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CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 341 N 341 Início do desenvolvimento vertebrado: Mesoderma e endoderma 9 Da fisiologia de alto a baixo, eu canto, Nem fisionomia somente nem cérebro somen- te são dignos da Musa, Eu digo a forma completa é de longe mais valorosa, A Fêmea igualmente com o Macho eu canto. WALT WHITMAN (1867) Teorias vêm e teorias vão. A rã permanece. JEAN ROSTAND (1960) OS CAPÍTULOS 7 e 8 acompanhamos os vários tecidos formados pelo ecto- derma em desenvolvimento. Neste capítulo acompanharemos o desenvolvi- mento precoce das camadas germinativas mesodérmica e endodérmica. Ve- remos que o endoderma forma o revestimento dos tubos digestivo e respiratório, com seus órgãos associados; o mesoderma será observado gerando todos os órgãos entre a parede ectodérmica e os tecidos endodérmicos. Q��MESODERMA O mesoderma de um embrião em estágio de nêurula pode ser dividido em cinco regiões (Figura 9.1). A primeira região é o cordomesoderma. Esse tecido forma a notocorda, um órgão transitório cuja principal função inclui a indução da formação do tubo neural e estabelece o eixo corporal ântero-posterior. Como observamos no Capítulo 6, o cordomesoderma se forma no centro do embrião no futuro lado dorsal. A segunda região é o mesoderma dorsal somítico. O termo dorsal se refere à observação de que os tecidos em desenvolvimento originários dessa região estarão na parte de trás do embrião, ao longo da espinha. As células nessa região formam somitos, blocos de células mesodérmicas em ambos os lados do tubo neural que irão produzir muitos dos tecidos conjuntivos das costas (osso, músculo, cartilagem e derme). O mesoderma intermediário forma o sistema urinário e os dutos genitais; discutiremos essa região em detalhe em capítulos posteriores. Mais distante da notocorda, o mesoderma da placa lateral dá origem ao coração, vasos sangüíneos e células sangüíneas do siste- ma circulatório, como também ao revestimento da cavidade do corpo e de todos os componentes mesodérmicos dos membros exceto os músculos. Ele também irá formar uma série de membranas extra-embrionárias que são importantes para o transporte de nutrientes para o embrião. Por último, o mesênquima da cabeça irá contribuir para os tecidos conjuntivos e a musculatura da face. Mesoderma dorsal: A notocorda e a diferenciação dos somitos Mesoderma ParaxialMesoderma ParaxialMesoderma ParaxialMesoderma ParaxialMesoderma Paraxial Uma das principais tarefas da gastrulação é criar uma camada mesodérmica entre o endoderma e o ectoderma. Como mostra a Figura 9.2, a formação de órgãos mesodérmicos 342 PARTE II Padrões de Desenvolvimento Zigoto Gametas Células germinativas primordiais Clivagem Glândulas sudoríparas* Ectoderma embr. ext. do âmnio e cório Gastrulação Bexiga urinária Unhas Alantóide* Fígado Pâncreas* Glândulas mamárias* CabeloENDODERMA Traquéia* brônquios* Pulmões INTESTINO PRIMITIVO ECTODERMA EPITÉLIO EXTERNO DO CORPO Tubo digestivo* NOTOCORDA (CORDOME- SODERMA) Cristalino do olho Glândulas sebáceas* Tireóide FARINGE MESODERMA Vesícula auditiva* Epitélio estomodeal Bolsas faríngeas* Mecanismo do ouvido interno Ouvido médio* tubo de eustáquio Recessos tonsilares* MESODERMA PARAXIAL DORSAL Epitélio nasal e olfativo e nervo olfativo Esmalte dentário Lóbulo anterior da hipófise Epitélio oral Timo primitivo*, paratireóides* Paratireóides* Epitélio proctodealCorpos pós-branquiais* Pars neuralis da hipófiseEsqueleto axial Esclerótomos Raízes dos nervos motores espinhais Medula espinhal Canal anal*Esqueleto apendicular Brotos dos apêndices Miótomos TUBO NEURAL Músculos dos apêndices Músculos esqueléticos do tronco Retina* e nervo óptico Cérebro Vesículas ópticas Camadas de tecido conjuntivo da pele Dermátomos CRISTA NEURAL Nervos motores cranianos Epidídimo vasos deferentes Nervos e gânglios cranianos sensoriais Divertículo metanéfrico, ureteres pelve renal, túbulos coletores Dutos mesonéfricos Gânglios da raiz dorsal espinhal Medula da supra-renal Raízes dos nervos sensoriais espinhais MESODERMA