MÉTODOS CROMATOGRAFICOS

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Professora Cláudia Sampaio de Andrade Lima 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Recife - 2009 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
Cromatografia é um processo físico de separação, no qual os componentes a 
serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. 
Em sua expressão mais simples, podemos definir a cromatografia como um 
processo de análise imediata por migração diferencial dos componentes de uma mistura, 
dentro do sistema cromatográfico. 
As origens da Cromatografia estão muito relacionadas com o estudo de produtos 
naturais e as dificuldades em relação à purificação desses compostos levaram à melhoria 
na performance dos processos de extração e isolamento. 
Para resolver problemas de análise, é indispensável a escolha da técnica 
cromatográfica mais apropriada, em função da natureza das substâncias a separar. 
Uma grande parte dos problemas de separação de compostos orgânicos são 
resolvidos com o conhecimento dos fenômenos de adsorção e partição, porém a 
cromatografia, nas suas várias versões, é um método de escolha na separação de 
biomoléculas. Somente na área de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) 
encontram-se aplicações na indústria farmacêutica, biotecnologia, investigação 
biomédica e bioquímica, energia, alimentação, cosméticos, meio ambiente e vitaminas. 
Com o crescente interesse no descobrimento de novos metabólitos de várias fontes 
(vegetal, de microrganismos e organismos superiores marinhos e terrestres) existe a 
necessidade de separação de misturas em pequenas quantidades, de maneira rápida, 
eficaz e econômica. 
 
 
 
HISTÓRICO 
 
Em 1906, um botânico russo, chamado TSWETT, estudava os pigmentos dos 
vegetais. Ele queria filtrar uma solução de pigmento de folhas verdes em éter de 
petróleo, com a ajuda de um tubo de vidro cheio com carbonato de cálcio. Ele observou 
a formação de uma série de bandas horizontais coloridas, amarelas e verdes, 
correspondentes aos diferentes constituintes da mistura, que se encontravam assim 
fracionados. Desta forma foi lançada a base da técnica cromatográfica. 
 Vinte e cinco anos passaram-se até que, em 1931, KUHN e LEDERER mostram 
a importância da técnica de TSWETT, na separação de a e β-carotenos. 
 Em 1941, MARTIN e SYNGE, estudando a solubilidade de aminoácidos 
acetilados em diferentes solventes, descobriu a cromatografia de partição, cromatografia 
líquido-líquido (contra-corrente). 
 CONDSEN e CORDON foram os precursores da cromatografia de partição 
sobre papel, utilizando uma coluna de vidro cheia de rodelas de papel de filtro 
superpostas, para a separação de amino-ácidos não acetilados. 
 Em 1938, IZMAILOW e SCHRAIBER, descreveram um método onde utilizava-
se camadas finas de alumina sobre placas de vidro. Onze anos depois, MEINHARD e 
HALL introduziram a utilização do amido, como ligante do adsorvente (alumina) 
distribuído sobre as placas de vidro. Mas, foi STAHL, a partir de 1958, que 
padronizando o método da cromatografia em camada fina, mostrou sua utilidade geral e 
fez com que ela adquirisse considerável importância na maioria dos laboratórios. 
 A cromatografia em fase gasosa, utilizada na prática por JAMES e MARTIN em 
1952, é uma aplicação da cromatografia de adsorção e da cromatografia de partição. É 
destinada a separar compostos gasosos. Esta técnica foi idealizada desde o início por 
MARTIN e SYNGE. 
 Um dos últimos princípios utilizados foi o da cromatografia por troca iônica. Um 
trocador de íons é um composto que porta íons relativamente móveis, que podem, em 
presença de uma solução, serem trocados pelos íons livres da solução. Em 1856, 
THOMPSON colocou este fenômeno em evidência. Depois, em 1907, GANS preparou 
trocadores de íons artificiais. 
 Em 1976, foi introduzido o conceito de cromatografia a média pressão para a 
separação de diastereoisômeros de oxazolidinas. 
 
