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G 209 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 6 Meu querido amigo..... a vida é infinitamen- te mais complexa do que qualquer coisa que a mente humana possa imaginar. Não ou- saríamos sequer conceber as coisas que são meros detalhes da existência. A. CONAN DOYLE (1891) Não é o nascimento, o casamento ou a mor- te, mas é a gastrulação que é verdadeira- mente a parte mais importante de nossa vida. LEWIS WOLPERT (1986) ASTRULAÇÃO é o processo pelo qual movimentos altamente integrados de células e tecidos, dramaticamente, reorganizam as células da blástula. A blástula consiste de numerosas células, cujas posições foram estabelecidas durante a clivagem. Durante a gastrulação, essas células recebem novas posições e novos vizinhos, e é estabelecido o multifacetado plano do corpo do organismo. As células que formarão os órgãos endodérmicos e mesodérmicos são trazidas para den- tro do embrião, ao passo que as precursoras da pele e do sistema nervoso são distri- buídas na superfície externa. Assim, as três camadas germinativas – ectoderma exter- no, endoderma interno e mesoderma intersticial – são produzidas inicialmente durante a gastrulação. Ainda, o palco está montado para as interações desses tecidos recém- posicionados. Os movimentos da gastrulação envolvem o embrião inteiro, e migrações celula- res em uma parte do organismo gastrulante devem estar intimamente coordenadas com outros movimentos ocorrendo simultaneamente. Mesmo que o padrão de gastrulação seja extremamente variado em todo o reino animal, relativamente pou- cos mecanismos estão envolvidos. A gastrulação, geralmente, envolve os seguintes tipos de movimentos: • Epibolia. O movimento de camadas epiteliais (usualmente de células ectodér- micas) que se espalham como uma unidade e não individualmente, para envol- ver as camadas mais profundas do embrião. • Invaginação. O dobrar para dentro de uma região de células, de maneira seme- lhante à cavidade formada quando se empurra com o dedo a superfície de uma bola de borracha macia. • Involução. A internação ou movimento de interiorizarão de uma camada exter- na em expansão, de modo a se espalhar na superfície interna das células exter- nas remanescentes. • Ingresso de células. A migração de células individuais da camada superficial para o interior do embrião. • Delaminação. A separação de uma camada celular em duas ou mais camadas mais ou menos paralelas. Ao considerarmos gastrulação em diferentes tipos de embrião, devemos levar em conta as seguintes questões (Trinkaus, 1984a): • Qual é a unidade da atividade migratória? É a migração dependente do movimento de células individuais, ou são as células parte de uma camada migrante? Por mais extraordinário que possa parecer, propriedades migratórias regionais podem ser totalmente controladas por fatores citoplasmáticos que 210 PARTE II Padrões de Desenvolvimento são independentes da celularização. F. R. Lillie (1902) conseguiu ativar, parte- nogeneticamente, óvulos do anelídeo Chaetopterus e suprimir sua clivagem. Muitos eventos do desenvolvimento precoce ocorreram mesmo na ausência de células. O citoplasma do zigoto se separou em regiões definidas, e os cílios se diferenciaram nas partes apropriadas do ovo. Ainda mais, o citoplasma claro externo migrou para baixo em direção à região vegetativa, de uma maneira muito parecida à epibolia das células do hemisfério animal durante o desenvol- vimento normal. Isso ocorreu precisamente no momento em que ocorreria a epibolia durante a gastrulação. Assim, a epibolia pode ser (pelo menos em alguns aspectos) independente das células que formam a região migratória. • A expansão ou dobramento de uma camada celular deve-se a fatores intrín- secos próprios, ou às forças extrínsecas que a estendem ou a distorcem? É essencial conhecer a resposta a essa pergunta se queremos entender como os vários movimentos celulares da gastrulação são integrados. Por exemplo, es- tão as células involutivas puxando as células epibolizantes para baixo em sua direção, ou são os dois movimentos independentes? • Existe uma expansão ativa do tecido total, ou é a margem limitante que se expande e arrasta o resto da camada celular, passivamente? • São as mudanças na forma e na motilidade celular, durante a gastrulação, conseqüências de mudanças nas propriedades da superfície celular, tais como adesividade ao substrato ou a outras células? Considerando essas questões, observaremos os vários padrões de gastrulação en- contrados em equinodermos, anfíbios, peixes, aves e mamíferos*. Gastrulação em ouriço-do-mar A blástula do ouriço-do-mar consiste de uma única camada de mais ou menos 1000 células. Essas células derivadas de diferentes regiões do zigoto têm tamanhos e pro- priedades diferentes. As Figuras 6.1 e 6.2 mostram o destino das várias regiões do zigoto enquanto ele se desenvolve através da clivagem e da gastrulação na larva pluteus, característica dos ouriços-do-mar. O destino de cada camada pode ser visto através de seus movimentos durante a gastrulação. Ingresso do Mesênquima PrimárioIngresso do Mesênquima PrimárioIngresso do Mesênquima PrimárioIngresso do Mesênquima PrimárioIngresso do Mesênquima Primário FUNÇÃO DAS CÉLULAS PRIMÁRIAS DO MESÊNQUIMA. Logo após a eclosão da blástula da membrana de fecundação, o seu hemisfério vegetal começa a se espes- sar e achatar (Figura 6.2, 9 horas). No centro dessa placa vegetativa achatada, um aglomerado de pequenas células começa a se modificar. Essas células apresentam movimentos de vibração em suas superfícies internas, estendendo e contraindo lon- gos e finos processos (30x5 µm) chamados filopódios. As células então se dissociam da monocamada epitelial e ingressam na blastocele (Figura 6.2, 9-10 horas). Essas células são chamadas de mesênquima primário e são derivadas dos micrômeros. As 64 ou mais células mesenquimatosas primárias do ouriço-do-mar são as descendentes dos quatro blastômeros que se formaram pela quarta clivagem assimétrica. Gustafson e Wolpert (1961) usaram filmes com exposição contínua para seguir os movimentos microscópicos das células mesenquimatosas dentro da blastocele. No *A discussão da gastrulação de Drosophila será transferida para o Capítulo 14, quando ela ocorre no contexto da formação do eixo. Lembre-se do alerta feito pelo pesquisador de gastrulação, Ray Keller (comunicação pessoal) “Estudantes NÃO deveriam ler esse material apressadamente, ao contrário uma cena típica é aquela em que um pobre coitado está debruçado sobre este texto às 2.30 horas da madrugada com uma xícara de café, examinando desesperadamente as figuras para ver se ele ou ela podem entender o que está se passando”. Gastrulação é (como diz Wolpert na citação no começo deste capítulo) a época mais importante da sua vida. Vale a pena examiná-la criticamente e apreciá-la vagarosamente. CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 211 Animal (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) Mesômeros Macrômeros Micrômetros (H) (I) (J) (K) (L) Vegetal Tufo ciliar Mesênquima secundário Mesênquima primário Estomodeu (boca) (Vista lateral) Endoderma invaginante (M) Envoltório ectodérmico Bastonetes esqueléticos (mesoderma) Intestino (endoderma) (Vista ventral) Boca Bastonetes esqueléticos Ânus (N) 9 hs. 9.5 hs. 10 hs. 10.5 hs. veg 1 veg 2 Figura 6.1Figura 6.1Figura 6.1Figura 6.1Figura 6.1 Desenvolvimento normal do ouriço-do-mar, seguindo o destino das camadas celulares da blás- tula. (A-F) Clivagem até o estágio de 60 células (omitindo o estágio de 2-células). (G) Blástula precoce com cílios. (H) Blástula tardia com tufo ciliar e placa vegetal achatada. (I) Blástula com mesênquima primário. (J) Gástrula com mesênquima secundário. (K) Larva em estágio prismático. (L,M) Larva pluteus. Os destinos do citoplasma zigótico podem ser seguidos pelasvariações no sombreamento. (N) Fotomicrografia de uma larva pluteus viva de ouriço-do-mar. (A-M segundo Hörstadius, 1939; N cortesia de G. Watchmaker.) Figura 6.2Figura 6.2Figura 6.2Figura 6.2Figura 6.2 Seqüência completa da gastrulação em Lytechinus variegatus. O tempo mostra a duração do desenvolvimento a 25oC. (Cortesia de J. Morrill.) 11 hs. 11.5 hs. 12 hs. 13 hs. 13.5 hs. 15 hs. 17 hs. 18 hs. 212 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) Agregados Ventrolaterais Cadeia dorsal Cadeia ventral Espícula Figura 6.3Figura 6.3Figura 6.3Figura 6.3Figura 6.3 Formação dos cordões sinciciais por células mesenquimatosas do ouriço-do-mar. (A) Células mesenquimatosas primárias da gástrula precoce se alinham e se fundem para depositar a matriz da espícula de carbonato de cálcio. (B) microfotografia eletrônica de varredura de espículas formadas pela fusão das células mesenquimatosas primárias para formar os cordões sinciciais. (C) Anel de células mesenquimatosas em volta do arquêntero (intestino primitivo). A metade animal e todo o arquêntero foram removidos. (D) Colocação das células mesenquimatosas primárias na larva precoce de Lytechinus variegatus. (A e D de Ettensohn, 1990; B e C de Morrill e Santos, 1985; todas as fotografias, cortesia dos autores.) (D) começo, as células parecem se movimentar ao acaso, ao longo da superfície interna da blastocele, ativamente produzindo e quebrando conexões filopódicas com a parede da blastocele. Finalmente, essas células tornam-se localizadas dentro da provável região ventrolateral da blastocele, onde considera-se que sua aderência seja maior. Aqui, as células mesenquimatosas primárias se fundem em cordões sinciciais, que formarão o eixo das espículas de carbonato de cálcio do esqueleto larval (Figura 6.3). Estudos mais recentes (Cherr et al., 1992) sugerem que a migração inicial das células mesenqui- matosas primárias é dirigida pela