Cultura celular

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Cultura celular
Células epiteliais em cultura. Em vermelho, queratina e em verde, DNA.
Cultura celular ou cultura de células é o processo pelo qual células procariotas ou eucariotas são desenvolvidas sob condições controladas. Na prática, a expressão "cultura celular" surgiu como referência a cultura de células derivadas de eucariotas multicelulares, especialmente células de animais. O desenvolvimento histórico e os métodos da cultura celular estão intimamente relacionados com aqueles da cultura de tecidos e da cultura de órgãos.
A cultura de células de animais tornou-se uma técnica laboratorial rotineira na década de 1950, mas o conceito de manter linhagens de células vivas separadas do seu tecido-fonte original foi descoberto no século XIX.[2]
Referências e notas
↑ ""Cell Culture"". Consultado em 19-04-2006. 
↑ ""Some landmarks in the development of tissue and cell culture."". Consultado em 19-04-2006. 
MACLEOD, R. A. F. et al.. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumour cell lines . "International Journal of Cancer", 83:555–563, 1999.
MASTERS, John R. HeLa cells 50 years on: the good, the bad and the ugly. "Nature Reviews
Recombinação Gênica
Por Mayara Cardoso
A recombinação gênica (ou genética) refere-se à troca de genes entre duas moléculas de ácido nucléico, para formar novas combinações de genes em um cromossomo.
Se dois cromossomos de rompem e se unem novamente, alguns genes transportados por esses cromossomos são trocados, processo esse denominado crossing over. Os cromossomos originais se recombinam, de modo que cada um agora transporta uma parte dos genes do outro.
Em eucariotos, a recombinação genética é um processo ordenado, que normalmente ocorre como parte do ciclo sexual do organismo. A recombinação geralmente acontece durante a formação das células reprodutivas, de modo que essas células contenham DNA recombinante. Já em bactérias, a oportunidade para a recombinação genética pode surgir de várias maneiras diferentes, mas em todos os casos, duas moléculas de DNA são unidas.
Um dos processos que podem ocorrer para uma recombinação é a chamada conjugação, em que uma bactéria transfere DNA em um sentido para outra bactéria por contato célula-célula. O DNA transferido pode ser parte ou todo o genoma bacteriano ou pode ser um elemento de DNA extragenômico denominado plasmídio.
No processo de conjugação, uma bactéria atua como doadora e outra como receptora, em que a primeira transfere parte do seu material genético para a outra, e a segunda apenas o recebe e incorpora ao seu genoma. O fato de uma bactéria ser doadora e outra receptora de deve à presença do fator fertilidade (F), as linhagens que carregam tal fator são designadas F+ e podem doar DNA, as que não possuem, não doam e são denominadas F-.
Uma célula bacteriana também pode obter um pedaço de DNA do ambiente e incorporar esse DNA a seu próprio cromossomo, processo chamado transformação. Esse DNA pode ser proveniente de células da mesma espécie ou de outras espécies que morreram, mas ainda se encontram dispersas pelo ambiente, ou, mesmo, secretado por bactérias ainda vivas. Esses pedaços isolados de DNA são captados pelas células bacterianas através da parede celular e da membrana plasmática.
A transformação é muito útil no ramo da Engenharia Genética, processo de manipulação de genes de modo a inserir novas características, determinando, novas funções à bactéria transformada. Exemplo disso é o uso de bactérias na produção de insulina, em que tais microrganismos têm seu genoma modificado através da introdução de genes humanos que ordenam a fabricação desse hormônio, passando, assim, a produzi-lo.
Em outros casos, ainda, alguns vírus que parasitam células bacterianas (chamados bacteriófagos, ou simplesmente fagos) podem captar um pedaço de DNA de uma bactéria e injetá-lo em outra, podendo ser incorporado ao cromossomo, num procedimento conhecido como transdução. Os próprios fagos podem sofrer recombinação quando dois genótipos diferentes infectam a mesma bactéria (recombinação de fagos).
Os fagos que participam do processo de transdução podem ser distinguidos pelo seu ciclo, alguns são virulentos, que lisam (lise = quebra) imediatamente a célula hospedeira, ciclo denominado lítico, outros são temperados, ou seja, podem permanecer dentro do hospedeiro por um determinado período sem destruí-lo, o ciclo lisogênico. Apenas os fagos temperados podem ser transduzidos.
Assim como a mutação, a recombinação gênica contribui para a diversidade genética de uma população, que é a base do processo evolutivo.
Referências bibliográficas:
CASE, Christine, FUNKE, Berdell, TORTORA, Gerard. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005.
CLONAGEM GÊNICA
O que é?
