PROJETO IC THEVETIA PERUVIANA

Prévia do material em texto

� PAGE \* MERGEFORMAT �11�
UNIVERSIDADE PAULISTA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CURSO DE FARMÁCIA 
SÃO JOSÉ DO RIO PARDO
Avaliação da atividade anticancerosa promovidas por moléculas contidas nos extratos de Thevetia peruviana
(Assessment of anticancer activity induced by molecules contained in extracts of Thevetia peruviana)
Aluna: Daniela de Morais Barbosa
Orientador: Prof. Me. Mateus Amaral Baldo
São José do Rio Pardo
2016
�
índice
RESUMO DO PROJETO DE PESQUISA ...............................................................3
ABSTRACT...............................................................................................................3
 INTRODUÇÃO ........................................................................................................4
3.1.CÂNCER.....................................................................................................................6
3.2. CICLO CELULAR.....................................................................................................6
3.3. APOPTOSE................................................................................................................7
3.4. Na+ K+ ATPase (BOMBA DE SÓDIO)....................................................................8
3.5. PRODUTOS NATURAIS E CANCER.....................................................................8
JUSTIFICATIVA ......................................................................................................9
OBJETIVO ..............................................................................................................10
MATERIAL e MÉTODO ........................................................................................10
6.1. MATERIAL ..........................................................................................................10
6.1.1. EXTRATO .........................................................................................................10
6.1.2. LINHAGENS DE CÉLULAS ............................................................................11
6.2. MÉTODO .............................................................................................................11
6.2.1. EXTRAÇÃO DE EXTRATO BRUTO DE FOLHAS DE Thevetia peruviana POR MACERAÇÃO ....................................................................................................11
6.2.2. IDENTIFICAÇÃO DE HETEROSIDEOS CARDIOTONICOS ......................12
6.2.3. ENSAIOS BIOLÓGICOS .................................................................................12
6.2.3.1. Manutenção da linhagem de células em suspensão e semi-aderentes (HL-60 e PC-12) .......................................................................12
6.2.3.2. Subcultivo da linhagem de células em suspensão e semi-aderentes................................................................................................................13
 6.2.3.3. Manutenção das linhagens de células aderentes (HepG2) .........................................................................................................................13
6.2.3.4. Subcultivo das linhagens de células aderentes.............14
6.2.4. Viabilidade celular .............................................................................14
6.2.5. Ensaios de citotoxicidade (MTT) ......................................................14
ReferÊncias bIBLIOGRÁFICAS.....................................................................15
�
Resumo do projeto de pesquisa
Palavras-chaves: Atividade anticancerosas, Thevetia peruviana, cardenolídeos.
 
O reino vegetal tem sido amplamente estudado na busca por moléculas que possuem propriedades farmacológicas e não é recente o uso de plantas no tratamento de diversas patologias. Desde os primórdios o homem aprendeu a classificar os vegetais, primeiramente, de acordo com suas funções como, alimentação, terapia e plantas tóxicas. No decorrer do tempo a expansão dos conhecimentos e o aprimoramento tecnológico permitiu avanços nos estudos que levaram à descobertas de moléculas até hoje muito empregadas no tratamento de várias doenças, como o ácido salicílico, derivado do Salix alba, que possui propriedades anti-inflamatórias e anti-agregação plaquetária.
O reino Apocynaceae constitui-se de diversas espécies de plantas, frequentemente utilizadas para ornamentação, conhecidas principalmente pela sua alta toxicidade. Elas produzem metabólicos secundários chamados esteróides cardiotônicos, moléculas que possuem a propriedade de atuar sobre a Na+K+ATPase, comumente utilizadas para tratamento de Insuficiência Cardíaca Congestiva (ICC).
Diversos estudos apontam para a utilização dessas moléculas para inibição da replicação celular, já que observa-se que a Na+K+ATPase influi no desenvolvimento da tumorigênese.
O câncer é uma patologia caracterizada pela replicação desenfreada de células anormais, que mata milhões de pessoas no mundo todo, a qual possui diversos tratamentos paliativos e métodos de controle, mas a maioria não garante cura definitiva.
Serão realizados testes de inibição de crescimento celular com amostras de extratos secos de folhas de Thevetia peruviana, extraídos com etanol e clorofórmio.
2.ABSTRACT
KEYWORDS: Anti-cancer activity, Thevetia peruviana, cardenolídeos.