parede da blastocele e pelas fibrilas paralelas do material da matriz extracelular que invadem a blastocele. As células mesenquimatosas primárias parecem migrar ao longo da superfície da blastocele e são envolvidas no emaranhado dessas fibrilas (Figura 6.4). IMPORTÂNCIA DA LÂMINA EXTRACELULAR NO INTERIOR DA BLASTOCELE. Os eventos que se dão no citoplasma e na superfície celular são fundamentais para o ingresso e a migração das células mesenquimatosas primárias. Gustafson e Wolpert (1967) propuseram um modelo no qual o ingresso dos micrômeros se dá através de modificações de sua adesão a outras células e às matrizes extracelulares que os rodei- am. Em 1985, Fink e McClay confirmaram as especulações de Gustafson e Wolpert, medindo as forças de adesão dos blastômeros de ouriço-do-mar, em relação à camada hialina, à lâmina basal e a outras células. Originalmente todas as células da blástula estão ligadas pela sua superfície externa à camada hialina e sua superfície interna ligada à lâmina basal secretada pelas células (veja Capítulo 3). Na sua lateral, cada célula tem outra célula como vizinha. Fink e McClay verificaram que os futuros ectoderma e endoderma (descendentes dos macrômeros e mesômeros, respectiva- mente) se ligam fortemente entre si e à camada hialina, mas aderem fracamente à lâmina basal (Tabela 6.1). Os micrômeros da blástula mostram, originalmente, um padrão simi- lar de ligação. Entretanto, o padrão de ligação dos micrômeros muda na gastrulação. CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 213 (A) (B) (C) Enquanto outras células mantêm sua forte ligação à camada hialina e às células vizi- nhas, as precursoras do mesênquima primário perdem sua afinidade a essas estruturas (para aproximadamente 2% do valor original), enquanto que sua afinidade aos compo- nentes da lâmina basal e matriz extracelular aumenta 100 vezes. Essa mudança na afinidade faz com que os micrômeros percam suas ligações com a camada hialina externa e com as células circundantes e, atraídos pela lâmina basal, migram para o interior da blastocele (Figura 6.5). As modificações na afinidade celular foram Figure 6.4Figure 6.4Figure 6.4Figure 6.4Figure 6.4 Fotografias ao estéreo-microscópio eletrônico de varredura de células mesenquimatosas primá- rias dentro da matriz extracelular de fibrilas da blastocele. (A) Células mesenquimatosas primá- rias enredadas na matriz extracelular da gástrula precoce de Strongylus centrotus. (B,C) migra- ção de células mesenquimatosas em estágio de gástrula. As fibrilas da matriz extracelular da blastocele ficaram paralelas ao eixo animal-vegetal e estão intimamente associadas com as célu- las mesenquimatosas primárias. (de Cherr et al., 1992; cortesia de G. Cherr.) TTTTTabela 6.1abela 6.1abela 6.1abela 6.1abela 6.1 Afinidades de células mesenquimatosas e não-mesenquimatosas aos componentesa celulares e extracelulares Força de deslocamento (em dinas) Tipo celular Hialino Monocamadas de Lâmina basal células gastrulares Micrômeros em estágio de 16 células 5.8 x 10-5 6.8 x 10-5 4.8 x 10-7 Células mesenquimatosas em estágio migratório 1.2 x 10-7 1.2 x 10-7 1.5 x 10-5 Ectoderma e endoderma gastrular 5.0 x 10-5 5.0 x 10-5 5.0 x 10-7 Fonte: Segundo Fink e McClay, 1985. a Células testadas foram colocadas em placas contendo hialino, lâmina basal extracelular, ou monocamadas celulares. As placas foram invertidas e centrifugadas a várias forças para deslocar as células. A força de deslocamento é calculada pela força centrífuga necessária para remover as células teste do substrato. 214 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) (E) (F) Matriz extracelular fibrilar Blastocele Lâmina basal Células Mesenquimatosas primárias Camada hialina Cílios correlacionadas com modificações nas moléculas da superfície celular que ocorreram durante esse período (Wessel e McClay, 1985). Como mostra a Figura 6.4, há uma alta concentração de material da lâmina extracelular ao redor das células mesenquimatosas primárias ingressantes (Galileo e Morrill, 1985; Cherr et al., 1992). Além disso, uma vez dentro da blastocele, as células mesenquimato- sas primárias parecem migrar ao longo da matriz extracelular da parede da blastocele, extendendo seus filopódios a sua frente (Galileo e Morrill, 1985; Karp e Solursh, 1985). A orientação das fibrilas, ao longo do eixo animal-vegetal, pode estar guiando as células em sua migração. Três proteínas parecem ser importantes nessa migração. Uma é a fibronectina, uma grande glicoproteína (400-kDa), que é um componente comum das lâminas basais, incluindo aquela da blastocele do ouriço-do-mar (Wessel et al., 1984). Fink e McClay mostraram que durante a gastrulação, a afinidade dos micrômeros por essa molécula específica aumenta dramaticamente. O segundo grupo de moléculas con- siste de proteoglicanos sulfatados encontrados na superfície das células mesenquima- tosas ingressantes (veja Capítulo 3; Sugiyama, 1972; Lane e Solursh, 1991). Se a síntese (ou sulfatação) desses proteoglicanos é inibida, as células mesenquimatosas entram na blastocele, mas não continuam a migrar* (Figura 6.6; Karp e Solursh, 1974; Anstrom et al., 1987). A terceira proteína, ECM18, é encontrada nas matrizes extracelulares das célu- las da blastocele e é expressa somente durante a gastrulação. Bloquear ECM18 com anticorpos previne tanto a migração mesenquimatosa primária quanto a invaginação secundária do endoderma (Berg et al., 1996). Porém, esses sinais de orientação não são suficientes, pois os micrômeros “sabem” quando parar seu movimento e formar espículas perto do equador da blastocele. As células mesenquimatosas primárias se organizam em forma de anel em uma posição específica ao longo do eixo animal-vegetal. Em dois sítios perto do futuro lado ventral da larva, muitas dessas células mesenquimatosas primárias se agrupam para iniciar a forma- ção de espículas (Figura 6.3). Se ummicrômero marcado de outro embrião é injetado na blastocele em gastrulação de um embrião de ouriço-do-mar, ele migra para o local correto *Em um dos primeiros experimentos em embriologia química, Curt Herbst (1904) observou que embriões de ouriço-do-mar não gastrulavam adequadamente quando colocados em água do mar que não continha íons sulfato. Na época, ele não podia entender o porquê. Figure 6.5Figure 6.5Figure 6.5Figure 6.5Figure 6.5 Ingresso de células mesenquimatosas primárias. (A-E) Diagramas interpretativos descrevendo alterações nas interações adesivas nas presumidas células mesenquimatosas primárias (cor). Essas células perdem suas afinidades pelo hialino e por seus blastômeros vizinhos enquanto adquirem afinidade pela lâmina basal. Blastômeros não-mesenquimatosos retêm suas originais afinidades pelo hialino e células vicinais. (F) Montagem de micrografia eletrônica de varredura mostrando o ingresso de células primárias de Lytechinus variegatus. (F cortesia de J. B. Morrill e D. Flaherty.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 215 (A) (B) e contribui para a formação das espículas embrionárias (Prancha 35). Se células mesen- quimatosas primárias de embriões mais velhos são injetadas em gástrulas mais jovens, elas atrasarão sua diferenciação, migrarão como as células mais jovens e serão incorpo- radas normalmente no mesênquima do hospedeiro. Além disso, se todas as células mesenquimatosas do hospedeiro são removidas antes da injeção de células mesenqui- matosas mais velhas, essas repetirão os estágios iniciais de sua migração, formando um anel mesenquimatoso e o esqueleto, normalmente (Ettensohn, 1990). Considera-se que essa informação posicional é fornecida pelas futuras células ectodérmicas e suas lâmi- nas basais (von Übisch, 1939; Harkey e Whiteley, 1980). Somente células mesenquima- tosas primárias (e não outros tipos de células ou partículas de látex) são capazes de responder a esses sinais modeladores (Ettensohn e McClay, 1986). Miller e colegas (1995) observaram a existência de filopódios extremamente delgados (0.3 µm de diâme- tro) no mesênquima esqueletogênico (skeletonogenic); esses parecem explorar e sentir a parede da blastocele (Figura 6.7). Esses filopódios contêm actina e não são considera- dos como locomotores. Em lugar disso, são considerados como sensores do ambiente, da mesma maneira que os filopódios nas pontas dos cones de crescimento axonal. Essas extensões delgadas podem ser responsáveis pela captação de sinais modeladores dorsoventral e animal-vegetal, a partir do ectoderma (Malinda et al., 1995). Primeiro estágio da invaginação do arquênteroPrimeiro estágio da invaginação do arquênteroPrimeiro estágio da invaginação do arquênteroPrimeiro estágio da invaginação do arquênteroPrimeiro estágio da invaginação do arquêntero Enquanto se forma o anel de células mesenquimatosas primárias no pólo vegetal da blastocele, mudanças importantes estão ocorrendo nas células que permanecem na Figura 6.6Figura 6.6Figura 6.6Figura 6.6Figura 6.6 Efeito da privação de sulfato no movimento do mesênquima primário do ouriço-do-mar Ly- techinus. (A) Gástrula normal. (B) Gástrula anormal formada quando embriões são culti- vados em água do mar livre de sulfato. (de Karp e Solursh, 1974, cortesia de M. Solursh.) Figura 6.7Figura 6.7Figura 6.7Figura 6.7Figura 6.7 Videomicrografia de Nomarski mostrando um filopódio longo e fino estendendo-se de uma célula mesenquimatosa primária até a parede ectodérmica da gástrula, assim como um filopódio mais curto estendendo-se para dentro do ectoderma. Os filopódios mesenquimatosos estendem-se através da matriz extracelular e contatam diretamente a membrana celular das células ectodérmicas. (de Miller et al., 1995; fotografia cortesia de D. McClay.) 