Clonagem gênica consiste na inserção de
um segmento selecionado de DNA em um
plasmídeo ou no cromossomo de um
bacteriófago, que atuam como vetores de
clonagem, e posteriorreplicação desse DNA
recombinante em um hospedeiro apropriado,
como uma bactéria ou uma célula de
levedura. Essa replicação ocorre quando o
sistema de síntese do DNA do hospedeiro
replica o DNAinserido na célula hospedeira.
Dessa forma, a partir de uma dessas células
transformadas são obtidas, graças a divisão
celular, um grande número de células
idênticas, cada uma dotada de várias copias
doDNA recombinante.
Por definição, clonagem gênica é a
replicação de genes a partir de fragmentos
de DNA através da utilização de um material
genético auto duplicante.
CLONAGEM
O QUE É?
A clonagemé natural em todos os seres
originados a partir de reprodução assexuada
(ou seja, na qual não há participação de
células sexuais), como é o caso das
bactérias, dos seres unicelulares e mesmo
da relvade jardim. A clonagem natural
também pode ocorrer em mamíferos, como
no tatu e, mais raramente, nos gêmeos
univitelinos. Nos dois casos, embora haja
reprodução sexuada na formação do ovo,
osdescendentes idênticos têm origem a
partir de um processo assexuado de divisão
celular. Os indivíduos resultantes da
clonagem têm, geralmente, o mesmo
genótipo, isto é, o mesmo patrimônio
genético.
Podemosdefinir a clonagem como um
método científico artificial de reprodução
que utiliza células somáticas (aquelas que
formam órgãos, pele e ossos ) no lugar do
óvulo e do espermatozoide. Vale lembrar que
éum método artificial, pois, como sabemos,
na natureza, os seres vivos se reproduzem
através de células sexuais e não por células
somáticas. As exceções deste tipo de
reprodução são os vírus, asbactérias e
diversos seres unicelulares.
A primeira experiência com clonagem
de animais ocorreu no ano de 1996, na
Escócia, no Instituto de Embriologia Roslin.
O embriologista responsável foi o doutor...
Clonagem gênica
Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante
ou engenharia genética) consiste na inserção de
um segmento selecionado de DNA (DNA doador
ou inserto) em um plasmídio ou no cromossomo
de um bacteriófago, que atuam como vetores de
clonagem, e posterior replicação desse DNA
recombinante em um hospedeiro apropriado,
como uma bactéria ou uma célula de levedura.
Essa replicação ocorre quando o sistema de
síntese do DNA do hospedeiro replica o DNA
inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a
partir de uma dessas células transformadas são
obtidas, graças à divisão celular, um grande
número de células idênticas (clones), cada uma
dotada de várias cópias do DNA recombinante
(figura abaixo).
O clone, uma vez formado, pode ser sequenciado
e comparado com outras sequências já
descritas; ser utilizado no estudo da expressão
gênica do(s) gene(s) contido(s) no clone; ser
alterado especificamente por mutagênese sítio
dirigida ou ser usado para gerar um produto de
interesse comercial.
As técnicas de engenharia genética, área
importante da biotecnologia, manipulam,
portanto, as células para exprimir e/ou alterar
genes clonados. Essa tecnologia, envolvendo
multiplicação de fragmentos selecionados de
DNA, tem levado a produçãode várias proteínas
humanas de interesse médico, como fatores de
coagulação sanguínea, antitrombina, albumina
sérica humana, hormônio de crescimento,
gonadotropina humana, interleucinas, interferons
e insulina, que foi a primeira proteína humana
produzida através dessa tecnologia em bactérias
e aprovada para uso em humanos. Através dessa
tecnologia, podem ser obtidas, também,
proteínas que servirão para a produção de
vacinas (heptatite B, herpes, gripe, malária,
etc.). Neste contexto, a produção de vacinas
contra o vírus HIV, por exemplo, representa uma
esperança para o controle da AIDS.
A pecuária e a agricultura também têm sido
beneficiadas pela clonagem gênica. A introdução
de genes em animais e plantas tem favorecido a
cura de doenças genéticas, aumentado a
produtividade das plantas e do gado e tornado
cereais mais resistentes a doenças diversas.
Assim sendo, plantas têm sido modificadas para
torná-las resistentes a insetos e a plantas
infestantes. Trabalhos vêm sendo feitos no
sentido de introduzir em alguns cereais (trigo,
arroz, cevada, milho, etc.) genes bacterianos
capazes de transformar o nitrogênio atmosférico
em amônia (fixação biológica do nitrogênio).