PRINCÍPIOS 
 
 
 Sistema cromatográfico é o conjunto formado pela mistura a ser analisada, pela 
fase fixa e pela fase móvel. A fase fixa, também chamada fase estacionária, é o meio 
constituído ou suportado por um sólido poroso, cuja função é reter os solutos. A fase 
móvel é o solvente, neste caso chamado de eluente, que flui através da fase fixa, e tem 
como função deslocar os solutos. Neste sistema, a mistura de solutos é levada a migrar 
através da fase fixa, por meio de fluxo constante da fase móvel, sendo a diferença de 
velocidade de migração (migração diferencial) provocada por processo de competição 
pelo soluto, entre as duas fases. 
 
 
Tipo de 
cromatografia 
Natureza da fase 
estacionária 
Natureza dos compostos a separar 
Adsorção Sílica gel A maior parte dos compostos orgânicos 
simples; os isômeros geométricos. As 
moléculas contendo vários grupos polares, as 
substâncias com carater eletrofílico, as 
substâncias com alto peso molecular. 
Os pesticidas. 
 Óxido de alumínio As vitaminas solúveis, os alcalóides, os 
corantes alimentares, os plastificantes, etc. 
As substâncias com caráter nucleófilo. 
Partição Líquido imiscível com a 
fase móvel (normalmente 
de alta polaridade)a 
Açucares e compostos anfotéros 
(aminoácidos) 
Troca de íons Resinas trocadoras de 
íons: 
Ex.: Amberlite, Dowex 
Compostos cuja carga elétrica depende do 
pH (nucleotídeos, ácidos carboxílicos, etc) 
Exclusão Gel com propriedades 
elásticas, que permitem a 
passagem de substâncias 
até um determinado 
tamanho molecular 
Grupos de substâncias com similaridade 
físico-química e pequenas diferenças no 
tamanho molecular. 
Bioafinidade Matriz de ancoragem, 
ligada a um suporte 
neutro 
Técnica exclusiva de purificação de 
substâncias que contém especificidade 
molecular, a exemplo de antígenos, 
hormônios, vacinas, enzimas, etc. 
 
 
CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO 
 
 
Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido 
(adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações 
semelhantes às “forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação 
 
k
N
N
a
a
n
= 
 
onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de 
uma determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, 
estes variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de 
vários componentes é forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente 
(coluna cromatográfica), cada componente necessitará de um intervalo de tempo 
diferente para transpor a coluna. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de 
retenção (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsorção. A 
substância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente arrastada pela Fase Móvel. 
 
 
 
 
Figura 1: Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição 
CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO 
 
 
Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não 
miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a 
relação C1 / C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois 
líquidos. Denomina-se coeficiente de partição à relação 
 
k
C
C
p =
1
2
 
 
 
A separação de substâncias contidas em uma amostra através do método da 
Cromatografia por partição se dá através dos coeficientes de partição de cada 
substância. 
 
Coeficiente de partição : é a razão das concentrações de um soluto em presença de dois 
solventes não miscíveis, em equilíbrio. O conhecimento do coeficiente de partição nos 
permite estudar o fenômeno que ocorre na cromatografia de coluna. 
 
 
SUPORTES PARA CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO:Terras de diatomácea - A fase estacionária é também constituída por gotículas 
microscópicas, retidas nas carapaças da diatomita. O fenômeno de adsorção neste caso é 
bastante reduzido e trata-se de uma partição líquido-líquido típica. 
 
Amido de batata - O amido pode reter até 35% de água e constitui um bom suporte 
para uma fase estacionária. Entretanto, não possui uma grande capacidade de separação, 
mas o emprego de colunas grandes, permite a preparação de quantidades relativamente 
grandes. Os fenômenos de adsorção são de certa forma, intensos, quando as colunas são 
utilizadas para separar diferentes substâncias (por exemplo, misturas simples de 
aminoácidos), observa-se que a adsorção é praticamente o único fenômeno envolvido. 
Celulose - Nas colunas por partição a celulose é bastante utilizada, sobretudo sob a 
forma de pós. A celulose é um suporte hidrofílico, porém , existe a possibilidade de 
preparação de celuloses hidrofóbicas para a cromatografia de fase inversa. 
 