216 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) Células da placa vegetal empurradas para cima Blastocele interior Células de placa vegetal Vesículas secretoras com proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) CSPG secretado para a lâmina interna absorve água, causando tumefaçãoLâmina internaCamada hialina Microvilosidades Lâmina externa placa vegetativa. Essas células permanecem ligadas umas às outras e à camada hialina do ovo, e se movem para ocupar os vazios deixados pelo ingresso do mesênquima; portanto, a placa vegetal se achata ainda mais. Verifica-se, também, que a placa vegetal se dobra para dentro e se estende por um quarto ou até a metade do seu caminho para a blastocele (veja Figura 6.2, 10.5-11.5 horas; Figura 6.8A). Então, repentinamente, a invaginação cessa. A região invaginada é chamada de arquêntero (intestino primitivo) e sua abertura no pólo vegetal chamada de blastóporo. Quais forças atuam para invaginar essas células? Lane e colaboradores (1993) mostraram que o envergamento é semelhante aquele produzido pelo aquecimento de uma faixa bimetálica. A camada hialina é, na verdade, formada de duas lâminas: uma externa, formada primariamente de proteína hialina, e uma interna, composta de prote- ínas fibropelinas* (Hall e Vacquier. 1982; Bisgrove et al., 1991). As células da placa vegetal (e somente essas células) secretam um proteoglicano de condroitina sulfato na lâmina interna da camada hialina, diretamente abaixo delas. Essa molécula higroscópica (absorvente de água) incha a lâmina interna mas não a externa. Isso causa o envergamento da camada hialina (Figura 6.8B,C). Um pouco mais tarde, uma *Fibropelinas são armazenadas em grânulos secretores dentro dos oócitos. São secretadas desses grânulos após a liberação da proteína hialina pela exocitose granular cortical. No estágio de blástula, as fibropelinas já formaram um envoltório, tipo rede, sobre a superfície do embrião. Figura 6.8Figura 6.8Figura 6.8Figura 6.8Figura 6.8 Invaginação da placa vegetal. (A) Invaginação da placa vegetal de Lytechinus variegatus vista por micrografia eletrônica de varredura da superfície externa da gástrula precoce. O blastóporo está claramente visível. (B) a camada hialina consiste de lâminas internas e externas. Microvi- losidades da placa vegetal estendem-se através da camada hialina e seu citoplasma contém vesículas secretoras que armazenam um proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG). (C) Os grânulos de armazenamento secretam o proteoglicano para dentro da lâmina interna da camada hialina. O proteoglicano absorve água e entumece a lâmina interna, enquanto a lâmina externa, ao qual está fixado, não entumece. Isso ocasiona a curvatura para dentro do envoltório hialino e do epitélio a ele ligado. (A de Morrill e Santos, 1985, cortesia de J. B. Morrill e C segundo Lane et al., 1993.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 217 Gastrulação precoce Gastrulação tardia blastóporo (A) (B) segunda força resultante dos movimentos das células epiteliais adjacentes à placa vegetal, pode facilitar essa invaginação puxando para dentro a camada envergada (Burke et al., 1991). Segundo e terceiro estágios da invaginação do arquênteroSegundo e terceiro estágios da invaginação do arquênteroSegundo e terceiro estágios da invaginação do arquênteroSegundo e terceiro estágios da invaginação do arquênteroSegundo e terceiro estágios da invaginação do arquêntero A invaginação das células vegetais ocorre em três estágios discretos. Após uma breve pausa, começa a segunda fase da formação do arquêntero. Durante essa fase, o arquêntero se estende dramaticamente, algumas vezes triplicando seu comprimento. No processo de extensão, o largo e curto intestino rudimentar é transformado em um tubo longo e delgado; mas não são formadas novas células (veja Figura 6.2, 12 horas; Figura 6.9). Para produzir essa extensão, as células do arquêntero se reorganizam migrando umas sobre as outras e sofrendo um achatamento (Ettensohn, 1985; Hardin e Cheng, 1986). Esse fenômeno, onde células se intercalam para estreitaro tecido e, ao mesmo tempo, levá-lo adiante é chamado extensão convergente. Em pelo menos algumas espécies de ouriço-do-mar, ocorre um terceiro estágio no alongamento do arquêntero. Essa última fase é iniciada pela tensão propiciada pelas células mesenquimatosas secundárias, que se formam na ponta do arquêntero e lá permanecem (veja Figura 6.2, 13 horas; Figura 6.10). Os filopódios se estendem dessas células através do fluido da blastocele e fazem o contacto com a superfície interna da Figura 6.9Figura 6.9Figura 6.9Figura 6.9Figura 6.9 Rearranjo celular durante a extensão do arquêntero em embriões de ouriço-do-mar. Nessa espécie, o arquêntero precoce tem 20 a 30 células ao redor de sua circunferência. Mais tardiamente na gastrulação, o arquêntero tem uma circunferência constituída de somente 6 a 8 células. Clones marcados fluorescente- mente podem ser vistos estendendo-se apicalmente. (Segundo Hardin, 1990.) Figura 6.10Figura 6.10Figura 6.10Figura 6.10Figura 6.10 Estágio de gástrula intermediária do ouriço- do-mar Lytechinus pictus, mostrando exten- sões de filopódios do mesênquima secundá- rio estendendo-se da ponta do arquêntero até a parede da blastocele. (A) Células mesen- quimatosas estendendo filopódios da ponta do arquêntero. (B) Cabos de filopódios conectando a parede da blastocele à ponta do arquêntero. A tensão nos cabos pode ser ava- liada pela tração exercida sobre a parede da blastocele no ponto de fixação. (Fotografias cortesia de C. Ettensohn.) 218 PARTE II Padrões de Desenvolvimento parede da blastocele (Dan e Okazaki, 1956; Schroeder, 1981). Os filopódios se ligam à parede nas junções entre as células do blastoderma e, em seguida, se contraem, arras- tando o arquêntero para cima. Hardin (1988) removeu as células mesenquimatosas secundárias com um laser, e como conseqüência o arquêntero só pode se alongar aproximadamente em dois terços do seu comprimento total. Quando algumas células mesenquimatosas secundárias foram deixadas, o alongamento continuou, embora em velocidade menor do que nos controles. As células mesenquimatosas secundárias têm, então, um papel essencial em elevar o arquêntero até a parede da blastocele durante a última fase da invaginação. Mas, podem os filopódios mesenquimatosos secundários se ligar a qualquer parte da parede da blastocele, ou existe um alvo específico no hemisfério animal que precisa estar presente para que a ligação ocorra? Existe alguma região da parede da blastocele que é predestinada a se tornar o lado ventral da larva? Estudos de Hardin e McClay (1990) mostram que existe um “alvo” específico para os filopódios do hemisfério ani- mal, que difere de outras regiões. Os filopódios das células mesenquimatosas secun- dárias se estendem, tocam a parede da blastocele ao acaso e, em seguida, se retraem. Entretanto, quando os filopódios atingem uma região específica da parede, eles per- manecem ligados naquele local, se achatam contra essa região e puxam o arquêntero em direção a ela. Quando Hardin e McClay comprimiram o outro lado da parede da blastocele, de modo que o contato com a região se tornou mais eficiente, os filopódios continuaram a se estenderem e a se contraírem ao tocar a parede daquela região. Somente quando os filopódios encontraram o “alvo” é que cessaram os movimentos. Com a gástrula contraída de modo a impedir que os filopódios jamais atingissem a área “alvo”, as células secundárias mesenquimatosas continuaram sua exploração até que finalmente se afastaram do arquêntero e encontraram o tecido alvo, como células migratórias livres. Parece então, que existe uma região alvo destinada a se transformar na região ventral da larva, que é reconhecida pelas células mesenquimatosas secun- dárias e que posiciona o arquêntero na região onde se formará a boca. Quando o topo do arquêntero encontra a parede da blastocele nessa região, as células mesenquimatosas secundárias se dispersam no interior da blastocele, onde proliferam para formar os órgãos mesodérmicos (veja Figura 6.2, 13.5 horas). Onde o arquêntero contata a parede se formará, finalmente, uma boca que se fundirá a ele formando um tubo digestivo contínuo. Assim, como é característico para os deuterostomatas, o blastóporo marca a posição do ânus. Gastrulação em peixes A transição da blástula intermediáriaA transição da blástula intermediáriaA transição da blástula intermediáriaA transição da blástula intermediáriaA transição da blástula intermediária e a aquisição de motilidade celulare a aquisição de motilidade celulare a aquisição de motilidade celulare a aquisição de motilidade celulare a aquisição de motilidade celular Durante o décimo ciclo de clivagem do peixe-zebra, as divisões celulares perdem sua sincronia, novos genes são expressos e as células se tornam móveis. Essa transição da blástula intermediária (MBT) também é evidente em rãs e em Droso- phila. Como discutido no Capítulo 5, a MBT parece ser regulada pela relação entre cromatina e citoplasma. Peixes haplóides entram na MBT um ciclo mais tarde; peixes tetraplóides entram um ciclo antes (Kane e Kimmel, 1993). Parece que algu- ma coisa na cromatina está “removendo por titulação” alguma substância (até agora desconhecida) do citoplasma. O primeiro movimento celular é a epibolia das células blastodérmicas sobre o vitelo. Na fase inicial, as células blastodérmicas internas se movem para o exterior e se intercalam com as células mais superficiais (Warga e Kimmel, 1990). Mais tarde, as células se movem sobre a superfície do vitelo envolvendo-o completamente (Figura 6.11). Esse movimento não é devido a um arrastão ativo dos blastômeros. Pelo contrá- rio, o movimento é propiciado pela expansão autônoma da camada sincicial do vitelo (YSL) “dentro” do citoplasma do hemisfério animal. A camada envolvente (EVL) está CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 219 (A) 30% DE EPIBOLIA (4.7 HS) Camada envolvente Pólo animal Camada profunda Camada sincicial do vitelo Ventral Dorsal Célula do vitelo Núcleo do vitelo Pólo vegetal (B) ESCUDO (6.0 HS.) (C) Ingresso celularPólo animal Epiblasto Hipoblasto Hipoblasto Camada envolvente Escudo Epiblasto Células em involução Ventral Dorsal Células em não- involução Sinal indutor mesodérmico Sinais indutores mesodérmicos e dorsais Camada sincicial do vitelo Grânulo do vitelo Pólo animal Pólo vegetal (D) (E) Pólo animal Pólo animal Mesoderma dorsal Anterior Região cefálica Camada envolvente Camada envolvente Ventral Dorsal Ventral Dorsal Mesoderma Coto caudal Somito #1 Ectoderma, neuroectoderma Posterior Região do troncoMesendoderma: precursores para mesoderma e endoderma Endoderma (90% EPIBOLIA (9 HS) 1 SOMITO (10.3 HS) Figura 6.11Figura 6.11Figura 6.11Figura 6.11Figura 6.11 Movimentos celulares durante a gastrulação do teleósteo Danio rerio. (A) O blastoderma com epibolia 30 porcento completa. (B) Formação do hipoblasto, por involução de células na margem do blastoderma em epibolização ou por delaminação de células do epiblasto. (C) Detalhe da região marginal. (D) Com 90 porcento de epibolia, o mesoderma pode ser visto rodeando o vitelo, entre o ectoderma e o endoderma. (E) Término da gastrulação. (Segundo Driever, 1995, e Langeland e Kimmel, 1997.) Pólo Vegetal fortemente ligada à YSL e é arrastada junto com ela. As células mais profundas do blastoderma enchem o espaço entre a YSL e a EVL enquanto a epibolia se desenvolve. Isso pode ser demonstrado cortando a ligação entre YSL e EVL. Quando isso é feito, as células blastodérmicas retornam ao topo do vitelo enquanto YSL continua sua expansão ao redor da célula do vitelo (Trinkaus, 1984b, 1992). A expansão de YSL tem como base uma rede de microtúbulos em sua estrutura, e radiação ou drogas que 220 PARTE II Padrões de Desenvolvimento(B) (C) (D) (E) (A) Pólo animal Extensão Escudo embrionário Convergência Involução Epibolia Célula do vitelo impedem a polimerização de tubulina inibem a epibolia (Strahle e Jesuthasan, 1993; Solnica-krezel e Driever, 1994). Durante a migração, um dos lados do blastoderma se torna visivelmente mais grosso do que o outro. Experimentos com marcação de células indicam que o lado mais delgado marca o sítio da futura superfície dorsal do embrião (Schmidt e Campos- Ortega, 1995). Formação das camadas germinaisFormação das camadas germinaisFormação das camadas germinaisFormação das camadas germinaisFormação das camadas germinais Depois que as células blastodérmicas cobrem aproximadamente a metade da célula do vitelo do peixe-zebra (e mais cedo em ovos de peixes com vitelos maiores) um espessamento ocorre ao longo de toda a margem. Esse espessamento é chamado de anel germinativo, e é composto de uma camada superficial, o epiblasto, e uma camada interna, o hipoblasto. Não entendemos como é produzido o hipoblasto. Alguns labo- ratórios alegam que o hipoblasto é formado pela involução das células superficiais abaixo da margem, seguida por sua migração para o pólo animal (veja Figura 6.11). A involução começa na futura porção dorsal do embrião, mas ocorre na margem inteira. Outros laboratórios alegam que essas células hipoblásticas ingressam para formar o hipoblasto (veja Trinkaus, 1996). (É possível que ambos os mecanismos ocorram com diferentes maneiras de formar o hipoblasto predominando em espécies diferentes.) Uma vez formado o anel, as células profundas de ambos, epiblasto e hipoblasto, se intercalam no futuro lado dorsal do embrião, para formar um espessamento localizado, o escudo embrionário (Figura 6.12). Esse escudo é funcionalmente equivalente ao lábio dorsal do blastóporo de anfíbios, pois ele pode organizar um eixo embrionário secundário quando transplantado a um embrião hospedeiro (Oppenheimer, 1936; Ho, 1992; veja discussão de gastrulação em anfíbios). Assim, enquanto as células realizam a epibolia em torno do vitelo, elas também estão involuindo nas margens e convergindo anteriormente e dorsalmente em direção Figura 6.12Figura 6.12Figura 6.12Figura 6.12Figura 6.12 Convergência e extensão no peixe-zebra. (A) Vista dorsal de movimentos de convergência e extensão durante a gastrulação do peixe-zebra. A epibolia es- tende o blastoderma sobre o vitelo; a involução ou o ingresso geram o hipoblasto; convergência e extensão trazem células do hipoblasto e epiblasto para o lado dorsal para formar o escudo embrionário. Dentro do escudo, a intercalação estende o cordomesoderma em direção ao pólo animal. (B,C) Extensão con- vergente do cordomesoderma é mostrada por aquelas células exprimindo o gene no tail (sem cauda), um gene que é expresso pelas células da notocorda. (D,E) Extensão convergente de células mesodérmicais adaxiais (marcadas pela sua expressão de gene snail para flanquear a notocorda. (de Langeland e Kimmel, 1997.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 221 (A) (B) (C) (D) (E) Manchas de corante no embriãoVidro para segurar o embrião Discos de ágar com corante Lábio dorsal do blastóporo Embrião Secção em plano de visão (E) ao escudo embrionário (Trinkaus, 1992). As células hipoblásticas do escudo embrio- nário convergem e se estendem anteriormente, finalmente estreitando-se ao longo da linha dorsal média do hipoblasto. Esse é o cordomesoderma, o primórdio da notocorda (Figura 6.12B,C). As células adjacentes ao cordomesoderma, as células adaxiais, são as precursoras dos somitos mesodérmicos (Figura 6.12D,E). A convergência e a exten- são no epiblasto traz as células presuntivas do cérebro de todo o epiblasto para a linha média dorsal onde formam a quilha neural. O resto do epiblasto se torna a pele do peixe. O mapa de destino do peixe-zebra, então, não é tão diferente daquele da rã ou outros vertebrados (como logo veremos). Se abrirmos, conceitualmente, uma blástula de Xenopus no pólo vegetal e esticarmos a abertura em um anel marginal, o mapa de destino resultante se parece muito com aquele do embrião do peixe-zebra quando metade do vitelo estava coberto pelo blastoderma (Langeland e Kimmel, 1997). Gastrulação de anfíbios O estudo da gastrulação em anfíbios é ao mesmo tempo uma das mais antigas e uma das mais novas áreas da embriologia experimental; mesmo considerando que gastru- lação de anfíbios foi estudada extensamente no século passado, a maior parte de nossas teorias relacionadas aos mecanismos do movimento no desenvolvimento, foram revisadas na década passada. O estudo da gastrulação em anfíbios foi compli- cado pelo fato de existir mais de um tipo de gastrulação nos anfíbios. Espécies diferen- tes empregam diferentes maneiras para atingir o mesmo objetivo (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Nos últimos anos, a pesquisa mais intensa se concentrou em Xenopus, portanto, daremos ênfase ao seu processo de gastrulação. Movimentos celulares durante a gastrulação de anfíbiosMovimentos celulares durante a gastrulação de anfíbiosMovimentos celulares durante a gastrulação de anfíbiosMovimentos celulares durante a gastrulação de anfíbiosMovimentos celulares durante a gastrulação de anfíbios As blástulas de anfíbios têm as mesmas tarefas que seus companheiros, equinoder- mos e peixes, ou seja, trazer para dentro aquelas áreas destinadas a formar os órgãos endodérmicos, envolver o embrião com células capazes de formar o ectoderma e colo- car as células mesodérmicas no lugar apropriado entre elas. Os movimentos pelos quais isso é conseguido podem ser visualizados pela técnica de coloração vital. Vogt (1929) saturou fragmentos de ágar com corante, como vermelho neutro ou sulfato de azul do Nilo, os quais coram mas não danificam as células embrionárias. Esses frag- mentos corados de ágar foram pressionados contra a superfície da blástula e uma parte do corante foi transferida para as células contatadas (Figura 6.13). Os movimen- tos de cada grupo de células coradas foram acompanhados através da gastrulação, e Figura 6.13Figura 6.13Figura 6.13Figura 6.13Figura 6.13 Coloração vital de embriões de anfíbios. (A) Método de Vogt para marcação de células especí- ficas da superfície embrionária com corantes vitais. (B-D) Vistas da superfície do corante em embriões sucessivos. (E) Embrião de tritão dissecado no plano mediano para mostrar células coradas no interior. (Segundo Vogt, 1929.) 