 
	The plant kingdom has been widely studied in the search for molecules which possess pharmacological properties and is not new to use plants to treat various diseases. Since the beginning man has learned to classify the plant, first, in accordance with his duties as feeding therapy and toxic plants. Over time the expansion of knowledge and technological improvement enabled advances in the studies that led to molecules discovered until now widely applied in the treatment of various diseases, such as salicylic acid derivative alba Salix, which has anti- inflammatory and anti platelet -agregação.
	The Apocynaceae kingdom consists of several species of plants, often used for ornamental purposes, mainly known for its high toxicity. They produce secondary metabolic called cardiotonic steroid molecules which have the property of acting on Na + K + ATPase, commonly used for treating Congestive Heart Failure (CHF).
	Several studies point to the use of these molecules for inhibiting cell replication since it is observed that Na + K + ATPase activity affects the development of tumorigenesis.
	Cancer is a disease characterized by the uncontrolled replication of abnormal cells, which kills millions of people worldwide, which has several palliative treatments and methods of control, but most does not guarantee permanent cure. 
	Cell growth inhibition tests carried out with samples of dried leaf extracts Thevetia peruviana, extracted with ethanol and chloroform.
3. INTRODUÇÃO
	As plantas representam um terreno muito rico de moléculas a serem estudadas para o uso terapêutico. Nos últimos anos houve um aumento no interesse de pesquisas nessa área em vista da comprovação da eficácia de substâncias advindas do reino vegetal, tais como alcalóides da vinca e jaborandi, com respectivas atividades farmacológicas contra Leucemias e Glaucoma, glicosídeos cardioativos, como digitalis utilizada no tratamento de Insuficiência Cardíaca Congestiva (ICC) (FOGLIO et al., 2006).
	Dentre muitas, destacam-se as plantas da família Apocynaceae, que são conhecidas por suas características altamente tóxicas e também farmacológicas.(MOURA & AGRA, 1989).
	 A família Apocynaceae é constituída por cerca de 250 gêneros e 2000 espécies, sendo elas árvores tropicais, arbustos e trepadeiras. Uma característica da família é que quase todas espécies produzem seiva leitosa. As folhas são simples, e as flores são grandes e coloridas. Na medicina tradicional, as espécies de Apocynaceae são usadas para tratar doenças gastrintestinais, febre, malária, dor, diabetes, doenças de pele e fígado, lepra, disenteria, vermes, úlceras,tumores e dores de ouvido (WONG et al., 2011).
	Dentre os vegetais dessa família, encontra-se a Thevetia peruviana, que é uma árvore com uma difusa, ramificada e densa coroa. As folhas são verde-escuras, brilhantes e lineares. As flores são em pequenos grupos na ponta dos galhos, amarelo para laranja ou pêssego, tubular, com 5 lobos de pétalas. O fruto é uma drupa carnosa, triangular, amarela, ficando verde, e depois preta, contêm duas sementes e sua seiva é branca leitosa. A planta possui em todas as suas partes moléculas de cardenolídeos, um tipo de glicosídeo cardiotônico, responsável pela sua toxicidade. A T. peruviana apresenta maior concentração desses cardenolídeos no núcleo das sementes, seguidos por folhas, flores, frutos e seiva (BANDARA et al. 2009).
Figura 1: Thevetia peruviana. (Fotografia Mateus Amaral Baldo).
	Os glicosídeos cardiotônicos são constituídos de uma genina e uma molécula de açúcar, vinculados através de um átomo de oxigênio. São conhecidos mais de 200 tipos de glicosídeos cardioativos e sua principal ação é sobre o miocárdio, aumentando sua contratilidade. Diversos glicosídeos têm sido sintetizados nos últimos vinte anos (HAUSTEIN, 1983).
	Estudos tem demonstrado diversas atividades dos cardenolídeos na farmacologia, como propriedades antibacteriana (HUQ et al., 1998), inibição de replicação de HIV (PRINSLOO et al., 2007), antifúngica (GONÇALVES E SOUSA, 2003) antifertilidade (GUPTA et al. 2011), antimalárica (WONG et al. 2011), ação depressora do SNC (BEGUM et al. 1998) e anticâncer. (RASHAN et al., 2010).
	
3.1. Câncer
	O câncer é uma doença caracterizada pelo crescimento descontrolado de células transformadas e é responsável pela morte de 6 milhões de pessoas por ano. (ALMEIDA et al., 2005).