 
 
CROMATOGRAFIA SOBRE PAPEL 
 
A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer 
menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições 
para sua utilização em termos analíticos. 
 Este é um método de extensão da cromatografia de partição sobre colunas de 
celulose, idealizado por CONSDEN, GORDON e MARTIN. Podemos considerar que o 
papel constitui um suporte inerte, que retém uma fase estacionária aquosa. A partição é 
efetuada entre a fase aquosa fixa e a fase orgânica móvel 
 A aparição de novas técnicas utilizando papéis como trocadores de íons, 
de celuloses hidrofóbicas, de celuloses adsorventes, transformou este método em uma 
técnica universal de micro-análise. 
 Na cromatografia de papel, empregam-se quantidades de amostra na 
ordem de microgramas ou miligramas. A resolução depende da concentração e do 
diâmetro da mancha aplicada. As substâncias hidrofílicas são separadas com facilidade, 
enquanto as hidrofóbicas requerem tratamento especial do papel. As fases móveis 
devem estar saturadas com água. Utilizam-se cubas vedadas e de preferência com 
saturação do solvente antes do início da separação cromatográfica. O desenvolvimento 
pode ser ascendente, descendente, circular ou horizontal. 
 
Fase móvel - A fase móvel em cromatografia sobre papel é variável e possui maior 
efeito nas separações dos componentes de uma mistura. Considerando um par de 
líquidos, o menos polar funciona como fase móvel e o mais polar, como fase 
estacionária. 
 
 
CROMATOGRAFIA CIRCULAR 
 
 O papel é recortado em forma de um círculo. No centro deste é feito um pequeno 
orifício. As substâncias são colocadas sobre uma circunferência em torno do centro. O 
círculo de papel é então colocado em uma cuba circular, o solvente é derramado a partir 
da parte inferior da cuba e conduzido por capilaridade até a porção central do papel. As 
substâncias se apresentam ao final da migração como arcos em torno do centro. 
 
OS PAPÉIS PARA CROMATOGRAFIA. 
 
Papéis simples - Os primeiros ensaios foram conduzidos sobre papéis de filtro comuns. 
Porém a sua qualidade era inadequada, levando à necessidade de preparação de papéis 
especiais, que conduzissem a resultados reproduzíveis, sendo necessário uma certa 
regularização na sua fabricação e os papéis deviam apresentar um certo grau de pureza. 
Atualmente, os diferentes papéis se destacam pela sua eficiência, sua durabilidade e 
pelo seu grau de pureza. 
 
Papéis especiais - São papéis com propriedades adsorventes. Eles foram criados para 
adaptar as vantagens da cromatografia de papel à cromatografia de adsorção. Para tal, 
fixa-se sobre o papel (entre as fibras de celulose) uma substância dotada de 
propriedades adsorventes, principalmente a alumina e a sílica. 
 
 
REVELAÇÃO 
 Quando está terminada a migração do solvente, é conveniente que o 
cromatograma seja submetido a um tratamento, de forma a colocar em evidência as 
substâncias separadas. A revelação não apenas torna visíveis as substâncias incolores, 
mas também facilita a identificação destas substâncias. Isto é possível pela pulverização 
de reativos específicos ou de procedimentos físicos convenientes. 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA OU CROMATOGRAFIA EM 
CAMADA DELGADA (CCD) 
 
 Podemos subdividir a CCD em três gupos: 
 
 a)Análise qualitativa, que permite determinar o número dos constituintes de 
uma mistura desconhecida e qual a fase móvel e estacionária, ideais para a separação 
cromatográfica. 
 b) Análise preparativa, que permite, após separação de pequenas quantidades 
de substâncias para estudos químicos ou físico-químicos, purificação de pequenas 
quantidades dos constituintes. 
 c) Análise quantitativa, que consiste em determinar as proporções exatas de 
cada um dos constituintes da mistura. 
 