222 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Epiderme Placa neural Endoderma acima do blastóporo Mesoderma lateral Notocorda Endoderma abaixo do blastóporo Blastóporo Blastóporo Somitos (A) EXTERIOR (B) INTERIOR os resultados sumariados em mapas de destino. Esses mapas foram recentemente confirmados e ampliados por técnicas de microscopia eletrônica de varredura e de injeção de corantes (Smith e Malacinski, 1983; Lundmark, 1986). Estudos com corantes vitais de Løvtrup (1975; Landstrom Løvtrup, 1979) e de Keller (1975, 1976) mostraram que as células da blástula de Xenopus têm diferentes destinos, conforme se encontrem nas camadas profundas ou superficiais do embrião (Figura 6.14). Em Xenopus, os precursores mesodérmicos existem somente na camada profunda, enquanto que o ectoderma e endoderma se originam da camada superficial do embrião. Os precursores da notocorda e outros tecidos mesodérmicos estão loca- lizados abaixo da superfície, na região equatorial (marginal) do embrião. Em urodelos (salamandras, tais como: Triturus e Ambystoma) e em algumas rãs sem ser o Xenopus, os precursores da notocorda e do mesoderma são encontrados em ambas, nas células da superfície e nas células marginais profundas (Purcell e Keller, 1993). A gastrulação em embriões de rã é iniciada no futuro lado dorsal do embrião, logo abaixo do equador na região do crescente cinzento (Figura 6.15). Nesseponto, as futuras células endodérmicas locais invaginam dando lugar à formação de um blastóporo em forma de fenda. Essas células modificam sua forma dramaticamente. O corpo prin- cipal de cada célula é deslocado na direção interna do embrião, mas o contacto com a superfície externa é mantido por um delgado filamento semelhante a um pescoço (Figura 6.16). Essas células garrafa revestem o arquêntero inicial. Assim, como na gastrulação do ouriço-do-mar, uma invaginação de células inicia a formação do arquêntero. Entretanto, ao contrário da gastrulação em ouriço-do-mar, a gastrulação na rã não começa no pólo vegetativo, mas na zona marginal próxima ao equador da blástula, onde se encontram os hemisférios animal e vegetal. Aqui, as células endodérmicas não são tão grandes e nem tão ricas em vitelo como os blastômeros do pólo vegetativo. A próxima fase da gastrulação envolve a involução das células da zona marginal, enquanto as células do pólo animal sofrem epibolia e convergem no blastóporo. Quando as células marginais migratórias chegam ao lábio dorsal do blastóporo, elas se dirigem para dentro e migram ao longo da superfície interna das lâminas celulares externas. Dessa forma, as células que constituem o lábio do blastóporo estão constantemente mudando. As primeiras células que compõem o lábio dorsal são as células garrafa que invaginam para formar a borda anterior do arquêntero. Essas células, mais tarde, se tornam as células faríngeas do intestino anterior. Enquanto essas primeiras células passam para o interior do embrião, o lábio do blastóporo passa a ser composto de células que involuem para dentro do embrião, tornando-se os precursores do mesoderma da cabeça. As próximas células involuindo para o embrião, através do lábio dorsal do blastóporo, são as células cordomesodérmicas. Essas células formarão a notocorda, uma “espinha dorsal” mesodérmica transitória que é essencial para o início da diferenciação do sistema nervoso. À medida que as novas células migram para dentro do embrião, a blastocele é deslocada para o lado oposto ao lábio dorsal do blastóporo. Enquanto isso, o lábio do blastóporo se expande lateral e ventralmente, bem como os processos de formação das células garrafa e involução continuam no blastóporo. O blastóporo em expansão Figura 6.14Figura 6.14Figura 6.14Figura 6.14Figura 6.14 Mapas do destino da blástula da rã Xenopus laevis. Mapas de destino (A) de células exte- riores e (B) interiores indicam que a maioria dos derivados mesodérmicos são formados de células interiores. Nessa vista lateral, o ponto em que se forma o lábio dorsal do blastóporo está indicado por uma flecha. (Se- gundo Keller, 1976.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 223 Pólo animal (AP) (A) Arquêntero Blastocele Lábio dorsal do blastóporo Mesoderma Células superficiais Blastocele deslocada EndodermaCélulas profundas Pólo vegetal (B) (C) Ectoderma MesênquimaMesoderma dorsal Arquêntero Ectoderma NotocordaNotocorda Lábio dorsal do blastóporo Lábio dorsal do blastóporo Lábio lateral do blastóporo Lábio lateral do blastóporo Endoderma Ectoderma Tampo do vitelo Endomesoderma anterior (D) (E) (F) Mesoderma ventral Lábio ventral do blastóporo Figura 6.15Figura 6.15Figura 6.15Figura 6.15Figura 6.15 Movimentos celulares durante a gastrulação da rã. As seções são cortadas através da metade do embrião, e são posicionadas de modo que o pólo vegetal seja inclinado na direção do observador e ligeiramente para a esquerda. Os principais movimentos celula- res estão indicados por flechas, e as células superficiais do hemisfério animal estão coloridas para permitir o seguimento de sua movimentação. (A,B) Gastrulação precoce. Células de garrafa da margem movem-se para o interior para formar o lábio do blastóporo, e precursores mesodérmicos involuem sob o teto da blastocele. AP marca a posição do pólo animal, que irá mudar à medida que a gastrulação prossegue. (C,D) Gastrulação intermediária. O arquêntero se forma e desloca a blastocele, e as células migram dos lábios lateral e ventral do blastóporo para dentro do embrião. As células do hemisfério animal migram em direção da região vegetal, movendo o blastóporo para região próxima do pólo vegetal. (E,F) Perto do fim da gastrulação, a blastocele é obliterada, o embrião fica envolvido pelo ectoderma, o endoderma foi internalizado, e as células mesodérmicas se posicionaram entre o ectoderma e o endoderma. (Segundo Keller, 1986.) Blastóporo Figura 6.16Figura 6.16Figura 6.16Figura 6.16Figura 6.16 Estrutura do lábio do blastóporo. (A) Dia- grama de células de uma seção da gastrula- ção do embrião da salamandra, mostrando a extensão das células-garrafa do blastóporo. (B) Visão de superfície de um lábio dorsal precoce do blastóporo de Xenopus. A dife- rença de tamanho entre os blastômeros ani- mais e vegetais está claramente aparente. (C) Detalhe da região onde as células do hemis- fério animal estão involuindo através do lá- bio do blastóporo. (A segundo Holtfreter, 1943; B e C, micrografias de varredura ele- trônica cortesia de C. Phillips.)(A) (B) (C) Células- garrafa 224 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) Lábio dorsal Obturador do vitelo Lábio lateral Lábio do blastóporo Lábio ventral Obturador do vitelo i ii iii iv v como um “crescente”, desenvolve lábios laterais e, finalmente, um lábio ventral sobre o qual passam células precursoras adicionais, mesodérmicas e endodérmicas. Com a formação do lábio ventral, o blastóporo forma uma anel ao redor das grandes células endodérmicas que permanecem expostas na superfície do pólo vegetativo. Esse peda- ço remanescente de endoderma é chamado de rolha ou obturador do vitelo; ele tam- bém é finalmente internalizado (Figura 6.17). Naquele ponto, todos os precursores endodérmicos foram trazidos para o interior do embrião, o ectoderma envolveu a superfície e o mesoderma foi colocado entre eles. Posicionando o blastóporoPosicionando o blastóporoPosicionando o blastóporoPosicionando o blastóporoPosicionando o blastóporo Tendo visto os aspectos gerais da gastrulação em anfíbios, podemos agora nos ocu- par de cada passo em detalhe. A gastrulação não existe como um processo indepen- dente na vida do animal. Na verdade, a preparação para a gastrulação já pode ser visualizada no preciso momento da fusão óvulo-espermatozóide. O óvulo tem uma polaridade ao longo do eixo animal-vegetal. O destino geral dessas regiões pode ser previsto antes da fecundação. A superfície do hemisfério animal se transformará nas células do ectoderma (pele e nervos), o hemisfério vegetal formará as células do intes- tino e órgãos associados (endoderma), e as células mesodérmicas serão formadas a partir do citoplasma interno, ao redor do equador. Assim, as camadas germinativas podem ser mapeadas no óvulo; porém, isso nada diz sobre qual parte do ovo formará a frente e qual as costas. Os eixos dorsoventral (dorso-frente), ântero-posterior e direito-esquerdo ainda não foram determinados. Os eixos dorsoventral e ântero-posterior são especificados pelo deslocamento do citoplasma do zigoto durante a fecundação. No Capítulo 4 discutimos a rotação do citoplasma cortical relativo ao citoplasma interno no ovo da rã. O citoplasma interno permanece orientado em relação à gravidade devido a sua densa acumula- ção de vitelo, enquanto o citoplasma cortical gira 30o na direção do hemisfério ani- mal (para cima) em direção ao ponto de entrada do espermatozóide (veja Figura 4.34). Figura 6.17Figura 6.17Figura 6.17Figura 6.17Figura 6.17 Epibolia do ectoderma. (A) Movimentos morfogenéticos de células migrando para o interior do blastóporo e em seguida sob a superfície. (B) Mudanças na região ao redor do blastóporo quando se formam sucessivamente os lábios dorsal, lateral e ventral. Quando o lábio ventralcompleta o círculo, o endoderma torna-se progressivamente internalizado. Números ii-v corres- pondem às Figuras 6.15B-E, respectivamente. (B de Balinsky, 1975, cortesia de B. I. Balinsky.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 225 Essa rotação faz com que o eixo animal-vegetal da superfície do ovo se desloque 30o relativo ao eixo animal-vegetal do citoplasma interno. Dessa maneira, um novo esta- do de simetria é adquirido. Enquanto que o óvulo era radialmente simétrico em relação ao eixo animal-vegetal, o ovo fecundado agora tem um eixo dorsoventral e é bilateralmente simétrico (tem lados direito e esquerdo). O citoplasma interno tam- bém se move, e microscopia de fluorescência de embriões precoces mostrou que os padrões citoplasmáticos das células presuntivas dorsais são diferentes daqueles das células presuntivas ventrais (Prancha 7). Esses movimentos citoplasmáticos ativam o citoplasma oposto ao ponto de entrada do espermatozóide, a iniciar a gastrulação (Figura 6.18). O lado pelo qual entra o espermatozóide marca a futura superfície ventral do embrião; o lado oposto, onde se inicia a gastrulação, marca o futuro dorso (costas) do embrião (Gerhart et al., 1981; Vincent et al., 1986). Mesmo que o espermatozóide não seja necessário para induzir esses movimentos no citoplasma do ovo, ele é importante na determinação da direção dessa rotação. Se um ovo artificialmente estimulado é anucleado, a rota- ção cortical ainda se dá no tempo correto. Entretanto, a direção desse movimento é imprevisível. (De fato, em ovos dispérmicos existe uma única direção de rotação.) O espermatozóide parece fornecer um sinal espacial que orienta a rotação autônoma do citoplasma, mas é a rotação citoplasmática que é essencial para o futuro desen- volvimento. Além disso, se essa rotação cortical é bloqueada, não há o desenvolvi- mento dorsal, e o embrião morre como uma massa de células ventrais (primariamente intestinais) (Vincent e Gerhart, 1987). A