	Existem vários mecanismos envolvidos no aparecimento de tumores, porém dois são principais: a proliferação descontrolada e a supressão da apoptose. Tendo em vista a complexidade do mecanismo e a quantidade de genes envolvidos pode-se concluir que a incidência da formação de cânceres é pequena, pois o organismo é formado por cerca de 1x1014 células dentre as quais apenas 1-2x 10-7 são mutadas em cada divisão celular (MENDONZA et al., 2004).
	A grande incidência de tumores tem sido associada ao grande número de mutações cromossômicas, relacionadas a genes e proteínas que participam da replicação celular. Isso resulta em uma proliferação excessiva porque pela alteração do seu código genético a célula ignora os pontos de controle do ciclo causando um desenvolvimento anormal do mesmo. A maior parte da inativação desses pontos de controle são anormalidades no DNA, sendo assim é necessário que eles funcionem adequadamente no decorrer do ciclo para que haja uma replicação perfeita. Quando há falha nesses pontos, dá-se a carcinogênese. Existem estudos que indicam que em células tumorais, vias enzimáticas e genéticas se apresentam alteradas e que existem padrões celulares específicos para tumores específicos (FRAGOZO et al., 2004).
	
3.2. Ciclo celular 
	A progressão do ciclo celular é a base para o crescimento e desenvolvimento dos seres vivos (MENDONZA et al. 2004). Sua função não é somente a proliferação de novas células, mas também garantir que este processo ocorra de forma adequadamente regulada (DIAZ et al., 2003).
	Para que haja a replicação celular são necessários não somente fatores mitóticos, mas também, ausência de fatores inibitórios. A transição da fase G1 para S é marcada pelo primeiro ponto de controle, que é muito importante para o ciclo. Quando o DNA se replica a célula replica-se. (MENDONZA et al. 2004). Para que a célula passe por esse ponto precisa apresentar três coisas: tamanho adequado, disponibilidade de alimentos e demandas reprodutivas. Se há falta de uma dessas três, o sistema de controle detém a célula para proporcionar tempo para o desenvolvimento. Se a próxima fase se iniciar antes que a primeira seja concluída, vários danos podem ocorrer na célula e nas suas células filhas. Isso é evitado por um sistema de segurança de feedback, que pára a célula até seu ciclo se completar, por exemplo, os cromossomos geram um sinal de retroalimentação caso não estejam unidos ao fuso (DIAZ et al. 2003).
	3.3. Apoptose 
	Um importante papel na homeostase dos diferentes tecidos é desempenhado por um processo fisiológico de morte celular programada, que é conhecido como Apoptose, que controla, inclusive, o sistema hematopoiético (MAURILLO et al., 2001).
	O aparecimento de neoplasias e doenças auto-imunes está relacionada à resistência anormal à apoptose (RAMENGHI et al., 2000).
Vários fatores podem desencadear a apoptose, como ligação de moléculas a receptores de membrana, agentes quimioterápicos, radiação ionizante, danos no DNA, choque térmico, deprivação de fatores de crescimento, baixa quantidade de nutrientes e níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio (GRIVICICH et al. 2007).
Várias proteínas interagem no processo apoptotico, dentre elas, as caspases que através de clivagem, fazem a condensação e fragmentação nuclear, a família Bcl-2, que constitui-se de fatores anti-apoptóticos como Bcl-2 e pró-apoptóticos como Bax, as IAPs - Proteínas Inibidoras de Apoptoses, que agem inativando as caspases efetoras e também a p53 e também a família de receptor de fator de necrose tumoral (TNF), que, se inativados podem desencadear a tumorigênese (GRIVICICH et al. 2007).
A morte celular programada pode acontecer por duas vias. Uma é a via extrínseca que acontece quando ligantes específicos se associam às TNFs e como consequência ativam a sequência de caspases (caspase 8 e caspase 3), culminando em apoptose. A via intrínseca é desencadeada por etresse celular. Ocorre no citoplasma, porém tem a mitocôndria como principal mediador desta via. Depois de receber estímulos de morte, há a permeabilização das membranas mitocondriais liberando fatores pró- apoptóticos. A homeostasia celular é danificada pelo rompimento desta organela, havendo a suspensão da síntese de ATP e consequente aumento da concentração de espécies reativas do oxigênio (EROS), oxidando proteínas lipídios e ácidos nucleicos. Sabe-se que a resposta ao dano oxidativo é importante pois altas concentrações de EROS ativam as caspases 3 e 9. É importante descrever tambpem, sobre o megaporos formados nas membranas mitocondriais. É por eles que ocorre a passagem do citocromo c para o citosol, onde forma um complexo com APAF1 e caspase 9, fazendo a clivagem da pró caspase 9, liberando a caspase 9 para ativar a caspase 3, desencadeando a apoptose(GRIVICICH et al. 2007)..