 
TÉCNICA: 
 
Um adsorvente, selecionado de acordo com as características da amostra, é 
disposto sob a forma de uma camada fina sobre uma placa de vidro. Após ativação pelo 
calor, seguida do depósito das substâncias a analisar. A placa é colocada em uma cuba 
fechada contendo o solvente. Terminada a migração, os resultados serão observados 
utilizando diferentes métodos de revelação. A Figura 2. ilustra o processo. 
O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes 
de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando o solvente 
se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que contém o 
solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível 
abaixo do ponto de aplicação. As razões de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 são 
características de cada substância, dependendo da natureza da fase móvel e da fase 
estacionária. A Cromatografia em Camada Delgada é a mais empregada em Análise 
qualitativa ou semi-quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra 
utilizada, é menos indicada para fins preparativos. quando é necessário se obter uma 
quantidade maior das substâncias puras, emprega-se a cromatografia em coluna. 
 
 
 
 
Fig. 2 - Cromatografia em 
Camada Delgada. 
 
 Neste exemplo, a amostra contém dois 
componentes, A e B, que são identificados 
pelos respectivos valores de Rf 
 
CÁLCULO DO Rf: 
 
 Se a amostra é uma mistura, cada constituinte possuindo um coeficiente de 
adsorção próprio e uma afinidade própria, quando arrastado pelo solvente, progride com 
uma velocidade que lhe é característica, sendo simbolizada por seu Rf. Este é expresso 
pela relação : 
 
distância percorrida por uma molécula 
 Rf = ---------------------------------------------------- 
distância percorrida pelo front do solvente 
 
 Substituímos também esta expressão, pela expressão mais reprodutível : 
 
distância percorrida por uma molécula de referência 
 Rf = --------------------------------------------------------------- 
distância percorrida por uma molécula X 
 
 
VANTAGENS DESVANTAGEM 
- Optimização fácil e rápida - Difícil reprodutibilidade do Rf 
- Duração curta de desenvolvimento da placa 
- O adsorvente pode suportar a ação enérgica 
do revelador 
 
- Separações mais claras 
- Utilização de quantidades muito pequenas 
- Vasto domínio de aplicação 
 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA CENTRÍFUGA 
 
 A técnica de cromatografia em camada fina centrífuga foi desenvolvida para 
resolver alguns problemas da cromatografia preparativa em camada fina, nas quais o 
tempo de migração e a remoção das bandas das substâncias não é fácil ou eficiente. Esta 
técnica baseia-se na ação da força centrífuga para acelerar o fluxoda fase móvel através 
de uma placa circular. 
Caronna (1955) introduziu a cromatografia centrífuga, que é um método em 
que um rotor formado por duas placas circulares sustentavam uma folha de papel 
cromatográfico, também circular. 
Após varias tentativas de optimização do método, Heftmann et al. (1972) 
conseguiram separações mais eficientes. Eles utilizaram uma mistura de purinas, 
cafeína, teobromina, teofilina e xantina que puderam ser rapidamente em sílica gel, em 
quantidades de 5 mg. 
Mesmo com o desenvolvimento de outros protótipos de cromatografia 
centrífuga (Hostettmann, 1988), esta técnica não alcançou grande sucesso, até o 
lançamento de aparelhos chamados cromatotrons. 
O cromatotron (figura 5) possui um rotor inclinado, ao contrário, ao contrário 
dos seus antecessores que possuíam um rotor plano. O coração do aparelho é uma placa 
de cristal circular de 24cm de diâmetro, que é coberta com o adsorvente adequado, a fim 
de proporcionar uma camada delgada para as separações preparativas. 
A placa preparativa é colocada no centro de um motor elétrico e colocada para 
girar a 800 rpm. O eluente é introduzido no centro da placa (que não contém 
adsorvente), por uma bomba a pistão capaz de proporcionar um fluxo de 1 – 10 
mL/min, que vai atravessar a camada delgada por força centrífuga. A amostra é então 
inserida e adiciona-se o eluente, mantendo-se um fluxo isocrático ou introduzindo um 
gradiente de concentração até a purificação dos constituintes da amostra, a um fluxo de 
3 – 6 mL/min. Observa-se a formação de bandas concêntricas e as substâncias são então 
separadas e coletadas na periferia, através de um tubo de saída. As frações obtidas 
podem ser analisadas através de CCD. 
 