direção do movimento citoplasmático deter- mina qual lado será o dorsal e qual será o ventral. A direção preferencial fornecida pelo ponto de entrada do espermatozóide pode ser sobrepujada por um redirecionamento mecânico da relação espacial entre os citoplasmas cortical e subcortical. Quando se impede a rotação do ovo (por imersão em um polissacarídeo que provoca o colapso do espaço perivitelino entre o ovo e o envoltório de fertilização) ele pode sofrer uma rotação de 90o de modo que o eixo animal-vegetal fique horizontal e não vertical e o ponto de entrada do espermatozói- de voltado para cima (Gerhart et al., 1981; Kirschner e Gerhart, 1981; Cooke, 1986). Quando ovos fecundados são inclinados dessa maneira por trinta minutos, partindo da metade do primeiro ciclo de clivagem, o citoplasma gira de tal maneira que quase todos os embriões iniciam a gastrulação no mesmo lado da entrada do espermatozói- de (veja Figura 6.18). A discussão precedente sugere que deve ser possível ter dois sítios de iniciação de gastrulação se houver a combinação de rotação orientada pelo espermatozóide com uma rotação do ovo artificialmente induzida. Black e Gerhart (1985) permitiram a rotação inicial orientada pelo espermatozóide, mas em seguida imobilizaram os ovos em gelatina e os centrifugaram levemente, de modo que o citoplasma interno se mo- vesse para o ponto de entrada do espermatozóide. Quando foi permitido que os ovos centrifugados se desenvolvessem em água normal, apareceram dois sítios de gastru- lação, levando ao aparecimento de larvas gêmeas ligadas (Figura 6.19). A hipótese de Black e Gerhart (1986) é que tal produção de gêmeos é causada pela formação de duas áreas de interação: um eixo se forma onde a rotação cortical normal deu origem às interações citoplasmáticas no pólo vegetal da célula; o outro eixo se forma onde o citoplasma dirigido pela centrifugação interage com os componentes do pólo vegetal. Gêmeos também podem ser produzidos em gravidade normal, colocando o lado do ovo onde penetra o espermatozóide voltado para cima, após remover o envoltório de fertilização (Gerhart et al., 1981). A possibilidade de se obter dois lábios funcionais dos blastóporos também sugere que não há nada especial a respeito do crescente cinzento, onde se observa pela primeira vez o início da gastrulação. Na verdade, os fatores indutores da gastrulação parecem ser criados pelas interações dos citoplasmas animal e vegetal, interações essas que, provavelmente, ativam algum componente do citoplasma vegetal. Gimlich e Gerhart (1984) realizaram uma série de experimentos de transplante que confirmaram Figura 6.18Figura 6.18Figura 6.18Figura 6.18Figura 6.18 Relação entre o ponto da entrada do esper- matozóide e o lábio dorsal do blastóporo em ovos de rã normais e naqueles que sofreram rotação. Ovos de Xenopus foram fertilizados, desgeleificados e colocados em Ficoll para de- sidratar o espaço perivitelino. A entrada do espermatozóide foi marcada com corante. Os ovos sofreram rotação, foram inclinados em 900, com o ponto de entrada do espermato- zóide virado para cima, 50-80 minutos após a fertilização. (Segundo Gerhart et al., 1981.) Normal Girada Ângulo do lábio do blastóporo do ponto de entrada de espermatozóide P or ce nt ag em d e em br iõ es 226 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) a hipótese de que os fatores que iniciam a gastrulação originalmente estão no cito- plasma profundo das células vegetativas dorsais, e não no crescente cinzento. Eles demonstraram que em um embrião de Xenopus, no estágio de 64 células, os três blastômeros vegetais mais dorsais são capazes de induzir a formação do lábio dorsal do blastóporo e de um eixo dorsal completo em embriões hospedeiros irradiados com luz ultravioleta (que, de outra maneira, não seriam capazes de iniciar a gastrulação; Figura 6.20A). Além disso, esses três blastômeros, situados abaixo da região do prospectivo lábio dorsal, podem também induzir uma invaginação secundária e um eixo quando transplantados para o lado ventral de um embrião normal, no estágio de 64 células, não irradiado (Figura 6.20B). Esse pequeno grupo de blastômeros vegetais permite a invaginação de células marginais adjacentes e a formação do eixo mesodér- mico dorsal do embrião. Holowacz e Elinson (1993) observaram que o citoplasma cortical, das células vegetativas dorsais do embrião de Xenopus, no estágio de 64 células, era capaz de induzir a formação de eixos secundários quando injetado em células vegetativas ventrais. Nem o citoplasma cortical de células animais e nem o citoplasma profundo das células ventrais puderam induzir esses eixos. Parece, então, que os rearranjos internos do citoplasma, provavelmente orienta- dos pela entrada do espermatozóide, são responsáveis pela distribuição assimétrica de fatores subcelulares. Essa assimetria cria uma distinção dorsoventral no ovo que, em última instância, dirige o posicionamento do blastóporo acima de um conjunto de blastômeros vegetais e oposto ao ponto de entrada do espermatozóide. As moléculas que podem estar envolvidas na formação do sítio vegetal de iniciação da gastrulação (o “centro de Nieuwkoop”) serão discutidas no Capítulo 15. Movimentos celulares e a construção do arquênteroMovimentos celulares e a construção do arquênteroMovimentos celulares e a construção do arquênteroMovimentos celulares e a construção do arquênteroMovimentos celulares e a construção do arquêntero O INÍCIO DA GASTRULAÇÃO. A gastrulação em anfíbios é iniciada quando um grupo de células endodérmicas marginais, na superfície dorsal da blástula, penetra no interior do embrião. As superfícies externas (apicais) dessas células se contraem dra- maticamente, enquanto seus terminais internos (basais) se expandem. O comprimento apical-basal dessas células aumenta bastante, originando a forma característica de “garrafa”. Na salamandra, essas células parecemter um papel ativo nos movimentos iniciais da gastrulação. Johannes Holtfreter (1943, 1944) observou que as células gar- rafa de gástrulas precoces de salamandra poderiam aderir às lamínulas de vidro e guiar o movimento das células ligadas a elas. Até mais convincentes foram os experimentos Figura 6.19Figura 6.19Figura 6.19Figura 6.19Figura 6.19 Blastóporos gêmeos produzidos pela rotação de ovos desgeleificados de Xenopus com o lado ventral para cima (ponto de entrada do esper- matozóide), no momento da primeira cliva- gem. (A) Dois blastóporos são instruídos para formar: o original (oposto ao ponto de entrada do espermatozóide) e o novo, criado pelo des- locamento de material citoplasmático. (B) Es- ses ovos desenvolvem dois eixos completos, que formam girinos gêmeos, ligados ventral- mente. (Cortesia de J. Gerhart.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 227 Sulco no blastóporoImplante Células endodérmicas DOADOR NORMAL RECEPTOR IRRADIADO POR UV DOADOR NORMAL RECEPTOR NORMAL Ponto de entrada do espermatozóide Ponto de entrada do espermatozóide Ponto de entrada do espermatozóide UV Sem transplante Transplante Peça embrionária ventral carente de eixo corporal Novo local de gastrulação e forma de eixo corporal (A) (B) de recombinação de Holtfreter, nos quais células da zona marginal dorsal (que dariam origem ao lábio dorsal do blastóporo) foram combinadas com o tecido endodérmico interno. Quando as células da zona marginal dorsal foram removidas e colocadas no prospectivo tecido endodérmico interno, as células precursoras do blastóporo forma- ram células garrafas e se aprofundaram abaixo da superfície do endoderma interno (Figura 6.21). Mais ainda, ao se aprofundarem, criaram uma depressão reminiscente do blastóporo precoce. Sendo assim, Holtfreter sugeriu que a habilidade de invaginar com profundidade para dentro do endoderma é uma propriedade inata das células da zona marginal dorsal. Figura 6.20Figura 6.20Figura 6.20Figura 6.20Figura 6.20 Experimentos de transplante demonstrando que as células vegetativas, abaixo das regiões do futuro lábio dorsal do blastóporo, são res- ponsáveis pelo início da gastrulação. (A) Sal- vamento de embriões irradiados pelo trans- plante de blastômeros do segmento mais dor- sal (cor) de um embrião, no estágio de 64 célu- las, para uma cavidade criada pela remoção de um número semelhante de células vegetais. Um zigoto irradiado sem tal transplante não sofre gastrulação normal. (B) Formação de um novo local para gastrulação e eixo corporal pelo trans- plante das células vegetativas, mais dorsais, de um embrião de 64 células, para região vege- tal mais ventral, de outro embrião de 64 célu- las. (Segundo Gimlich e Gerhart, 1984.) Figura 6.21Figura 6.21Figura 6.21Figura 6.21Figura 6.21 Um implante de células de anfíbios da região do lábio dorsal do blastóporo submerge para dentro de uma camada de células endodérmicas e forma um sulco do blastóporo. (Segundo Holtfreter, 1944.) 