	3.4. BOMBA DE SÓDIO (Na+K+ATPase)
A bomba de sódio é uma proteína composta por duas subunidades, a subunidade alfa catalítica e a subunidade beta reguladora. Na subunidade alfa localizam-se os sítios de ligação para Na+, K+, ATP e esteróide cardiotônico e a subunidade beta que é essencial para o funcionamento da enzima e sua integração com a membrana plasmática, além de possuir alguns sítios de glicosilação, necessário para atividade da enzima (MIJATOVIC et. al. 2007)
	Sempre foi referida por desenvolver atividades no equilíbrio eletrolítico celular, através da inclusão de íons K+ e a exclusão de íons Na+ através da membrana da célula, na estequiometria de 3:2, utilizando a energia da hidrólise de um ATP. No entanto, uma nova função lhe foi atribuída recentemente: atua como um transdutor de sinal entre os meios extra e intracelular, e sua atividade pode influenciar a migração, comunicação e proliferação celular, inclusive a apoptose, pois foi constatado que a sobrevivência celular não é viável em caso da supressão total da atividade da bomba (PRATSCHER et. al. 2008).
	3.5. Produtos Naturais e Câncer
	Os produtos naturais ciclo-celular específicos são tipos de agentes antineoplásicos importantes e eficientes, e que se referem a muitos fármacos usados na terapia clínica do câncer e que originalmente não são compostos sintéticos. Dentre alguns produtos naturais citotóxicos,têm se os alcalóides vegetais, como vimblastina e vincristina, advindos da vinca, taxol, éster alcalóide derivado do Taxus brevifolia, podofilotoxinas (ALMEIDA et al., 2005). O Brasil possui uma biodiversidade muito ampla, potencialmente rica para descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (ELIEZER J. BARREIRO, 2009).
	Cardenolídeos são moléculas utilizadas para o tratamento de doenças cardíacas, pois possuem a propriedade de se ligar á bomba de sódio e potássio. A bomba de sódio e potássio tem sido apontada como influente na progressão de diversos cânceres visto que sua expressão e atividade se encontram aumentadas em certos casos. Observou-se uma baixa incidência de morte por câncer em pacientes que trataram Insuficiência Cardíaca Congestiva (ICC) (MIJATOVIC et al, 2007). Observou-se que a atividade da NK+ATPase se encontra aumentada durante o processo de transformação maligna, presente desde seu inicio, mesmo antes de evidencias morfológicas de formação de tumor, alterando assim o transporte de íons. Porém, há estudos que relataram a inibição da bomba de sódio em cânceres de intestinos, associadas à presença de proteínas relacionadas ao câncer como FXYD (nome dessa proteína), que afetam a função da Na+K+ATPase. A sensibilidade para esteroides cardiotônicos também encontra-se modificada em células tumorais, fato que pode decorrer de uma mudança na densidade da bomba e também de diferenças na expressão de isoenzimas (MIJATOVIC et al. 2007).
	Estudos têm demonstrado que cascas e raízes de algumas espécies de Apocynaceae, como Alstonia angustiloba, Calotropis gigantea, Vallaris glabra possuem propriedades anticâncer. Extrato de diclorometano de Alstonia angustiloba. foi eficaz contra três linhagens de células tumorais: MCF-7, MDAMB-231 (cânceres mamários) e HeLa (adenocarcinoma da cérvix). Extratos etanólicos de raiz Calotropis gigantea são citotóxicos para as linhagens de células K562 (leucemia) e SGC-7901 (câncer gástrico) humano linhagens de células (WONG et al. 2011).
Há documentos do uso de Oleander em tratamentos anticâncer no Egito, Venezuela, Cuba e Índia. Na Irlanda e na Turquia extratos aquosos de Oleander são usados em pacientes terminais de câncer e AIDS (MIJATOVIC et al. 2007).
4. Justificativa
O principal objetivo desta iniciação científica é fazer o aluno ter contato com a ciência e a pesquisa, levando-o a aprender a preparar um projeto científico e redação de artigos científicos.
É de extrema importância inserir o aluno dentro de um projeto grande e com objetivos reais de pesquisa a fim de fazer com que ele tenha não só a individualidade no aprendizado da ciência e explorar um novo mundo que está vinculado à grandeza da universidade, mas também fazer com que ele tenha contato com Universidades de renome como USP entre outra através de colaborações.