 
OS REVELADORES 
 
 São substâncias capazes de complexar alguns compostos incolores em placas 
cromatográficas. Esta complexação pode ocorrer de forma inespecífica ou específica. É 
importante que as placas sejam borrifadas uniformemente para que haja uma perfeita 
visualização dos compostos a serem revelados. 
 A visualização pode ser efetuada inclusive através de métodos físicos, o que 
permite a revelação de alguns compostos sem alterar a sua estrutura química. É o caso 
da exposição das placas à luz ultravioleta ou a vapores de iodo. 
 Muitos são os agentes cromogênicos empregados tanto na cromatografia 
de papel como na cromatografia em camada fina, sendo que em geral são bem mais 
sensíveis na segunda. Uma das vantagens da CCD sobre o papel é permitir a utilização 
de reveladores enérgicos ou que necessitem aquecimento posterior à borrifação. Em 
geral os métodos químicos de revelação são destrutivos e utilizados apenas em 
separações analíticas. A seguir apresentamos um quadro com alguns exemplos de 
reveladores utilizados na cromatografia em camada fina analítica. 
Exemplos de Reveladores Químicos: 
 
Classes de compostos Reveladores 
Aminoácidos Ninhidrina 
Fenóis em geral FeCl3 
Taninos FeCl3 
Alcalóides Reativo de Dragendorff 
 Reativo de Mayer 
 Reativo de Hagen 
Esteróides H2SO4 
Triterpenóides H2SO4 
Flavonóides Reativo de Neu 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA 
 
 
A cromatografia em coluna aberta convencional, é universalmente etuilizada 
pela sua simplicidade de operação. 
Neste tipo de processo, a fase estacionária é colocada em um tubo de vidro 
(coluna cromatográfica) colocado na posição vertical. A coluna é dotada de uma 
torneira na extremidade inferior (Fig. 3), que é utilizada para controlar a vazão da fase 
móvel, que desce por gravidade. 
 
 
Figura 3- Cromatografia em coluna 
 
O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A indica o nível 
da fase móvel. A diferença A’ - A deve ser o menor possível, para evitar a diluição 
do material a ser cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.3, as faixas 
1, 2 e 3) mais largas. 
 
 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA SOB PRESSÃO (FLASH) 
 
 
A expressão cromatografia líquida sob pressão refere-se a qualquer tipo 
método que envolva aplicação de pressão em uma coluna cromatográfica, como forma 
de se distinguir das separações cromatográficas por gravidade. Como resultado, podem-
se incluir todas as categorias desde cromatografia líquida “flash” (2 bar) até a CLAE 
preparativa (100 bar), e as quantidades de amostras de µg até Kg. 
A diferença entre a cromatografia preparativa e a analítica é que, enquanto a 
última (empregada para separação, identificação e determinação) não se preocupa com a 
recuperação da amostra, a cromatografia preparativa é uma processo de purificação e 
permite o isolamento de substâncias puras contidas em uma mistura. 
O termo preparativa refere-se a qualquer tipo de separação que não seja para 
fins analíticos. A quantidade de material puro requerido depende da finalidade para o 
qual será empregado: 
• Quantidades entre µg a mg para identificação espectroscópica, como o 
isolamento de produtos naturais; 
• Quantidades em mg para identificação posterior, reações químicas e 
ensaios biológicos; 
• Quantidades em g para ensaios biológicos posteriores, trabalhos de síntese 
e semi-síntese e isolamento de produtos de referência. 
 