Esses trabalhos permitirão o crescimento dos
cereais sem a necessidade de adição de
fertilizantes de nitrogênio, muitas vezes
prejudiciais ao ambiente, além de bastante
dispendiosos. Outra conquista da biotecnologia
aplicada à agricultura foi a possibilidade de
manipular geneticamente a resistência a pestes
em plantas, visando reduzir sua dependência de
pesticidas químicos. O gene codificador da
toxina capaz de matar larvas de certas pragas
de insetos foi isolado da bactéria Bacillus
thuringiensis e transferido para o tomate, o
milho, a batata e plantações de algodão. Dessa
forma, quando o gene é expresso produz a toxina
inseticida, levando à morte as larvas que comem
a planta.
A recombinação entre moléculas de DNA de
diferentes organismos é um fenômeno comum na
natureza. Alguns fagos, por exemplo, têm a
capacidade de inserir seu genoma no
cromossomo da Escherichia coli, mudando o
conteúdo genético da célula. Vez por outra, ao
receber nova informação genética do vírus, uma
bactéria pode se tornar patogênica. Essa
modificação genética provocada por vírus,
denominada conversão lisogênica, é um exemplo
de engenharia genética presente na natureza.
Uma clonagem de genes envolve cinco
componentes principais, relacionados no quadro
a seguir.
COMPONENTES FUNÇÃO
DNA doador
(inserto)
Fonte do gene a ser
clonado.
Endonuclease de
restrição
( tesoura genética)
Enzima usada para cortar
o DNA doador e o DNA do
vetor em locais
específicos, de modo que
o gene a ser clonado
possa ser inserido no
vetor.
Vetor de clonagem Plasmídio ou
“cromossomo” de
bacteriófago usado para
introduzir o gene a ser
clonado numa célula
hospedeira apropriada.
DNA ligase Enzima usada para unir as
extremidades livres e
adaptáveis (coesivas,
adesivas ou “pegajosas”)
do DNA do vetor e do DNA
doador, formando um
vetor recombinante.
Célula hospedeira Célula na qual o vetor
recombinante é
introduzido de modo a
obter grandes quantidades
da molécula de DNA
recombinante. Geralmente
é uma bactéria ou uma
célula de levedura.
ENDONUCLEASE DE RESTRIÇÃO (ENZIMA DE
RESTRIÇÃO)/ OPERÁRIA DA TECNOLOGIA DO
DNA RECOMBINANTE
Em bactérias, as endonucleases de restrição
( tesouras genéticas ), assim denominadas por
cortarem sítios restritos no interior do DNA em
dupla-hélice, fazem parte de um sistema de
proteção contra infecção por bacteriófagos (vírus
que atacam bactérias), também conhecidos
como fagos . Graças a essas enzimas,
descobertas no final dos anos 1960, o DNA viral
injetado na bactéria pode ser destruído antes
que se duplique, protegendo-a contra DNAs
estranhos. As bactérias, por seu turno, também
sintetizam enzimas, como a DNA
metiltransferase, que, adicionando o grupo metil
(grupo protetor) ao DNA cromossômico (DNA
bacteriano), as protegem de suas próprias
endonucleases de restrição (figura a seguir). Há,
portanto, um sistema que protege a bactéria
contra a entrada de informação indesejável (DNA
estranho) e ao mesmo tempo protege da sua
própria informação evitando que o seu DNA se
degrade. Na tecnologia do DNA recombinante, as
enzimas restrição são usadas para se obter, com
precisão, fragmentos bem definidos de DNA a
fim de serem implantados em outras moléculas
de DNA cortadas pela mesma enzima. Dessa
forma, o uso apropriado dessas tesouras
genéticas permite, em face do corte ser
realizado em regiões definidas, o isolamento de
fragmentos discretos de DNA, uniformes em
tamanho e capacidade de codificação.
Atualmente são conhecidas e catalogadas
centenas de enzimas de restrição entre as quais
citamos: Bam HI, EcoRI, Hind III, Ava lI, AluI,
Bg lII, PstI, BalI, SmaI, HaeIII, Taq I, Hha I e Sal I
(denominações derivadas das estirpes
bacterianas a partir das quais foram isoladas).
Elas são isoladas das bactérias, comercializadas
por grandes empresas da área de Biologia
Molecular e cortam o DNA dentro de uma
sequência específica de 4 a 8 pares de bases
(pb), denominada sequência de reconhecimento
(sítio de restrição). Dessa forma, moléculas
idênticas de DNA, quando tratadas com
determinada endonuclease de restrição, são
cortadas nos mesmos pontos, gerando
fragmentos de mesmo tamanho, com duas
extremidades adesivas. O quadro abaixo mostra
a sequência de reconhecimento (sequência de
corte no DNA) de três dessas enzimas (BamHI,
EcoRI e HindIII).
