técnicas de pcr

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Centro Universitário de Belo Horizonte - UNI-BH
Biologia Molecular 
 
Acadêmicas: Alessandra Siqueira, Aline Cordeiro, Bruna Almeida, Criskelem Reis, Fernanda Debortoli, Ludmila 
Almeida, Lyvia Dias, Mariana Lis, Natana Soares, Thais Vianney
Docente: Cláudia Lopes Penaforte
 Técnicas de PCR:
Real time, Multiplex e Nested
A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
● Técnica descrita por Kary Mullis em 1983;
● Técnica “in vitro” que permite a amplificação de sequências de DNA e RNA. 
● Elementos da técnica: primase, helicase, Taq DNA polimerase, íons,, 
nucleotídeos, primer. Colocar em tópicos 
● Etapas da técnica:
Desnaturação (94°-95°) Anelamento (55°-65°) Extensão(72°);
(ICB.UFMG); (VIEIRA, 2011)
Fonte: http://www.
soquimica.pt/pt/Produto/46
PCR Nested
● Objetivo: solucionar o problema da especificidade da técnica simples que, pela 
grande capacidade de amplificação, aumenta a possibilidade de que o DNA 
amplificado não seja o desejado.
● Para contornar esses problemas, primers internos (nested) são desenhados e 
empregados para testar a especificidade ao segmento de PCR que foi amplificado. 
(OLIVEIRA, 2015)
PCR Nested - Etapas (Rounds)
● Dois pares de primers amplificam uma região conhecida do genoma de um organismo 
qualquer.
1. O primeiro par de primers amplifica determinada região com número conhecido de 
pares de bases.
2. O segundo par nested primers se liga a região dentro do primeiro produto produzindo 
um segundo produto de PCR que será menor do que o primeiro à amplificação da 
real sequência-alvo.
(OLIVEIRA, 2015)
● Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas separadamente (Nested) ou em duas 
reações concomitantes (Semi-Nested PCR).
(VIEIRA, 2011)
PCR Nested - Etapas (Rounds)
Fig. 2: Esquema de uma reação de Nested PCR.
Fonte: VIEIRA, 2015
PCR Nested 
● Aplicação: 
PCR Nested 
● Vantagens
○ Ganho em especificidade e eficiência à DNA-molde do 2º round está em concentrações 
altíssimas, e os primers da segunda etapa têm menos chances de anelamento em seqüências 
inespecíficas, dada a redução do tamanho do molde;
○ Aumentar a sensibilidade das reações em cadeia; 
○ Diagnóstico de microrganismos em amostras de DNA extraídas de espécimes clínicos 
diversos.
● DESVANTAGENS: ??????
(VIEIRA, 2011)
PCR Multiplex 
● Técnica descrita por Jeffrei S. Chamberlain e Joel 
R. Chamberlain, em 1988;
● Baseada na amplificação de mais de um segmento 
de DNA. Sendo que cada fragmento do DNA, 
possui um par de Primers; 
IMAGEM 2: PCR MULTIPLEX
Fonte: http://www.premierbiosoft.com/images/multiplex_pcr_mechanism.jpg
(VIEIRA, 2011)
PCR Multiplex 
Aplicações:
● Reconhecer e discriminar simultaneamente 
infeções mistas
● Caracterizar simultaneamente mais que um 
fator de resistência a fármacos.
● Teste de paternidade. 
(MORENO, 2013)
IMAGEM 3: Eletroforese em Gel de Agarose de PCR Multiplex
Fonte: http://www.prograd.uff.br/
http://scielo.iec.pa.gov.br/
PCR Multiplex 
● Vantagens: 
○ Detecção e análise de múltiplos genes de uma amostra ao mesmo 
tempo. 
○ Mais econômico e mais rápido. 
○ Uso de um controle interno nos ensaios diagnósticos, não sendo 
necessário controle externo. 
● Desvantagens: 
○ Excesso de Primers Complementariedade entre os Primers 
(dímeros). 