A figura 4 representa os limites de aplicação aproximados dos diferentes 
métodos. 
 
 
CLAE analítica 
CLAE preparativa 
CL baixa pressão 
CL “flash” 
 CL média pressão 
 
+ + + + 
µg 1 mg 10 mg 100mg 1 g 
Quantidades de material a separar 
 
Figura 4 – Divisão aproximada dos métodos de cromatografia líquida sob 
pressão, de acordo com a escala preparativa requerida. 
 
 
 
OUTROS EXEMPLOS DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: 
 
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO 
 
 A cromatografia por exclusão, também conhecida como filtração gel, permeação 
em gel e peneira molecular, é um método que promove uma seletiva e dinâmica 
distribuição das moléculas do soluto entre duas fases líquidas separadas, e dependentes 
de uma estrutura estacionária, contendo poros de tamanho controlado. 
Fase estacionária 
 
 O termo gel, refere-se a um material elástico que contém água. Este possui uma 
estrutura tridimensional, cuja estabilidade mecânica é dada pelo material contendo 
espaços (poros) que contém líquido. Partículas pequenas dão melhor resolução e 
eficiência. O aumento do tamanho das partículas resulta em espalhamento da zona nos 
interior dos poros. O gel quimicamente definido, deve permitir variações para o 
fracionamento em diferentes intervalos de massa molecular. 
 
TIPOS DE GÉIS 
 
Géis de dextrano (SEPHADEX) - É um tipo de polissacarídeo com unidades de 
glicose, obtido por fermentação de sacarose. Os diferentes tipos são caracterizados por 
ligações cruzadas entre as cadeias polissacarídicas que quando entram em contato com a 
água, incham e produzem um gel com estrutura tridimensional.. 
 
Géis de poliacrilamida (BIO-GEL) - O polímero de poliacrilamida é constituído a 
partir de ligações cruzadas entre as cadeias de moléculas de acrilamida (H2C=CH-CO-
NH2). As matrizes do bio-gel se assemelham àquelas do sephadex, como os intervalos 
de fracionamento e as propriedades de resistência à pressão, para os géis que 
apresentam o mesmo grau de absorção de água. 
 
Géis de ágar e agarose - As propriedades cromatográficas do ágar fazem com que estes 
géis sejam compmplementares aos géis de sephadex e poliacrilamida. O ágar é obtido 
de algas e se constitui de polissacarídeos lineares de lactose e dioxi-L-galactose. 
Considera-se que o tamanho dos poros e a estabilidadedos géis de ágar sejam 
conseqüência da formação de microcristais. 
 
 
Tamanho da amostra 
 Para uma boa resolução, a zona em que está a amostra deve ser pequena em 
relação ao comprimento da coluna (1 a 5% do tamanho da coluna) e possuir uma baixa 
viscosidade, para não ocasionar uma vazão irregular entre as zonas do gel. 
 
 
FASE MÓVEL 
 O sucesso do processo cromatográfico, depende, entre outras coisas, do 
comportamento dos solutos e das características destes e da fase móvel dentro da 
coluna. Durante uma separação cromatográfica, a concentração das substâncias 
separadas, pode ser determinada no líquido por diferentes métodos. Pela retenção do 
soluto na fase estacionária, cada zona se movimenta com uma velocidadde característica 
. O eluente deve apresentar uma relação de viscosidades em relação ao soluto de até 
duas vezes. As soluções tampão são normalmente os eluentes de escolha pra 
cromatografia por exclusão. 
 