INTERMEDIÁRIO Mesonefro, dutos eferentes Dentina dentária Pronefro Gânglios simpáticosCrânio e cartilagens branquiais Metanefro, túbulos renais* Dutos mulerianos Vagina* Ovidutos* Útero* MESODERMA LATERAL MESÊNQUIMA DA CABEÇA Camadas externas da cabeçaMes. embr. ext. do âmnio e cório Tecido conectivo cefálico Mês.emb. ext. do saco vitelínico e alantóideMesoderma somático Músculos Pleura, pericárdio, peritônio Mesoderma esplâncnico Córtex da supra-renal Mesentérios Peritônio visceral Estroma das gônadas Mesênquima Epimiocárdio epicárdio miocárdio Coração Pleura visceral Tecido hemangioblástico Tecido conjuntivo e músculo liso das vísceras e vasos sangüíneos Corpúsculos sangüíneos Endotélio dos vasos sangüíneos Endocárdio * O esquema indica somente a origem da parte epitelial do órgão. Todos esses órgãos têm investimentos de sustenta- ção secundária de origem mesodérmica. CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 343 e ectodérmicos não é subseqüente à formação do tubo neural, mas ocorre sincronica- mente. A formação da notocorda foi discutida no Capítulo 6. Essa haste epitelial se estende desde a base da cabeça até a cauda. Em cada lado da notocorda existem faixas grossas de células mesodérmicas. Essas faixas de mesoderma paraxial são referidas como as placas segmentares (nas aves) e mesoderma não segmentado (nos mamífe- ros). Com a regressão dos sulcos primitivos, as dobras neurais começam a se aglome- rar no centro do embrião, o mesoderma paraxial se separa em blocos de células chama- das somitos. Embora os somitos sejam estruturas transitórias, elas são muito impor- tantes na organização do padrão segmentar de embriões de vertebrados. Como vimos no capítulo anterior, os somitos determinam os caminhos da migração das células da crista neural e axônios do nervo espinhal. Os somitos geram células que formam (1) as vértebras e costelas, (2) a derme e a pele dorsal, (3) os músculos esqueléticos das costas e (4) os músculos esqueléticos da parede do corpo e membros. Somitômeros e a Iniciação da Formação do SomitoSomitômeros e a Iniciação da Formação do SomitoSomitômeros e a Iniciação da Formação do SomitoSomitômeros e a Iniciação da Formação do SomitoSomitômeros e a Iniciação da Formação do Somito Os primeiros somitos aparecem na parte anterior do embrião, e os novos somitos “brotam” da extremidade rostral do mesoderma paraxial em intervalos regulares (Figu- ras 9.2C,D e 9.3). Devido aos embriões poderem se desenvolver em taxas um pouco diferentes (da mesma maneira que acontece com embriões de galinha quando são incubados em temperaturas um pouco diferentes), o número de somitos presentes Figura 9.1Figura 9.1Figura 9.1Figura 9.1Figura 9.1 O esquema ilustra a linhagem das partes especializadas do corpo, derivadas das três camadas germinativas embrionárias. As células germinativas estão representadas como uma linhagem de células separada das três camadas germinativas somáticas pois, apesar dos precursores das células germinativas se localizarem no endoderma ou mesoderrma presuntivos, elas são pro- vavelmente um único tipo celular. (Segundo Carlson, 1981.) ¶ (A) (B) (C) (D) Figura 9.2Figura 9.2Figura 9.2Figura 9.2Figura 9.2 O desenvolvimento progressivo do embrião do pinto, enfocando o componente mesodér- mico. (A) Região do sulco primitivo mostran- do precursores migratórios mesodérmicos e endodérmicos. (B) Formação da notocorda e do mesoderma paraxial. (C,D) Diferenciação dos somitos, celoma e das duas aortas (as quais finalmente irão se fundir). A-C, embrião de 24 horas; D, embrião de 48 horas. Endoderma Células mesodérmicas migratóriasSulco primitivo Epiblasto Mesoderma Esplâncnico Epiderme Placa neural Endoderma Mesoderma paraxial Notocorda Mesoderma lateral Epiderme Tubo neural Mesoderma somático Mesoderma intermediário Somito Celoma Esclerótomo do somito Dermátomo do somito Notocorda Celoma intra-embrionário Celoma extra-embrionário Aortas dorsais Miótomo do somito 344 PARTE II Padrões de Desenvolvimento geralmente é o melhor indicador para definir o progresso do desenvolvimento. A quantidade