A figura a seguir mostra, esquematicamente,
como as enzimas de restrição agem na
engenharia genética. Elas reconhecem e atuam
sobre sequências específicas do DNA,
catalisando a quebra de uma ligação fosfodiéster
entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a
determinadas bases. Um corte num fragmento
de DNA por uma enzima de restrição forma
fragmentos com extremidades coesivas. Os
cortes tanto no DNA inserto, gerando o segmento
enxerto, quanto no DNA vetor devem ser feitos
pela mesma tesoura genética , portanto no
mesmo sítio de reconhecimento. Em função
disto, aparecem extremidades soltas
complementares capazes de se ligarem. O
resultado da união, feita pela DNA ligase, é um
DNA recombinante (molécula híbrida),
constituído pelo vetor e pelo gene enxerto,
proveniente do DNA inserto.
VETOR DE CLONAGEM
Um vetor de clonagem (carreador de gene para
uma célula hospedeira) é uma molécula de DNA
à qual genes estranhos (insertos) podem ser
ligados, formando um DNA recombinante (figura
abaixo), e, posteriormente, inserido nas células
hospedeiras, onde se replica. Ele é, portanto, um
propagador de inserto no hospedeiro. Vários tipos
de vetores podem ser utilizados nas experiências
de clonagem. Os mais frequentes, contudo, são
os plasmídios e os vírus bacterianos (vírus
transdutores), pelo fato de serem facilmente
introduzidos nas células e facilmente
manipuláveis no laboratório.
Plasmídios ou plasmídeos (figura a seguir), cujo
número varia de1 a 100 cópias por célula, são
pequenos DNAs circulares (1 a 400 kpb) de
cadeia dupla e extracromossomiais (separados
do DNA cromossômico ).
Cada plasmídeo contém uma sequência de DNA
que serve como origem de replicação ou ori
(ponto de início da replicação) que torna sua
duplicação independente da replicação do DNA
cromossômico. Os plamídeos ocorrem
naturalmente em muitas bactérias e, a exemplo
do cromossomo bacteriano, presente no
nucleoide, também veiculam informações
genéticas. Embora possuam genes para a própria
replicação, eles não são, em condições normais,
essenciais para a sobrevivência da célula,
podendo ser perdidos sem causar a morte
celular. Na figura abaixo, que é o diagrama de
um plasmídio, observamos, além da região de
inserção do gene a ser clonado, e da origem de
replicação ( ori ), o gene seletivo amp
condificador da enzima b -lactamase , que inativa
a amplicilina (antibiótico). Ressaltamos que,
além dos genescitados ( ori e amp ), a grande
maioria dos plasmídios, possui informações
genéticas que codificam para outros antibióticos
(tetraciclina, estreptomicina, etc.), para toxinas,
para resistência a metais pesados, etc. A região
ori é essencial, como vimos anteriormente, para
a sua replicação autônoma, assegurando, dessa
forma, a sua transmissão à descendência da
célula bacteriana. É necessário, portanto, que
essa região não seja alterada durante a
clonagem. A presença de um fator de resistência
a um antibiótico, como o gene amp , é também
muito importante para o sucesso da clonagem, já
que ele atua como uma forma de marcador para
seleção de células contendo o plasmídio. Assim
sendo, células portadoras do vetor (portadoras do
DNA recombinante) são capazes de sobreviver
em meio de cultura contendo o antibiótico,
enquanto as células não infectadas (desprovidas
do DNA recombinante) não são viáveis. Os
plasmídios são, sem dúvida, os vetores de
clonagem mais usados.
O material genético dos bacteriófagos
(principalmente do fago lambda), vírus que
infectam bactérias e também usado como vetor
de clonagem, possui genes essenciais para sua
reprodução, a exemplo dos plasmídeos, bem
como genes que não se relacionam diretamente
com a multiplicação viral. Os primeiros se
situam, via de regra, nas extremidades do DNA
viral, enquanto os que não se relacionam
diretamente com a reprodução, localizam-se na
região mediana. Essa distribuição facilita a ação
das enzimas de restrição, que, separando os dois
grupos de genes, permite a introdução, no lugar
dos genes não essenciais à reprodução viral, do
gene a ser clonado. A molécula recombinante é,
então, introduzida em fagos vazios que são
então utilizados para infectar bactérias e
propagar o gene de interesse. É, dessa forma,
que muitos pesquisadores utilizam vírus
modificados como vetores para transporte,
inclusive, de genes terapêuticos.
Independentemente do tipo, os vetores devem
possuir certas características que se adequem à
clonagem. A tabela a seguir mostra algumas
dessas características.