Outro grande objetivo é preparar este aluno para o mundo que vem após a graduação, abrindo-lhe portas para uma futura pós graduação stricto sensu. 
Dessa forma inserindo conhecimentos de produtos naturais que a nossa flora e fauna apresentma com extrema riqueza na tentativa de descobrir novas moléculas para terapias que poderão ser transformados em novas drogas futuramente. 
A terapia anticâncer consiste em uma junção de alternativas, combinando métodos cirúrgicos, radiológicos e quimioterápicos de acordo com a necessidade de cada indivíduo e desencadeia efeitos colaterais importantes resultando em desconforto e sofrimento para portadores da doença. Assim, o estudo e desenvolvimento de novas drogas, com maior especificidade e índices de efeitos colaterais mais baixos, se torna essencial para o desenvolvimento de uma terapia multidisciplinar cada vez mais eficaz e segura.
As moléculas encontradas nas plantas do reino Apocinaceae têm apresentado ligação com a atividade antitumoral, já que as mesmas possuem atuação sobre a bomba Na+K+ATPase a qual se mostrou envolvida nos mecanismos de desenvolvimento de células tumorais.
A identificação dessas moléculas, bem como a determinação de suas atividades farmacológicas é de grande importância para aplicação clínica em diversas patologias inclusive do câncer.
	5. Objetivo
O projeto tem como objetivo geral extrair e testar propriedades de inibição celular de moléculas presentes nesses extratos alcoólicos e de clorofórmio de folhas de Thevetia peruviana.
6. MATERIAL e MÉTODO
6.1. MATERIAL 
6.1.1 EXTRATO
Extrato bruto das folhas frescas de Thevetia peruviana, que será obtido no laboratório da UNIP – Universidade Paulista – Campus de São José do Rio Pardo, através de maceração das folhas em solventes orgânicos e polares como álcool, clorofórmio, acetato de etila e hexano.
6.1.2 LINHAGENS DE CÉLULAS
Serão utilizadas as linhagens tumorais HL-60 (CCL-240, leucemia promielocítica aguda humana), HepG2 (HB-8065, hepatocarcinoma humano), PC-12 (CRL-1721, feocromacitoma de ratos) obtidas da ATCC (Coleção Americana de Cultura de Células).
6.2 MÉTODO
6.2.1 EXTRAÇÃO DE EXTRATO BRUTO DE FOLHAS DE Thevetia peruviana POR MACERAÇÃO.
O extrato será obtido por maceração de folhas frescas de Thevetia peruviana, na quantidade aproximada de 100g, que será submetida a uma solução hidroalcoolica (etanol 50%) e permanecerá em imersão em béquer de vidro por 24 horas. Após esse período o conteúdo será filtrado em algodão e reservado. Em seguida, as folhas serão novamente acrescidas da solução hidroalcoolica, na mesma quantidade e permanecerá sob imersão por 30 minutos. Por fim, este ultimo passo será repetido e os conteúdos dos três filtrados, homogeinizados e levados ao rotavapor até secarem. 
Depois de seco o extrato será solubilizado em uma solução de 100 mL de metanol mais água na proporção de 1:1. O conteúdo será vertido em funil de separação e acrescido de 100 mL de hexano, onde as fases polar e apolar serão separadas e esta última, levada ao rotavapor. A fase polar receberá acetato de etila, que formará novamente duas fases. A nova fase apolar será separada e reservada, enquanto que a fase polar receberá N-butanol. Haverá a formação de um precipitado, o qual deverá ser desprezado. A solução restante de caráter aquoso será submetida á liofilização.
 
6.2.2 IDENTIFICAÇÃO DE HETEROSIDEOS CARDIOTONICOS
Para a identificação dos heterosídeos cardiotônicos serão utilizadas as técnicas das reações de Liebermann-Bouchard e Kedde.
Será adicionado 20 mL de etanol a 70% em 100g de folhas de Thevetia peruviana para ser fervido. O conteúdo será filtrado por algodão e transferido para um béquer, onde se adicionará 3 mL de solução saturada de acetato de chumbo. Em seguida, o volume será filtrado por papel filtro para o funil de separação. Sequencialmente, será adicionado água destilada no funil de separação, e a porção hidroalcólica será extraída com duas porções de 4mL cada de clorofórmio. Os extratos serão reunidos e divididos em dois tubos de ensaio. 