228 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) Células marginais profundas Endoderma Intercalação radial de células profundas Células garrafa Células marginais superficiais Futuro mesoderma posterior Lábio dorsal do blastóporo Células- garrafa Morfologia de mudanças das células profundas O lábio se extende lateral e vegetalmenteIMZ profunda Futuro mesoderma anterior (E) (F) Ectoderma Células garrafa Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Precursores do mesoderma cefálico do endoderma da faringe Células garrafa re-espalhadas Pólo animal Blastocele Endoderma Intercalação medianolateral IMZ superficial movendo-se em direção do pólo animal Blastóporo A situação no embrião da rã é um pouco diferente. R. E. Keller e seus orientados (Keller, 1981; Hardin e Keller, 1988) mostraram que apesar das células garrafa terem um papel na iniciação da involução da zona marginal ao adquirem a forma de garrafa, elas não são essenciais para a continuação da gastrulação. A forma peculiar de garrafa dessas células é necessária para iniciar a gastrulação; é a constrição das células que puxa a zona marginal na direção vegetativa, enquanto empurra as células vegetativas para dentro (Figura 6.22 A,B). O estiramento da zona marginal permite a expansão do ectoderma em direção ao pólo vegetal e o envolvimento do embrião; empurrar as células vegetais permite a esses precursores da mesoderme anterior contatar o lado de Figure 6.22Figure 6.22Figure 6.22Figure 6.22Figure 6.22 Modelo integrativo dos movimentos celulares durante a gastrulação precoce de Xenopus. (A) Estrutura da zona marginal involutiva (IMZ) antes da gastrulação. A IMZ profunda consiste do futuro mesoderma anterior e do futuro mesoderma posterior. (B) Constrição das células garrafa arrasta o futuro mesoderma anterior para cima e gira a IMZ para fora. (C) Os precursores do mesoderma anterior conduzem o movimento do mesoderma para dentro da blastocele. (D) Ocorre intercalação radial (interdigitação) das células profundas da IMZ. O mesoderma move-se na direção ao pólo animal, arrastando as células superficiais e as células garrafa por involução. (E) À medida que continua a gastrulação, as células marginais profundas se achatam, e as células previamente superficiais formam a parede do arquêntero. (F) Intercalação como em (D), olhando da superfície dorsal para baixo em direção do lábio dorsal do blastóporo. Na NIMZ (zona marginal não involutiva) e parte superior da IMZ, células profundas (mesodérmicas) estão se intercalando radialmente, configurando uma fita estreita de células achatadas. Esse estreitamento de várias camadas em poucas outras causa extensão na direção lábio do blastóporo. Imediatamente acima do lábio, intercalação medianolateral das células produz tensões que arrastam a IMZ por cima do lábio, a interca- lação medianolateral continua, alongando e estreitando o mesoderma axial. (Segundo Hardin e Keller, 1988; Wilson e Keller, 1991.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 229 baixo dos precursores mesodérmicos posteriores e começar a migrar no teto da blasto- cele (Hardin e Keller, 1988). Entretanto, após começar esses movimentos, as células garrafa do Xenopus não são mais necessárias. Quando as células garrafa são removidas após sua formação, a involução, a formação do blastóporo e o fechamento continuam. O fator principal no movimento das células para dentro do embrião parece ser a involução das células marginais subsuperficiais mais do que as superficiais. Parece que essas células subsuperficiais ou células da zona marginal involutiva profunda se viram para dentro e migram em direção ao pólo animal, ao longo das superfícies internas das células profundas remanescentes (Figura 6.22C-E), e que a camada superficial forma o reves- timento do arquêntero unicamente porque ela está ligada às células profundas, que estão migrando ativamente. O movimento das células garrafa mais profundamente dentro do embrião depende da sua ligação às células profundas subjacentes. A remo- ção das células garrafa não afeta a involução das células profundas ou das células superficiais da zona marginal para dentro do embrião, mas a remoção das células marginais dorsais profundas e sua substituição por células do hemisfério animal (que normalmente não sofrem involução) interrompe a formação do arquêntero. A FORMAÇÃO DO MESODERMA DURANTE A GASTRULAÇÃO DE XENOPUS A Figura 6.22 (D-F) esboça o comportamento dessas células da zona marginal involutiva (IMZ) em sucessivos estágios da gastrulação em Xenopus (Keller e Schoenwolf, 1977; Keller, 1980, 1981; Hardin e Keller, 1988). Pouco antes de sua involução através do lábio do blastóporo, as várias camadas de células IMZ profun- das se intercalam radialmente paraformar uma fina e larga camada. Essa intercalação estende ainda mais a IMZ vegetalmente. Ao mesmo tempo, as células superficiais se espalham se dividindo e achatando. Quando as células profundas atingem o lábio do blastóporo, elas involuem para dentro do embrião e iniciam um segundo tipo de intercalação. Essa intercalação causa uma extensão convergente ao longo do eixo mediolateral (Figura 6.22F) que integra várias correntes mesodérmicas para formar um longa e estreita banda. A parte anterior dessa banda migra em direção ao hemis- fério animal. Assim a corrente mesodérmica continua a migrar em direção ao pólo animal e a camada superposta de células superficiais (incluindo as células garrafa) são passivamente puxadas em direção ao hemisfério animal, formando o teto do arquêntero (Figuras 6.15 e 6.22E). Portanto, ainda que as células garrafa possam ser responsáveis pela indentação inicial, a força motivadora para essa involução parece vir da camada profunda de células marginais. Mais ainda, a intercalação radial e mediolateral da camada de células profundas parece ser responsável pelo movimen- to contínuo do mesoderma para dentro do embrião. Migração do mesoderma involutivoMigração do mesoderma involutivoMigração do mesoderma involutivoMigração do mesoderma involutivoMigração do mesoderma involutivo Com o progresso dos movimentos mesodérmicos, a expansão convergente também continua a estreitar e encompridar a zona marginal involutiva. A IMZ contém o prospectivo teto endodérmico do arquêntero na sua camada superficial (IMZ S ) e as prospectivas células mesodérmicas, incluindo aquelas da notocorda na sua região profunda (IMZ D ). Durante o terço médio da gastrulação, a lâmina em expansão do mesoderma converge em direção à linha mediana do embrião. Esse processo é dirigido pela contínua intercalação mediolateral de células ao longo do eixo ântero-posterior, estreitando ainda mais a banda. No fim da gastrulação, a notocorda localizada central- mente se separa do mesoderma somítico em ambos os lados, e as células sofrem elongação separadamente (Wilson e Keller, 1991). Essa extensão convergente do mesoderma parece ser autônoma, porque os movimentos dessas células ocorrem mes- mo se essa região do embrião é isolada do resto (Keller, 1986). Durante a gastrulação, o pólo animal e as células da zona marginal não-involutiva (NIMZ) expandem-se por epibolia cobrindo todo o embrião. A porção dorsal das célu- las marginais não-involutivas expande-se mais rapidamente que a porção ventral, 230 PARTE II Padrões de Desenvolvimento (A) (B) (C) (D) (E) assim, causando o movimento dos lábios do blastóporo em direção ao lado ventral. Enquanto essas células mesodérmicas, entrando através do lábio dorsal do blastóporo, dão origem ao mesoderma dorsal axial, o resto do mesoderma do corpo (o qual forma o coração, os rins, sangue, ossos e partes de vários outros órgãos) entra através dos lábios ventral e lateral para criar o manto mesodérmico. O endoderma é derivado das células da IMZ S que formam o revestimento do teto do arquêntero e das células vegetativas sub-blastoporais que se tornam o assoalho do arquêntero (Keller, 1986). Informações adicionais Especulações& Reguladores moleculares do desenvolvimento: Fibronectinas e as vias da migração mesodérmica omo é que as células involutivas são informadas para aonde ir, uma vez que se encontram no interiorC do embrião? Na salamandra, parece que os precursores mesodérmicos involutivos migram em direção ao pólo animal em uma rede de fibronectina secretada pelas célu- las do teto da blastocele. Pouco antes da gastrulação, o ectoderma presuntivo do teto da blastocele secreta uma matriz ex- tracelular que contém fibrilas de fibronec- Figura 6.23Figura 6.23Figura 6.23Figura 6.23Figura 6.23 Fibronectinas e gastrulação de anfíbio. (A) Imunofluorescência revela uma rede fibrilar de fibronectina na superfície basal de prospectivas células ectodérmicas forrando o teto da blasto- cele do embrião da salamandra. (B-E) Micrografias ao microscópio eletrônico de varredura de gastrulação normal (B,C) e anormal (D,E) da salamandra. A blastocele em (D) e (E) foi injetada com o fragmento ligante à célula de fibronectina, enquanto a blástula gastrulando normalmente foi injetada com a solução controle. (B) Seção durante gastrulação intermediária. (C) O obtura- dor do vitelo ao fim da gastrulação. (D,E) Os estágios finais da gastrulação detida, onde os precursores mesodérmicos, tendo fixado à fibronectina sintética, não conseguem reconhecer a via de migração normal forrada de fibronectina. O arquêntero não se forma, e os precursores não- involuídos do mesoderma permanecem na superfície. (ar, arquêntero; bc, blastocele; bl, blastóporo; ec, ectoderma; en, endoderma; mes, mesoderma; yp, obturador do vitelo.) (A de Boucaut et al., 1985; B-E de Boucaut et al., 1984, cortesia de J. C. Boucaut e J.-P. Thiery.