CARACTERÍSTICAS FUNÇÕES
Serem estáveis na
célula hospedeira
Permite a replicação
Controlarem a sua
própria replicação
Permite a sua
replicação dentro da
célula com um elevado
número de cópias
Possuírem pequenas
dimensões
Permite uma rápida
introdução na célula
Serem cortados em um
só local por uma
enzima de restrição
Permite a inserção do
DNA doador e a
circularização do
sistema recombinante
Não serem transferidos
por conjugação
Evita que o DNA
recombinante se
dissemine para as
populações naturais de
bactérias
Terem características
facilmente detectáveis
(marcadores seletivos,
como resistência a
anbibióticos)
Torna possível
distinguir as células
transformadas das não
transformadas
Serem facilmente
isolados das células
Aumenta o rendimento
dos sistemas
recombinantes
LIGAÇÃO
Preparadas, in vitro , as moléculas de DNA que
se pretende recombinar, promove-se a ligação.
Considerando-se que o vetor de clonagem e o
fragmento de DNA inserto tenham sido clivados
pela mesma tesoura genética , a compatibilidade
das extremidades coesivas (adesivas ou
pegajosas) formadas, torna possível o
emparelhamento entre as bases
complementares, através das pontes de
hidrogênio. A figura abaixo mostra essas
extremidades após clivagem pela enzima de
restrição Eco RI. Como se pode constatar, as
extremidades coesivas apresentam um pequeno
número de nucleotídeos em cadeia simples que
permite sua união com outro fragmento de DNA
pela complementariedade das bases.
Por fim, graças à ação da DNA ligase ocorre a
ligação covalente (ligação fosfodiéster, mas
precisamente ligação 3′-5′ fosfodiéster) entre os
dois nucleotídeos das extremidades das duas
moléculas a serem unidas. A ação da DNA ligase
consiste em catalisar a união entre o grupo
fosfato ligado ao carbono 5′ e o grupo hidroxila
ligado ao carbono 3′ das moléculas de
desoxiribose presentes no DNA (figura a seguir),
numa reação que requer ATP.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Algumas estirpes bacterianas e de levedura
foram propositadamente desenvolvidas para
serem utilizadas na clonagem gênica. Para que
um dado plasmídio, por exemplo, se replique nas
células hospedeiras, elas devem reconhecer a
origem de replicação ( ori ) do vetor de clonagem
e nem todos eles possuem a mesma origem de
replicação. Com o intuito de reduzir a
probabilidade de infecções acidentais de pessoas
que trabalham nos laboratórios de biotecnologia,
bem como da população em geral, as células
hospedeira não devem se reproduzir na natureza.
Visando impedir a disseminação do DNA
recombinante nas populações naturais dos
organismos, deve-se, também, evitar a
transferência desse DNA de uma célula
hospedeira para outra.
A escolha da célula hospedeira está, via de
regra, relacionada com o objetivo da clonagem.
Se a intenção é promover uma análise estrutural
do gene isolado, deve-se, preferencialmente,
utilizar um sistema simples que seja fácil de
usar. Se o objetivo, por outro lado, é expressar
as informações genéticas em grandes eucariotos,
deve-se utilizar sistemas mais específicos. Esses
dois objetivos, entretanto, não são mutuamente
exclusivos. Com relativa frequência, um
hospedeiro primário simples é usado para isolar a
sequência desejada, que, em seguida, é
introduzida em um sistema mais complexo, onde
se expressa.
A figura abaixo mostra, esquematicamente, os
eventos básicos em uma experiência de
clonagem gênica.
1. Um fragmento de DNA contendo o gene a ser
clonado é inserido em um vetor de clonagem,
geralmente um DNA circular, formando uma
molécula de DNA recombinante.
2. Introdução da molécula de DNA recombinante
na célula hospedeira.
3. Multiplicação da molécula de DNA
recombinante no interior da célula hospedeira,
formando várias cópias idênticas, processo
conhecido como amplificação.
4. Divisão da célula hospedeira e consequente
passagem para a prole, de cópias da molécula de
DNA recombinante.
5. Formação de um clone, colônia de células
cada uma contendo cópias múltiplas da molécula
de DNA recombinante, graças a sucessivas
divisões celulares.
Dentre as colônias transformadas com o vetor
recombinado é necessário selecionar aquelas
que contêm, de fato, o gene de interesse,
excluindo, assim, aquelas que não contêm o
vetor ou contêm o vetor vazio . Essa seleção é
feita através de genes marcadores contidos no
vetor, como foi mencionado acima.
Reiteramos que as bactérias, em especial a
Escherichia coli, são bastantes usadas como
hospedeiras na clonagem, constituindo-se um
dos principais materiais biológicos utilizados na
tecnologia do DNA recombinante. Essa
preferência se deve, principalmente, ao fato de
elas se multiplicarem rapidamente num meio de
crescimento normal de laboratório e dos seus
genomas já serem bastante conhecidos.