Utilizar um dos tubos para realização da Reação de Liebermann-Bouchard, redissolvendo o resíduo com 0,5 mL de anidrido acético, transferindo 1 mL de ácido sulfúrico concentrado, de maneira que escoe pelas paredes do tubo. Observar uma fase vermelha, uma fase branca e entre as duas a formação de um anel castanho avermelhado, se o teste der positivo.
O outro tubo será utilizado para a reação de Keddi que compreende-se em colocar 5 a 4 gotas de solução hidroalcoólica a 1% de ácido 3,5.dinitrobenzóico e 2 gotas de solução de hidróxido de potássio KOH 1 N. Observar o aparecimento de coloração violeta intensa em caso de reação positiva.
6.2.3 ENSAIOS BIOLÓGICOS 
6.2.3.1 Manutenção da linhagem de células em suspensão e semi-aderentes (HL-60 e PC-12) 
As linhagens de células serão congeladas em nitrogênio liquido (-195ºC) em alíquotas de 1x106 células/mL em solução de congelamento (10% de DMSO (dimetilsulfóxido) e 90% de soro bovino fetal). Para a realização dos experimentos as linhagens serão descongeladas e cultivadas em monocamada, em frascos de 25 cm3 com 5 mL de meio de culturaRPMI suplementados com 10% de soro bovino fetal (SBF) para a linhagem de HL-60 e meio RPMI, suplementado com 15% de soro equino fetal (SEF) e 5% de soro bovino fetal para linhagem de PC-12, incubadas em estufa umidificada contendo 95% de ar e 5% de CO2, a 37ºC, até atingirem o estado de confluência (~ 5x106 células), quando necessitarão de subcultivo.
6.2.3.2 Subcultivo da linhagem de células em suspensão e semi-aderentes 
Quando alcançam seus pontos de confluência, as linhagens de células HL-60 e PC-12 (~ 5x106 células) necessitam de um subcultivo. No caso da linhagem HL-60, será transferido todo o líquido da garrafa de cultura um tubo de 15 mL para ser centrifugado 900g por 5 min. Será desprezado o sobrenadante e o pellet de células, ressuspenso. Em seguida, será adicionado 1 mL de meio RPMI suplementado com SBF 10% e o conteúdo será dividido em mais outros 2 frascos de 25cm3 com 5 mL de meio RPMI, suplementado com SBF 10%. Como a linhagem celular PC-12 possui característica de se aderir ao fundo do frasco, esta necessita de subcultivo diferente. Sendo assim, há a necessidade do uso de “scraper” para efetuar a “raspagem” do fundo da garrafa, desfazendo assim, suas ligações célula-matriz. O conteúdo do frasco será recolhido e levado à centrifugação por 5 min por 900g, descartando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet de células. Adicionará 1 mL de meio RPMI suplementado com 15% de SEF e 5% de SBF e o conteúdo dividido em mais 2 garrafas de cultura de 25 cm3 com 5 mL de meio RPMI suplementado com 15% de SEF e 5% de SBF.
6.2.3.3 Manutenção das linhagens de células aderentes (HepG2) 
As linhagens celulares serão mantidas congeladas em nitrogênio liquido (-195ºC) em alíquotas de 1x106 células/mL em solução de congelamento (10% de DMSO e 90% de soro bovino fetal). Para a realização dos experimentos, as linhagens foram descongeladas e cultivadas em monocamada, em frascos de 25 cm3 com 5 mL de meio de cultura DMEM (que possui alta concentração de glicose, l-glutamina e ausência de piruvato de sódio) suplementados com 10% de soro bovino fetal (SBF) e incubadas em estufa umidificada contendo 95% de ar e 5% de CO2, a 37 °C, até atingirem o estado de confluência (~ 5x106 células) quando necessitam de subcultivo. 
6.2.3.4 Subcultivo das linhagens de células aderentes 
O procedimento de subcultivo de células aderentes difere do utilizado nas demais linhagens celulares. Será desprezado todo o conteúdo do frasco, considerando apenas as células que permanecerem aderidas ao fundo do frasco, que será lavado com aproximadamente 2 mL de tampão PBS estéril pH 7,4 que será descartado posteriormente. Em seguida, adicionará 2 mL de tripsina à garrafa de cultura. Após o intervalo de 5 minutos, que corresponde ao tempo de ação da trpsina, a mesma será inativada com meio DMEM completo, de modo que o volume de meio seja o dobro do volume usado de tripsina. Assim, será transferido todo o conteúdo para um tubo (falcon) de 15 mL e seguirá para centrifugação a 5 min por 900g. O sobrenadante será desprezado e o pellet celular ressuspenso em aproximadamente 2 mL de meio DMEM suplementado com 10% de SBF e o conteúdo dividido em mais 2 garrafas de culturas de 25 cm3 com 5 mL de meio DMEM, suplementado com 10% de SBF.
