Aula 2 Extrac807a771o de DNA PCR e Eletroforese

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Aula 2: 
Extração de DNA, PCR 
e Eletroforese 
Extração do DNA 
• O DNA em forma de dupla fita é muito estável e resistente a 
condições adversas; 
• Porém é vulnerável mesmo a forças leves originadas durante a 
pipetagem ou agitação que geram tensão na molécula e quebra das 
ligações fosfodiéster; 
• A quantidade de DNA que se obtém usualmente a partir de 20 ml 
de sangue é ~250 µg. 
 
A extração de DNA inclui basicamente os seguintes procedimentos: 
1. Lise das células; 
2. Purificação do DNA, separando-o de macromoléculas 
contaminantes, tais como proteínas e RNA, por digestão 
enzimática e/ou processos físico-químicos. 
3. Precipitação do DNA 
4. Eluição 
1. Lise 
a) SDS; 
b) Proteinase K; 
c) Mecânica (glass bead + vortex); 
d) Fisica (Nitrogênio líquido + Maceração); 
e) Temperatura. 
2. Purificação 
a) Fenol/Clorofórmio 
b) Fenol (Trizol, DANzol) 
c) Sal: Acetato de Potássio (5M) e Amônio (5M), etc. 
d) Colunas de cromotagrafia de afinidade 
3. Lavagem 
a) Etanol 80% 
b) Tampões 
4. Precipitação 
a) Etanol Absoluto 
b) Isopropanol 
c) NaCl 5M 
5. Eluição 
a) Água ultrapura 
b) Tampão TE (Tris-HCl/EDTA) 
Etapas da Extração de DNA 
SDS + Proteinase K SDS+PK 
Beads+Vortex 
N2 líquido 
Lise Celular 
Purificação - FENOL 
Purificação 
Kits de extração por Coluna de 
Cromatografia 
Kits de extração por Magnetismo 
Método molecular que parte 
de uma única cópia de DNA e 
amplifica, cria múltiplas 
cópias, desse mesmo DNA. 
Polymerase Chain Reaction- 
PCR 
• Inventada em 1983 por Kary Mullis 
• É uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios 
de pesquisas médicas e biológicas 
 
Aplicações: 
• seqüenciamento de genes 
• diagnóstico de doenças hereditárias 
• testes de paternidade e na medicina forense 
• diagnóstico de doenças infecciosas 
• Dentre outros 
 
PCR 
• DNA 
• dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) 
• Iniciadores (também chamados de primers) 
• DNA polimerase 
• Cloreto de Magnésio 
• Solução tampão 
 
 
Reação de PCR 
Toda esta mistura é colocada no 
termociclador, que faz ciclos de 
temperatura pré-estabelecidos 
com tempos exatos. 
Reação de PCR 
Desnaturação 
Processo no qual ocorre a separação da fita dupla de 
DNA por meio da elevação da temperatura. 
As amostras são aquecidas a 94ºC - 96ºC durante um a 
vários minutos. 
Anelamento ou Hibridação 
A temperatura é reduzida a 55ºC - 65ºC durante 
alguns segundos. 
Os iniciadores hibridam com as sequências 
complementares do DNA molde 
Extensão 
 
 
 
Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns 
segundos. 
A DNA polimerase faz a duplicação da cadeia a 
partir dos iniciadores 
Video PCR 
Touchdown PCR 
Touchdown PCR 
Nested PCR 
Nested PCR 
Nested PCR 
Real Time PCR 
PCR Tempo Real 
O princípio da PCR em tempo real é idêntico ao da 
PCR convencional, exceto pelo fato de que os 
processos de amplificação e detecção são combinados 
para permitir o monitoramento do processo de 
amplificação, uma vez que este ocorre em tempo real. 
Os dados de PCR em Tempo Real são plotados em 
gráficos. 
Métodos de Detecção dos 
produtos da PCR em tempo real 
Detecção Específica 
RT PCR 
RT PCR 
RT PCR 
RT PCR 
ELETROFORESE 
• Após: 
– Extração 
– Quantificação 
– PCR 
 
• Visualização do resultado da amplificação pelo procedimento 
de Eletroforese 
Utilização 
• Eletroforese  Consiste na migração e separação de 
partículas em uma matriz (suporte), submetidas a uma 
diferença de potencial elétrico; 
 
• Os suportes podem ser: 
– Papel de filtro 
– Acetato de celulose 
– Gel de agarose 
– Gel de poliacrilamida 
 
• A migração das partículas depende do seu tamanho e 
carga, além da DDP (Diferença De Potencial) a que 
foram submetidas 
Princípio 
• Eletroforese em gel é eficiente em promover a separação de partículas 
de acordo com o seu tamanho 
– Gel de poliacrilamida 
• Usado em separação de proteínas ou partículas muito pequenas 
 
– Gel de agarose 
• Utilizado para separação de partículas relativamente pequenas 
e partículas grandes 
 
• O DNA contém carga negativa, portanto migra para o pólo positivo 
 
• Quanto mais concentrado o gel, mais “fechada’’ é sua malha, portanto 
a partícula terá mais dificuldade em atravessá-la 
 
Eletroforese em Gel 
A amostra é inserida 
nos “pocinhos” 
Uma corrente 
elétrica é aplicada 
Partículas de menor 
tamanho ou carga 
mais negativa corre 
primeiro 
Princípio 
Princípio 
O ladder é formado por 
diferentes tamanhos de 
DNA e serve como 
marcador de peso 
molecular 
Quando submetidas a 
luz UV o gel apresenta 
um padrão de bandas. 
Cada banda é um 
fragmento de DNA de 
determinado tamanho 
• A agarose, um polissacarídeo extraído de uma alga 
marinha vermelha; 
• Dissolve em água fervente e então gelifica quando 
esfria; 
• Mais utilizada para separação de fragmentos longos de 
DNA 
Gel de Agarose 
• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma fonte 
• Uma solução tampão é adicionada à cuba, onde irá 
manter estáveis as condições de pH do meio 
Gel de Agarose 
• Brometo de etídio 
– Agente intercalante do DNA 
• Cancerígeno! 
– Composto fluorescente à luz UV 
• Nitrato de prata 
• Gel Red 
Intercalantes 
Visualização do gel de agarose 
em luz UV 
Gel de Poliacrilamida 
Gel de Poliacrilamida 
Gel de Poliacrilamida