(MORENO, 2013) IMAGEM 3: Dímeros de Primers
Fonte: http://www.i2bio.org/wp-content/uploads/PCR-1-Oct2012.pdf
PCR Real Time
● A amplificação do DNA e a detecção ocorrem simultaneamente;
● A reação de amplificação é detectada por um sistema fluorescente;
● O sistema é baseado no uso de uma sonda que possui dois fluorocromos 
○ Fluorocromo R: presente na extremidade 5’ e emite luz 
○ Fluorocromo Q: presente na extremidade 3’ e funciona como capturador 
de energia (quencher)
● A energia para a excitação dos fluorocromos provém de um feixe de laser 
que atravessa a amostra -> Taqman
(PEREIRA MACHADO, 
2009)
PCR Real Time
● Exemplo: leucemia mieloide crônica 
○ Elevada expressão da proteína 
de fusão BCR-ABL;
○ Confirmação do diagnóstico é 
através da marcação dessa 
proteína e posterior 
fluorescência após a 
amplificação.
Imagem:(Salles Cesar de 
Oliveira, 2010)
PCR Real Time
Aplicações:
● Todas as aplicações da PCR tradicional
● Identificação, quantificações e caracterização genética de vírus (HIV, vírus da Hepatite B e C e Citomegalovírus), bactérias 
(Escherichia coli e Staphylococcus aureus), micobactérias (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium e 
Mycobacterium intracelullare) e fungos (Pneumocistis carinii);
● Determinação quantitativa de transcritos da translocações BCR-ABL, característicos da leucemia mielóide crônica;
● Determinação de pontos de mutações genéticas 
● Testes de eficiência terapêutica
● Análise de patógenos em alimentos e de produtos transgênicos 
Fig.? fonte: http://www.excelscientific.com/thermalseal_content.html
PCR Real Time
Vantagens PCR Real Time
Coleta de dados na fase exponencial
SEM manipulação pós-PCR
Resultados quantitativos
Tempo de reação reduzido
Maior reprodutibilidade, sensibilidade e 
precisão
PCR tradicional
Coleta de dados na fase final da reação (plateau)
Manipulação pós-PCR
Resultados qualitativos
Preparação de gel de agarose - visualização
Muito tempo para obter resultados
x
Conclusão
O desenvolvimento da técnica de amplificação de fragmentos de DNA pela PCR permitiu 
avanços na análise de genes, diagnóstico de doenças genéticas, detecção de agentes 
infecciosos entre outros.
PCR Real time possibilita quantificação e rapidez do resultado sendo de grande relevância 
para diagnosticar patógenos e doenças genéticas.
PCR Multiplex permite que diminua a intensidade e período de trabalho laboratorial, 
número de reagentes e custos, mas reduz a sensibilidade de detecção.
PCR Nested proporciona ganho de especificidade e eficiência. Poucos estudos utilizam 
essa técnica.
Referências
ZAHA, A.et al. Biologia Molecular Básica. 5ª. ed. Porto Alegre, Editora Mercado Aberto, 2014.
Depto.icb.ufmg. PCR. Disponível em: <http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/pcr2.htm>. Acesso em: 22 nov. 2015.
VIEIRA, Daniel Perez .Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações BSc. Disponivel em: <http://www.fea.
br/Arquivos/Biotecnologia/Material%20Prof%C2%AA%20Cristina%20-%20Biologia%20Celular/Principios_da_PCR.pdf> Acesso 
em: 22 nov. 2015.
MORENO. Ana Cláudia Almeida. Diagnóstico Molecular na era da sequenciação de 3ª geração e da PCR digital. Universidade 
Fernando Pessoa Porto. 2013. Disponível em: <http://bdigital.ufp.pt/bitstream/10284/3969/1/Tese%20Ana%20Moreno%20FINAL.
pdf>. Acesso em: 22 nov. 2015.
OLIVEIRA, M. et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de 
reação em cadeia da polimerase. Disponível em: <http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.
pdf>. Acesso em: 19 nov. 2015.