6.2.4 Viabilidade celular 
Visando assegurar a qualidade e veracidade dos resultados, será realizado o teste de viabilidade celular, anteriormente a execução de qualquer experimento. Para realização deste teste é utilizado o corante azul de Tripan. Este corante consegue indicar estágio de morte celular avançado, por possuir a propriedade de ser incorporado por membranas fragilizadas. O mesmo é usado na proporção de 1:2, pipetando 20μL de corante para 10μL de suspensão de células e esperado 15 minutos para a leitura no microscópio. As células viáveis não são coradas pelo azul de Tripan e aparecem incolores, ao passo que as células mortas apresentam coloração azul. 
6.2.5 Ensaios de citotoxicidade (MTT) 
	Para o teste de citotoxicidade serão utilizadas placas de 96 poços. Estes receberão 5x104 células/poço, com um volume final de 100μL e serão então incubados por 24 horas à 37ºC com 5% de CO2. Após 24 horas os poços receberão os tratamentos, em triplicatas, administrando-se 50μL por poço de extrato bruto de Thevetia peruviana, nas seguintes concentrações: 5, 10, 25, 50, 100 e 200 μg/mL. O controle positivo receberá 50 μL de Cisplatina 1mg/mL e o controle negativo não receberá nenhum tratamento. A placa será incubada por 24 horas à 37ºC com 5% de CO2. No fim deste período, os poços receberão 10μL de reagente de MTT (exceto os poços da prova em branco) e serão incubados por 3 horas à 37ºC e 5% de CO2. Em seguida, as placas serão centrifugadas à 5min x 900g e posteriormente invertida para o descarte do sobrenadante e administrar-se-á 100μL HCl-isopropanol 0,04 N ou DMSO e levados a agitação até a total dissolução dos cristais (aproximadamente 20 minutos). Em seguida serão levados ao espectrofotômetro para a leitura da absorbância em 570 nm. Os resultados obtidos serão coletados e transferidos para o software GraphPad Prism 5, para a obtenção dos dados estatísticos (MOSMAN,1983)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MAURILLO, L; POETA, G. D. ; VENDITTI, A.; BUCCISANO, F.; BATTAGLIA, A.; SANTINELLI, S. Quantitative analysis of FAS and bcl-2 expression in hematopoietic precursors. Haematologica, Pavia, v.86, n.3, p.237-243, 2001.
RAMENGHI, U.; BONISSONI, S.; MIGLIARETTI, G.; DEFRANCO, S.; BOTTAREL, F.; GAMBARUTO, C. Deficiency of the Fas apoptosis pathway without Fas gene mutations is a familial trait predisposing to development of autoimmune diseases and cancer. Blood. Washington, v.95, n.10, p.3176-82, 2000.
Vera Lúcia de Almeida, Andrei Leitão, Luisa del Carmen Barrett Reina, Carlos Alberto Montanari e Claudio Luis Donnici, Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-celular não específicos que interagem com o DNA: uma introdução. Quim. Nova, v.28, n.1, p. 118-129, 2005.
VERONIKA BANDARA, SCOTT A. WEINSTEIN, JULIAN WHITW, MICHAELEDDLESTON. A review of the natural history, toxinology, diagnosis and clinical management of Nerium oleander (common oleander) and Thevetia peruviana (yellow oleander) poisoning. Toxicon, v. 56, p. 273–281, 2010.
SABIRA BEGUM, BINA S. SIDDIQUI, RAZIA SULTANA, ATIYA ZIA, AMIN SURIA. Bio-active cardenolides from the leaves of Nerium oleander. Phytochemistry, v.50, p.435-438, 1999.
Leonardo David Lomanto Díaz, Óscar Leonel Ortiz Cala, César Orlando Bretón Pinto, Álvaro Iván Gómez Lizcano, Viviana Matilde Mesa Cornejo. El ciclo celular. MEDUNAB 6(16): 21 - 29, 2003.
 Eliezer J. Barreiro. Biodiversidade: fonte potencial para a descoberta de fármacos. Quim. Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009.
Mary Ann Foglio, Carmen Lucia Queiroga, Ilza Maria de Oliveira Sousa, Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues. Plantas Medicinais como Fonte de Recursos Terapêuticos: Um Modelo Multidisciplinar. Divisão de Fitoquímica, CPQBA/UNICAMP. MultiCiencia, 7 de outubro 2006.