Entretanto, elas nem sempre se mostram
adequadas para todos os tipos de experiências
de clonagem. Há situações em que a clonagem e
a expressão de genes se realizam melhor em um
hospedeiro eucariótico. Nestes casos, a
levedura, Saccharomyces cerevisae, tem sido o
organismo escolhido. Essa levedura é
provavelmente o melhor caracterizado de todos
os eucariontes. Ela vem há séculos sendo
utilizada na produção de pão e de cerveja e
cresce bastante bem, a exemplo da Escherichia
coli, nas condições normais de laboratório, em
meio de cultura líquido. Possui um genoma de
aproximadamente 2 x 10 pares de bases
contidos em 17 cromossomos lineares e algumas
estirpes são dotadas de um tipo especial de
plasmídio de 2μm, como é conhecido, que
possui 6318 pares de bases. Nas células, o
número de cópias desse plasmídio varia entre 70
e 200.
INTRODUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE NA
CÉLULA HOSPEDEIRA
A introdução do DNA recombinante na célula
hospedeira pode ser feita por vários métodos,
dos quais citamos: eletroporação, lipofecção e
co-precipitação (precipitação com fosfato de
cálcio). A escolhado método é feita de acordo
com a patologia, a célula ou tecido-alvo, o
tamanho e tipo de transgene (gene de interesse)
a ser expresso e o tempo e quantidade de
expressão que se deseja obter, entre outros
fatores.
I. Eletroporação
O método usado em muitos laboratórios para
introduzir moléculas de DNA recombinantes nas
células hospedeira é a eletroporação (figura a
seguir). Essa técnica consiste, em linhas gerais,
em misturar uma suspensão de células
hospedeiras, em fase exponencial de
crescimento, com uma suspensão da molécula
do DNA recombinante (DNA a ser transferido),
submetendo-se, em seguida, o complexo a
pulsos elétricos curtos (pouco milissegundos) de
alta voltagem. A corrente gerada altera a
estrutura da membrana celular, abrindo poros
temporários aquosos ( aquaporinas) na
bicamada lipídica que possibilitam a entrada do
DNA recombinante na célula-alvo. O método
requer um equipamento denominado
eletroporador, que deve ser ajustado para cada
tipo de célula, considerando parâmetros como
capacitância, intensidade e duração do pulso
elétrico. Altos níveis de permeabilização
facilitam a entrada de DNA, mas diminuem a
viabilidade da célula. Assim sendo, é necessário
que se estabeleça uma curva de viabilidade da
célula em relação aos parâmetros aplicados. A
grande utilização desse método se deve ao fato
de ele ser rápido e eficiente, especialmente
quando se introduz DNA em células de difícil
transformação.
II. Lipofecção
Na lipofecção, a introdução do DNA
recombinante ocorre através de pequenas
vesículas esféricas formadas por bicamadas
concêntricas de fosfolipídios conhecidas como
lipossomos (figura abaixo). Elas são análogas à
membrana plasmática e se organizam
“espontaneamente” em meio aquoso. A
flexibilidade estrutural, seja no tamanho, na
composição e na fluidez da bicamada, bem como
a sua capacidade de incorporar uma variedade
de compostos tanto hidrofílicos como
hidrofóbicos, fazem dos lipossomos excelentes
condutores do DNA recombinante.
Como se pode constatar na figura a seguir, os
lipossomos se fundem com a membrana celular
e depositam o DNA recombinante diretamente no
interior das células hospedeiras.
III. Co-precipitação ( precipitação com fosfato de
cálcio)
Este método foi um dos primeiros sistemas
descritos e apresenta algumas vantagens pela
segurança, simplicidade e custo. Ele se baseia
no fato de que as células absorvem de forma
eficiente o DNA quando este forma um
precipitado com fosfato de cálcio. Desse modo,
quando cloreto de cálcio é adicionado ao DNA,
que está diluído em tampão fosfato, forma-se um
precipitado de fosfato de cálcio e DNA, que é
absorvido pelas células em cultura (figura
abaixo). Embora seja um método muito simples,
sua reprodutibilidade e eficiência são muito
baixas. A taxa de transferência é de apenas uma
em cada 10 células.
Apesar de algumas células, como os linfócitos,
apresentem resistência à transfecção com
precipitados de fosfato de cálcio, esse é um dos
métodos mais usados na introdução de DNA em
células de mamíferos.
APLICAÇÕES DA ENGENHARIA GENÉTICA
Entre as “áreas” nas quais a técnica do DNA
recombinante tem provocado maior impacto,
citamos:
I. Estudo da estrutura dos genes, importante para
compreender os mecanismos que regulam a
expressão de um determinado gene em um
tecido e para deduzir a função do gene a nível
molecular. A engenharia genética possibilita,
igualmente, o estudo de anormalidades
genéticas, como alterações em oncogenes e em
genes supressores de tumor.