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 231 Pólo animal (A) (B) A P tina (Figura 6.23A; Boucaut et al., 1984; Nakatsuji et al., 1985). O mesoderma involutivo parece migrar nessas fibras de fibronectina. Isso foi confirmado pela sín- tese química de uma “falsa” fibronectina que pode competir com a genuína da ma- triz extracelular. Células se ligam a uma certa região da proteína fibronectina que contém uma seqüência de três aminoáci- dos (Arg-Gly-Asp; RGD). Boucaut e co- laboradores injetaram grandes quantida- des de um pequeno peptídio contendo essa seqüência na blastocele de embri- ões de salamandra, pouco antes do início da gastrulação. Se a fibronectina fosse es- sencial para a migração celular, então as células ligadas a esse fragmento solúvel de peptídio, em lugar da fibronectina real ligante de células, deveriam parar. Impos- sibilitadas de encontrar sua “estrada”, as células mesodérmicas deveriam cessar sua involução. Isso é precisamente o que ocorreu (Figura 6.23B-E). Não foram vis- tas células migratórias ao longo do lado de baixo do ectoderma. Em vez disso, os precursores mesodérmicos permaneceram fora do embrião, formando uma massa ce- lular convoluta. Outros pequenos peptí- dios sintéticos (incluindo outros fragmen- tos da molécula de fibronectina) não im- pediram a migração. Considera-se que as células mesodér- micas aderem à fibronectina através da αvβ1 proteína integrina (Alfandari et al., 1995). A migração mesodérmica pode ser também interrompida pela microinjeção de anticorpos contra fibronectina ou contra a subunidade β1 de integrina que funcio- na como parte do receptor de fibronecti- na (D’Arribère et al., 1988, 1990). Alfandari e colegas (1995) mostraram que logo após a fecundação, a subunidade α v da integri- na é progressivamente perdida das mem- branas das células do blastômero. Entre- tanto, pouco antes e durante a gastrula- ção, a subunidade α v é expressa na su- perfície das células mesodérmicas migra- tórias. Parece então, que a síntese desse receptor de fibronectina pode sinalizar o tempo para o mesoderma começar e con- tinuar a migração. A matriz extracelular contendo fibro- nectina, permite a ligação das células mesodérmicas à rede de fibronectina e, além disso, parece fornecer sinais para a direção da migração celular. Shi e cole- gas (1989) removeram os tetos da blasto- cele de gástrulas precoces de salamandra e os depositaram em recipientes de plásti- co com suas matrizes extracelulares tocan- do o plástico (Figura 6.24A). O eixo do blastóporo ao pólo animal foi marcado e, após 2 horas, o explante foi removido, dei- xando sua matriz extracelular. Um explante menor da zona marginal dorsal foi removi- do de outra gástrula precoce e colocado sobre a matriz com seu próprio eixo blastóporo-pólo animal, perpendicular àquele da matriz. Seria possível às células desse explante migrarem na matriz, e se migrassemo fariam em uma direção parti- cular? Foi verificado que as células mi- graram, e que a migração podia ser inibida por anticorpos que impedem que a célula reconheça a fibronectina. Além disso, as células das DMZ não migraram ao acaso, mas migraram em direção ao pólo animal da matriz extracelular que havia sido ab- sorvida no plástico (Figura 6.24B). Em Xenopus, a extensão convergente empurra as células migratórias para cima, em direção ao pólo animal. Entretanto, a fibronectina parece delinear os limites dentro dos quais esses movimentos po- dem ocorrer. A fibronectina das gástrulas de Xenopus não forma grades complexas, mas se organiza em pequenos aglomera- dos fibrilares. Se a fibronectina for sinte- tizada mas não organizada nessas fibrilas, as células mesodérmicas dorsais vão ade- rir à superfície basal do ectoderma presuntivo, mas não migrarão (Winklbau- er e Nagel, 1991). As fibrilas de fibronecti- na são necessárias para que as células mesodérmicas da cabeça se achatem e es- tendam largos processos (lameliformes) na direção da migração (Winklbauer et al., 1991; Winklbauer e Keller, 1996). A impor- tância dessas fibrilas de fibronectina é também vista em híbridos interespecíficos que se detém na gastrulação. Delarue e colegas (1985) mostraram que certos hí- bridos inviáveis, entre duas espécies de sapos, morrem durante a gastrulação por- que não secretam essas fibrilas de fibro- nectina. Parece então, que a matriz extra- celular do teto da blastocele, e particular- mente seu componente fibronectina, é im- portante na migração das células mesodér- micas durante a gastrulação em anfíbios. Figura 6.24Figura 6.24Figura 6.24Figura 6.24Figura 6.24 A direção da migração das células da zona mar- ginal dorsal (DMZ) depende da orientação da matriz extracelular do teto da blastocele. (A) Explantes do teto da blastocele do blastóforo (BP) para o pólo animal (AP) foram disseca- dos de embriões de salamandra em estágio pre- coce de gastrulação e colocados em placas plás- ticas. A matriz extracelular aderiu à placa, e o tecido foi então removido. Um explante me- nor de uma gástrula precoce, contendo células da DMZ, foi então colocado sobre essa ma- triz, com o seu próprio eixo perpendicular aquele da matriz. (B) Células da DMZ do explante migraram para o pólo animal da ma- triz. A linha pontilhada indica a borda original do explante, e a flecha branca representa seu eixo blastóporo-pólo animal. (de Shi et al., 1989, fotografia cortesia dos autores.) 232 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Estágio Epibolia do ectodermaEpibolia do ectodermaEpibolia do ectodermaEpibolia do ectodermaEpibolia do ectoderma Enquanto a involução está ocorrendo no lábios do blastóporo, os precursores ectodérmicos estão se expandindo sobre todo o embrião. Keller (1980) e Keller e Schoenwolf (1977) usaram microscopia eletrônica de varredura para observar as mo- dificações tanto nas células superficiais como nas células profundas das regiões animal e marginal. O mecanismo principal de epibolia na gastrulação do Xenopus parece ser um aumento no número de células (através de divisão), acoplado a uma concomitante integração de várias camadas profundas em uma só (Figura 6.25). Du- rante a gastrulação precoce, três rodadas de divisão celular aumentam o número de camadas de células profundas no hemisfério animal. Ao mesmo tempo, completa integração de numerosas células profundas em uma camada também ocorre. A camada mais superficial se expande por divisão e achatamento celular. O espalhamento de células nas zonas marginais dorsal e ventral, se dá provavelmente pelo mesmo meca- nismo, ainda que mudanças na forma celular parecem ter um papel mais importante do que no hemisfério animal. O resultado dessas expansões é a epibolia das células superficiais e profundas do pólo animal e regiões marginais não involutivas sobre a superfície do embrião (Keller e Danilchik, 1988). A maior parte das células da região marginal, como mencionado anteriormente, involuem para se juntar à corrente de célu- las mesodérmicas dentro do embrião. Gastrulação no Xenopus é uma orquestração de vários eventos distintos. A primei- ra indicação de gastrulação envolve a invaginação local das células garrafa do endoderma na zona marginal, em tempo e lugar precisamente definidos. Em seguida, a involução das células marginais através do lábio do blastóporo, começa a formação do arquêntero. Essas células involutivas, na margem anterior do manto mesodérmico, migram ao longo da superfície interna do teto do blastóporo, e o prospectivo cordo- mesoderma atrás delas, se estreita e se alonga posteriormente, por extensão conver- gente, na porção dorsal do embrião. Ao mesmo tempo, as células precursoras ectodér- micas epibolizam vegetalmente por divisão celular e pela integração de camadas celu- lares previamente independentes. O resultado desses movimentos celulares é o posi- cionamento adequado das três camadas germinativas em preparação para sua diferen- ciação em órgãos do corpo. Estudos moleculares (a serem discutidos no Capítulo 15) estão começando a nos dar pistas relacionadas a mecanismos pelos quais as células são informadas de como começar e finalizar essas migrações Figura 6.25Figura 6.25Figura 6.25Figura 6.25Figura 6.25 Micrografias eletrônicas de varredura do teto da blastocele de Xenopus, mostrando as mudanças na forma e arranjo das células. Os estágios 8 e 9 são de blástula; estágios 10-11.5 representam gástrulas progressivamente mais avançadas. (de Keller, 1980, cortesias de R. E. Keller.) CAPÍTULO 6 Gastrulação: Reorganizando as células embrionárias 233 Blastoderma Anterior Epiblasto Zona marginal posterior Área opaca Espaço subgerminativo Vitelo Área pelúcida Células do hipoblasto delaminando-se do epiblasto Área opaca Área opaca Epiblasto Blastocele Células do hipoblasto migrando de células profundas da região posterior Gastrulação em aves Generalidades sobre gastrulação em avesGeneralidades sobre gastrulação em avesGeneralidades sobre gastrulação em avesGeneralidades sobre gastrulação em avesGeneralidades sobre gastrulação em aves A clivagem em embrião de aves cria um blastodisco acima de um enorme volume de vitelo. Essa massa subjacente e inerte de vitelo impõe várias restrições aos movimen- tos celulares, e a gastrulação em aves parece, à primeira vista, ser muito diferente daquela do ouriço-do-mar ou da rã. Realmente, logo veremos que existem numerosas similaridades entre a gastrulação em aves e as gastrulações que já estudamos. Além disso, veremos que embriões de mamíferos - que não tem vitelo- retém movimentos de gastrulação muito parecidos com aqueles dos embriões de aves e répteis. FORMAÇÃO DO HIPOBLASTO E EPIBLASTO. As células centrais do blastodisco das aves são separadas do vitelo por uma cavidade subgerminativa e parecem mais claras - por isso, o centro do blastodisco é chamado de área pelúcida. Em contraste, as células da margem da área pelúcida parecem opacas, devido a seu contato com o vitelo, formam a área opaca (Figura 6.26). Enquanto a maioria das células permanece na superfície formando o epiblasto, certas células migram individualmente para a cavida- de subgerminativa, para formar as ilhas de polinvaginação (hipoblasto primário), um arquipélago de aglomerados desconectados contendo cada um de 5 a 20 células (veja Figuras 6.26 e 5.33). Pouco tempo depois, uma lâmina de células da margem posterior do blastoderma (crescente de Koller e a zona marginal atrás dele) migra em direção anterior para se juntar às ilhas de polinvaginação e formar o hipoblasto secundário (Eyal-Giladi et al.,1992). O blastoderma de duas camadas (epiblasto e hipoblasto) tem as camadas unidas na margem da área opaca, e o espaço entre as camadas é uma blastocele. Assim, a estrutura do blastodisco das aves não é diferente da blástula de anfíbios ou equinodermos. Figura 6.26Figura
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