até a lente
Lentes objetivas
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Poder de resolução e limite de resolução
• Poder de resolução:
• Capacidade de uma lente ou do microscópio em formar imagens com 
detalhes mínimos
• Limite de resolução:
• Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto que poderão ser 
individualizados na imagem final
• Quanto maior o poder de resolução, menor o limite de resolução !
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Microscopia ótica
• O aumento total é obtido multiplicando o aumento 
da objetiva pelo da ocular
• Revolver:
• Porta objetivas
• Sistema com várias lentes objetivas e aumentos diferentes• Oculares
• Monocular ou binoculares
• Ajustes interpupilares para cada indivíduo 50 a 80 mm
• Sistema trinocular
• Adaptação para câmeras fotográficas ou de vídeo
• Amostras ficam sobre o charriot na platina 
• Movimentada pelo sistema de cremalheiras 
• Parafusos Micrométrico e macrométrico
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• Aumento 
• Produto do aumento da ocular e da 
objetiva
Microscopia ótica
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Lupa Estereoscópica
• Tipo de microscópio usado para amostras 
com grandes relevos, como grãos, 
partículas, 
• 2 sistemas óticos independentes 
• 2 tubos, objetivas e oculares 
• Imagens tridimensionais com relevo
• Luz transmitida ou refletida
• Conservam os relevos da amostra
• Permite dissecção de tecidos
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• A limitação fundamental de todos os microscópios é determinado 
pelo comprimento de onda de luz visível que varia entre 0,4um 
(violeta) para o,7 um (vermelho)
• Bactérias e mitocôndrias com cerca de 0,5um de tamanho são os 
menores objetos claramente discernidos ao microscópio ótico
• Quando as ondas de luz viajam em um sistema óptico passam por 
trajetórias diferentes interferindo umas nas outras causando efeitos 
de difração óptica
Microscopia ótica
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Microscopia ótica
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• A interação da luz com o objeto muda a relação de fase das ondas de 
luz que produz complexos efeitos de interferência
• Efeitos de borda
• Efeitos de interferência observados em alta magnificação quando a luz passa 
pelas bordas de um objeto sólido 
• Conjunto de linhas paralelas ou anéis concêntricos
• Limites impostos pela natureza de onda da luz
Microscopia ótica
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Microscopia óptica ou de luz
variações:
Contraste de fase
Campo escuro
Invertido
Polarização 
Fluorescência
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Microscopia óptica – contraste de fase
• Contraste de fase
• Observação de células vivas sem coloração 
• Princípio
• Estruturas celulares com diferentes índices de refração dão origem a 
diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes
• Dispositivos no condensador e objetivas transformam essas diferenças 
• Resultam na variação na intensidade luminosa (claro e escuro)
• Transformação das variações mínimas de fasemudanças de amplitude
• Visualização  contraste de imagem
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Microscopia óptica – contraste de fase
• Contraste de fase
• Dispositivos no condensador e objetivas transformam essas diferenças 
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Contraste de fase 
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Contraste de fase 
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Contraste de fase 
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• Vantagens
• Visualização de células vivas em estado
natural
• Células em cultivo in vitro
• observação crescimento, características
morfológicas
• Avaliação viabilidade e condições de cultivo
in vitro
• Visualização de processos em andamento
sem necessidade de fixar e corar
• Desvantagem
• halos em torno das áreas de elevado 
deslocamento de fase.
Contraste de fase 
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Microscopia de campo escuro
• apresentam um condensador 
especial 
• Inclinação da luz de tal modo que 
ela não atravessa o objeto
• Dispersão da luz
• Feixes desviados percorrem os 
sistemas 
• Objetivas e oculares
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Microscópio invertido
• Estrutura invertida
• Luz acima da platina
• Principio é o mesmo do microscópio 
óptico comum
• Permite observação de material 
espesso
• Células dentro de tubos e garrafas de 
cultivo in vitro
• Útil para acompanhamento do 
crescimento de culturas celulares
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61Nasce no Ceará um clone transgênico de caprino.mp4
Microscopia de polarização
• Observação de materiais birrefringentes 
• estruturas anisotrópicas  índices diferentes de refração
• músculo, ossos, celulose, fibras, cabelos, cristais, etc.
• Possui dois prismas: 
• Polarizador 
• Analisador
• A luz se desdobra em duas
• O prisma deixa passar uma das vibrações luminosas mas não a outra
• estruturas isotrópicas serão canceladas e no seu lugar ficará escuro.
• As estruturas birrefringentes ou anisotrópicas produzem brilho
• Somente estruturas birrefringentes aparecerão brilhantes, ficando o restante do 
material escuro
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Microscopia de polarização
• Estruturas anisotrópicas ou birrefringentes
• estruturas cristalinas ou constituídas por moléculas alongadas e paralelas, 
que dividem o feixe de luz em dois
• Um feixe é absorvido pelo analisador, mas o outro, perpendicular ao 
polarizador, atravessa o analisador e formará a imagem
• apresentam dois índices de refração diferentes (brilho)
• Estruturas isotrópicas 
• não desviam o plano de polarização da luz, e o feixe que passa pelo 
polarizador chega inalterado ao analisador, onde é retido (escuras)
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Microscopia de polarização
A luz não polarizada penetra no polarizador e é polarizada. Quando penetra em um cristal anisotrópico é dividido em 2 
componentes em eixo perpendicular. As ondas de luz polarizada viajam pelo analisador que passam apenas os 
componentes das ondas de luz paralelas. 64
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Cristais de vitamina B6 microscopia de polarização
Esmalte e dentina por 
microscopia de polarização67
Microscopia de polarização
• Alto grau de sensibilidade
• Estudos quantitativos e qualitativos
• Estudos de características birrefringentes de estruturas sub-celulares permitiram 
maior uso na biologia
• Aplicações:
• Análise de macromoléculas com graus ordenados de agregação:
• DNA
• Colágeno
• Celulose
• Tubulina
• Análise de tecidos biológicos com arranjos moleculares
• Osso, cartilagem, dentina
• Componentes cristalinos de minerais
• Paredes celulares, amido
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Microscopia de fluorescência
• Apresenta sistema diferente de 
iluminação e jogos de filtros
• Filtra a luz antes de alcançar o material 
• Filtros de luz emitidas pelo material 
• A luz UV é usada como radiação 
excitadora 
• Menor comprimento de onda
• Maior poder de resolução 
• Localização de constituintes celulares 
fluorescentes
• Corantes (substâncias químicas) e anticorpos 
que marcam moléculas 69
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Microscopia de fluorescência
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• Função básica
• Irradiar o espécime com bandas especificas de comprimento de onda e 
separar 
• Apenas a luz emitida pelo espécim deve alcançar o olho do analisador
• Estruturas fluorescentes em contraste com fundo escuro
• Os limites de detecção são controlados pelo escurecimento da amostra 
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Microscopia de fluorescência
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Marcação de mitocôndrias - mitotracker
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