II. Obtenção de Organismos Geneticamente
Modificados (OGMs). Organismos em cujo
genoma foram introduzidos genes que conferem
características desejadas. Eles são dotados,
portanto, de alteração(ões) em trecho(s) do seu
genoma obtida(s) através da tecnologia do DNA
recombinante. Dentre as utilizações dos OGM
citamos:
a) produção de alimentos em maior quantidade e
qualidade;
b)produção de grandes quantidades de
substâncias com aplicação médica ou
farmacêutica, como insulina, hormônio do
crescimento e fatores de coagulação sanguínea;
c)produção de substâncias com aplicação
industrial;
d) biorremediação -modificação de organismos
no sentido de degradarem poluentes.
A utilização e a introdução no mercado dos
OGMs é um assunto controverso e que levanta
problemas éticos. Apesar das vantagens
associadas a esses organismos, o impacto sobre
o ambiente e a saúde humana decorrente de sua
utilização é, ainda, desconhecido e imprevisível.
III. Teste de paternidade. A comparação das
impressões digitais genéticas dos progenitores e
do(s) descendente(s) permite excluir a
paternidade ou confirmá-la com um elevado grau
de certeza.
IV. Investigação forense – permite a
identificação de suspeitos a partir de material
deixado num local, como cabelo, sangue,
esperma, etc. Permite, igualmente, a
identificação de cadáveres.
V. Aconselhamento genético. Processo pelo qual
paciente(s) e/ou parente(s) portador(es) de uma
doença ou com o risco de ter uma doença
hereditária são informados acerca da natureza
da doença, da probabilidade ou risco de
desenvovê-la e transmiti-la à próxima geração,
bem como das formas de preveni-la, evitá-la ou
melhorá-la.
VI. Diagnóstico pré-natal – permite a detecção
de doenças genéticas ainda durante a gravidez.
Ele antecipa, aos casais, o conhecimento da
saúde genética do feto e permite opções de
conduta.
VII. Obtenção, em grande quantidade, de
proteínas úteis aos seres vivos, inclusive ao
homem. Entre as quais, citamos: insulina,
hormônio do crescimento, gonadotrofina humana,
interferons, fatores de coagulação do sangue,
antitrombina, albumina sérica humana e fator de
necrose tumoral.
VII. Terapia gênica (geneterapia).
TERAPIA GÊNICA (GENETERAPIA)
A terapia gênica é o reparo ou substituição de
um gene defeituoso visando o tratamento e a
cura de uma doença genética. Ela já foi usada
com sucesso na correção da Síndrome de
Imunodeficiência Congêntica, provocada por
mutações no gene codificador da enzima
Adenosina Deaminase (ADA) e na Fibrose Cística
(também conhecida como Mucoviscidose),
causada por mutações no gene codificador da
proteina CFTR ( Cystic Fibrosis
Transmembrane Regulator/ regulador de
condutância transmembranar de fibrose cística),
que intervém na produção de suor, dos sucos
digestivos e dos mucos. O gene que codifica a
proteína CFTR está situado no braço longo do
cromossomo 7. Milhares de pacientes já se
beneficiaram da geneterapia, que tem
vislumbrado novos horizontes visando o
tratamento ou mesmo a cura de doenças graves.
Conquanto alguns sucessos já tenham sido
obtidos, muita pesquisa ainda precisa ser feita,
principalmente no que diz respeito ao
desenvolvimento de vetores de clonagem seguros
para transporte dos genes de interesse. O custo,
ainda elevado dessa terapia, torna-a pouco
praticável, nas condições atuais.
Embora, teoricamente, seja possível transformar
tanto células somáticas quanto células
germinativas, a terapia gênica feita atualmente
em humanos trabalha com correção das células
somáticas (terapia gênica somática),
proporcionando resultados satisfatórios aos
pacientes, sem afetar, contudo, os genes das
gerações futuras. A capacidade de corrigir
defeitos genéticos ao nível da linhagem
germinativa (terapia gênica da linhagem
germinativa), conquanto seja tecnicamente
viável, suscita, por ter a propriedade de alterar o
conjunto gênicos das gerações futuras, uma série
de questões éticas. A mais importante delas
consiste em como evitar abusos potenciais da
tecnologia, que pode, por exemplo, ser usada
como parte de programas eugênicos para
melhorar a constituição genética de indivíduos
específicos ou até mesmo de grupos sociais.