 
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA DE FILTRAÇÃO GEL 
Este método permite estudar particularmente, os pesos moleculares de 
proteínas, em condições variadas de pH, temperatura e força iônica. 
Outros usos compreendem a determinação da massa molecular de polímeros 
naturais e sintéticos, possibilidade esta que atualmente é primordial para o controle de 
qualidade destes compostos. 
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA 
 
 
A cromatografia de troca iônica, que geralmente é chamada de cromatografia 
iônica, refere-se a métodos modernos e eficientes de separação e determinação de íons 
com base em resinas trocadoras de íons. A cromatografia iônica foi desenvolvida em 
meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de cátion e ânion podem ser 
facilmente resolvidas em colunas cromatográficas. 
 
A cromatografia iônica foi conseqüência de troca iônica, desenvolvida durante 
o projeto Manhattan para a separação de cátions de terras raras de propriedades 
semelhantes entre si, com resinas trocadoras de cátions. Esse trabalho monumental, que 
forneceu a base teórica das separações de troca iônica, após a Segunda guerra Mundial, 
foi estendido para muitos outros tipos de materiais. Em ultima analise, levou aos 
métodos automáticos para separação e detecção de aminoácidos e outras espécies 
iônicas em misturas complexas. 
 
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA: 
 
• Purificação de proteínas 
• Purificação de antibióticos (caldos . de fermentação) 
• CROMATOGRAFIA POR BIOAFINIDADE 
 
 
 
 É um tipo de cromatografia que baseia-se nas propriedades biológicas das 
macromoléculas biológicas e permite o isolamento seletivo destas, através da utilização 
das propriedades dessas substâncias de unirem-se reversivelmente a ligantes específicos 
que se encontram imobilizados covalentemente à matriz ou suporte. A eluição das 
moléculas ligadas pode ser feita por al;teração do pH e/ou força iônica do meio, que 
tornam o complexo molécula-ligante menos estável, levando à dissociação do mesmo, o 
que conduz à sua purificação. O método da cromatografia de bioafinidade assemelha-se 
ao tipo de ligações que ocorrem entre os antígenos e os anticorpos. 
 
Fase Estacionária- É de extrema importância a escolha das matrizes de ancoragem, 
utilizadas na cromatografia de bioafinidade. Estas matrizes devem apresentar 
estabilidades mecânica e química nas condições de acoplamento. Devem ser uniformes, 
esféricas, rígidas e porosas, e que permitam boas condições de vazão, mesmo após o 
acoplamento. As substâncias comumente usadas como matrizes são a agarose, o 
dextrano, a poliacrilamida e outros polímeros, partículas porosas de alumina, vidro de 
porosidade controlada e algumas associações destes. 
Acoplamento do ligante à matriz - O acoplamento de ligantes específicos pode ser 
realizado diretamente na matriz ativada ou em grupos funcionais disponíveis. A 
eficiência do processo de acoplamento, geralmente aumenta com a concentração do 
ligante. Estas reações ocorrem normalmente em meio levemente alcalino (pH 8 - 9), 
utilizando-se tampões borato ou bicarbonato. 
 
 
MÉTODOS DE ELUICÃO 
 A eluição do material ligado à fese estacionária é realizada tanto com agentes 
específicos como com agentes não específicos. 
 A utilização de agentes de eluição específicos é baseada na ligação preferencial 
dessa substância com o agente específico ao invés da fase estacionária. Geralmente os 
agentes de eluição específicos possuem estrutura química semelhante ao ligante da fase 
estacionária. 
 Na utilização de agentes de eluição não específicos há a formação de 
complexos entre a substância alvo com o ligante específico, o que envolve ligações 
fracas como interações eletrostáticas e hidrofóbicas, ou pontes de hidrogênio isoladas ou 
em conjunto, onde a variação do pH e/ou força iônica do tampão são os recursos 
utilizados para provocar alterações no complexo formado ou modificam e estrutura 
química deste. 
 
APLICAÇÕES 
 A cromatografia de bioafinidade é aplicada para a purificação de enzimas como 
a catalase e a celulase, antibióticos, antíigenos, ácidos nucléicos, drogas ou receptores 
hormonais, e pequenas moléculas como peptídeos sintéticos e naturais.