Lourdes Rodríguez Fragoso, Efrén Hernández Baltasar, Jorge A Reyes Esparza. El ciclo celular: características, regulación e importancia en el câncer. Biotecnología Aplicada, v.21, p. 60-69, 2004.
Ivana Grivicich, Andréa Regner, Adriana Brondani da Rocha. Morte Celular por Apoptose - Apoptosis: Programmed Cell Death. Revista Brasileira de Cancerologia, 53(3): p. 335-343, 2007.
K.-O. HAUSTEIN. Digitalis. Pharmac. Ther., v. 18, pp. I to 89, 1983.
M. Mostaqul Huq, A. Jabbar, M.A. Rashid, C.M. Hasan. A novel antibacterial and cardiac steroid from the roots of Nerium oleander. Fitoterapia, v.70, p. 5-9, 1999.
John F. R. Kerr, Clay M. Winterford, Assoc.Dipl.Appl.Biol,
Brian V. Harmon. Apoptosis Its Significance in Cancer and Cancer Therapy. Cancer, v. 73, n.8,1994.
Agnés Revol de Mendoza, Herminia Guadalupe Martínez Rodríguez, Hugo Alberto Barrera Saldaña. Control del ciclo celular y sus alteraciones. Medicina Universitária 6(22): p. 33-38,2004.
Tatjana Mijatovic a, Eric Van Quaquebeke a, Bruno Delest a, Olivier Debeir b, Francis Darro a, Robert Kiss. Cardiotonic steroids on the road to anti-cancer therapy. Biochimica et Biophysica Acta 1776, p. 32–57, 2007.
Maria Dulce Belo de Moura, Maria de Fátima AgrA. Apocynaceae tóxicas e medicinais ocorrentes nos estados de Pernambuco e Paraíba, Brasil. Acta boto bras. 3(2): 1989 supL.
Barbara Pratscher, Cornelia Friedricha,b, Wilfried Gogera,b, Matthew Allena,b, Dieter Finka, Christiane Thallingera,b, Markus Wolscheka, Klemens Freic, Christian Schöferd, Hubert Pehambergerb, Volker Wachecka, Poul HB Sorensene, Markus Müllera, Burkhard Jansena,b,f, Trevor Lucasa, b. Characterization of NKIP: A novel, Na+/K+-ATPase interacting protein mediates neural differentiation and apoptosis. Experimental Cell Research, v. 314, p. 463-477, 2008.
G. Prinsloo , J.J.M. Meyer , A.A. Hussein. Anti-HIV activity of a cardiac glycoside isolated from Elaeodendron croceum. Department of Botany, University of Pretoria, Pretoria 0002,South Africa, National Research Center, Dokki Cairo, Egypt
Luay J. Rashana, Katrin Frankea, Myint Myint Khinea,c, Gerhard Kelterd, Heinz H. Fiebigd, Joachim Neumanne, Ludger A. Wessjohanna,. Characterization of the anticancer properties of monoglycosidic cardenolides isolated from Nerium oleander and Streptocaulon tomentosum. Journal of Ethnopharmacology, v.134, p. 781–788, 2011.
Siu Kuin Wong, Yau Yan Lim1, Noor Rain Abdullah, Fariza Juliana Nordin. Assessment of antiproliferative and antiplasmodial activities of five selected Apocynaceae species. BMC Complementary and Alternative Medicine 11:3, 2011.
Rajnish Gupta, �� HYPERLINK "http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Kachhawa%2C+Jai+B.+S.%29" Jai B. S. Kachhawa, �� HYPERLINK "http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Gupta%2C+R.+S.%29" R. S. Gupta, �� HYPERLINK "http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Sharma%2C+Anil+Kumar%29" Anil Kumar Sharma, �� HYPERLINK "http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Sharma%2C+M.+C.%29" M. C. Sharma, �� HYPERLINK "http://informahealthcare.com/action/doSearch?action=runSearch&type=advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dobhal%2C+M.+P.%29" M. P. Dobhal. Phytochemical evaluation and antispermatogenic activity of Thevetia peruviana methanol extract in male albino rats. Human Fertility, v.14, n. 1, p 53-59, 2011.
Lı́gia Gata-Gonçalves, J.M.F Nogueira, Olı́via Matos, Raúl Bruno de Sousa. Photoactive extracts from Thevetia peruviana with antifungal properties against Cladosporium cucumerinum. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 70, p. 51-54, 2003.
Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 16;65(1-2):55-63, 1983.