Há, atualmente, receio de que a terapia gênica,
que visa, inclusive, recuperar músculos afetados
pela idade ou por doenças, como a distrofia
muscular, possa ser usada por atletas de elite
para aumentar o tamanho, a força e a resistência
do músculo,constituindo-se o que se denomina
doping genético . Chegará um tempo em que
manipular o DNA será tão comum para obter
uma melhora no desempenho competitivo, que
não teremos mais olimpíada sem atletas
geneticamente modificados. O doping genético
pode ser obtido, adicionando-se ao músculo,
através de um veículo transportador (vetor de
clonagem), um gene sintético. Esse vetor leva o
referido gene para o interior do núcleo, onde ele
começa a “ordenar” que a fibra muscular produza
grandes quantidades de substâncias que
promovam as referidas alterações
musculares.Em face de o produto gênico só ser
encontrado no músculo, e não na urina ou no
sangue, essa nova forma de doping , capaz de
produzir atletas geneticamente alterados, não é
detectável pelos métodos convencionais. Apenas
uma biópsia, a princípio, poderia provar a
presença do gene sintético, o que dificulta,
sensivelmente, sua detecção pelas autoridades
esportivas. Lembramos que, uma vez dentro da
célula, o gene pode continuar ativo durante toda
a vida celular.
Apesar dos problemas éticos e das dificuldades
técnicas, num futuro próximo, uma ou duas
décadas, a terapia gênica será uma arma valiosa
para medicina combater uma série doenças
genéticas. Para se ter uma ideia, há quem
admita que, em algumas décadas, a vida humana
possa ser prolongada até os 120 anos, em
decorrência da manipulação de genes
relacionados com o envelhecimento. Atualmente,
vem sendo conduzida uma série de ensaios
clínicos para avaliar a capacidade de a terapia
gênica tratar diversas doenças de genes únicos.
À medida que o mapeamento e o
sequenciamento do genoma humano são
completados, as terapias baseadas em genes
podem se revelar como a última forma de
medicamentos produzida pelo homem.
CLONAGEM REPRODUTIVA
Além da clonagem gênica, aqui mencionada, que
consiste, em última análise, na produção de
vários pedaços idênticos de um trecho de DNA
inserido, via de regra, numa bactéria, devemos
considerar, também, outro tipo de clonagem que
consiste na produção de um organismo inteiro.
Como exemplos, citamos ovelha Dolly, clonada a
partir de uma célula extraída da mama de uma
ovelha adulta e a bezerra Vitória, primeiro
mamífero clonado no Brasil, originada a partir de
célula embrionária, extraída de um embrião de
cinco meses, que não chegou a nascer. O
nascimento de Dolly foi anunciado em fevereiro
de 1997, e o de Vitória, em 17 de março de 2001.
Como a ovelha doadora de célula para a
clonagem de Dolly já tinha seis anos na ocasião
do procedimento e em função do processo de
envelhecimento celular, que leva ao acúmulo de
mutações e alterações celulares, Dolly já nasceu,
do ponto de vista biológico, com seis anos de
vida. Nasceu, portanto, prematuramente velha.
Outra preocupação dos pesquisadores que
clonaram Dolly dizia respeito a sua fertilidade.
Ela, entretanto, deu nascimento a quatro ovelhas,
a primeira em 1998 e as três outras em 1999,
demonstrando que o animal clonado não era
estéril e podia se reproduzir sem maiores
problemas. Por outro lado, enquanto a maior
parte das ovelhas vive entre o onze e o doze
anos, Dolly morreu com apenas seis anos e meio,
após ter começado a manifestar,
prematuramente, doenças frequentemente
associadas à velhice. Em janeiro de 2002, por
exemplo, foi anunciado que Dolly apresentava
sinais de artrite no quadril e nos joelhos, doença
que, embora seja comum nas ovelhas velhas,
costuma aparecer em uma idade mais avançada.
O animal foi sacrificado após a descoberta de
sinais de uma doença pulmonar progressiva.
CLONAGEM TERAPÊUTICA
A clonagem terapêutica (terapia por transplante
nuclear ou técnica de transferência nuclear) é
um tipo de clonagem, que tem como objetivo a
obtenção de células-tronco embrionárias. Ela
descortina a possibilidade de, no futuro, uma
pessoa poder “reparar” defeitos no organismo
usando suas próprias células. Nessa clonagem,
um núcleo somático do paciente é transferido
para um óvulo enucleado que, em condições
adequadas de cultura, origina um “embrião”.
Este, cultivado in vitro até um estágio do
desenvolvimento embrionário denominado
blastocisto, é dissociado para a obtenção das
células tronco-embrionárias. Dessa forma, o
blastocisto não é implantado. Ele serve apenas
como uma massa de células que podem ser
consideradas células-tronco de alta versatilidade.
Essas células-tronco podem ser usadas para
restaurar a função de um órgão ou de um tecido,
transplantando novas células para substituir as
perdidas pela doença, bem como substituir
células que não funcionam adequadamente
devido a diferentes causas (defeitos genéticos,
lesões da coluna cervical, acidente vascular
cerebral, doenças sanguíneas, etc.). Lembramos
que as células-tronco adultas não possuem a
capacidade de se transformarem em qualquer
tecido, sendo, portanto, menos versátil que as
embrionárias.