final de somitos formados é uma característica de cada espécie. O mecanismo para a formação do somito não foi ainda bem estabelecido, mas diversos estudos em pintos mostraram que as células da placa segmentar estão orga- nizadas em espirais de células chamadas somitômeros (Meier, 1979; Packard e Meier, 1983). A conversão de somitômero para somito é observada quando as células mais anteriores do somitômero se tornam compactas. Essa transição de um somitômero frouxamente compactado para um somito epitelial está correlacionada com a síntese de duas proteínas da matriz extracelular, fibronectina e N-caderina (Figura 9.4A; Ostrosky et al., 1984; Lash e Yamada, 1986; Hatta et al., 1987). Essas proteínas, por sua vez, podem ser reguladas pela expressão de Notch1 e Paraxis. O gene Notch1 codifi- ca o fator transcrição que está ativo na região mais anterior do mesoderma dorsal não segmentado, e camundongos com falta desse fator desenvolvem somitos desalinha- dos de vários tamanhos (Figura 9.4B,C; Conlon et al., 1995). Paraxis, um gene codifi- cando um outro fator de transcrição, é expressado na extremidade rostral (anterior) do mesoderma não segmentado de embriões de camundongos e pintos. A injeção de oligonucleotídeos antisenso complementares ao Paraxis produz defeitos de segmentação somítica (Burgess et al., 1995; Barnes et al., 1997). Células de somitos normais recém-formados são organizadas aleatoriamente, mas logo se tornam organi- zadas em uma bola de células epiteliais colunares que circundam uma pequena cavida- de repleta de células frouxamente conectadas. As células epiteliais se fixam umas às outras através de junções apertadas. A Paraxis é uma parte essencial dessa conversão de mesênquima em epitélio (Burgess et al.,1996). Geração de Tipos de Células SomíticasGeração de Tipos de Células SomíticasGeração de Tipos de Células SomíticasGeração de Tipos de Células SomíticasGeração de Tipos de Células Somíticas Quando o somito é primeiro formado, qualquer uma de suas células pode se tornar qualquer das estruturas derivadas de somitos. No entanto, com a maturação do somito, as várias regiões do somito se tornam comprometidas em formar somente certos tipos de células. A células mediano-ventrais do somito (aquelas células loca- lizadas o mais distante das costas, mas próximas ao tubo neural) sofrem mitose, perdem sua característica epitelial redonda, se tornando células mesenquimatosas Figura 9.3Figura 9.3Figura 9.3Figura 9.3Figura 9.3 Tubo neural e somitos. Micrografia ao micros- cópio eletrônico de varredura, mostrando somitos bem-formados e mesoderma paraxial (embaixo à direita) que ainda não se separou em somitos distintos. Um arredondamento do mesoderma paraxial em um somitômero pode ser visto na parte inferior esquerda, e as células da crista neural podem ser vistas em migração ventral, a partir do teto do tubo neural. (Corte- sia de K. W. Tosney.) Figura 9.4Figura 9.4Figura 9.4Figura 9.4Figura 9.4 Transição de um somitômero para um somito. (A) A expres- são da N-caderina se correlaciona com a conversão de células mesenquimatosas soltas em um somito epitelial. (B) Nos em- briões de tipo selvagem, expressão de Notch1 é vista na re- gião mais anterior do mesoderma paraxial não segmentado (i.e., a porção que está sendo organizada em um somito). (C) Em embriões deficientes em Notch1, a organização dos somitos é perturbada. (A de Hatta et al., 1987; cortesia de M. Takeichi; B e C segundo Conlon et al., 1995.) PosteriorAnterior (A) (B) Notch1 presente Somitos Mesoderma paraxial (pré-somítico) Concentração de proteína Notch ( C ) Notch1 ausente Somitos Transição Mesoderma paraxial CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 345 novamente. A porção do somito que dá origem a essas células é chamada de escleró- tomo, e essas células mesenquimatosas no final se tornam condrócitos vertebrais (Figuras 9.2 e 9.5). Os condrócitos são responsáveis pela secreção de um tipo especial de colágeno e GAGs (tais como o sulfato de condroitina) característicos da cartilagem. Esses condrócitos em particular serão responsáveis pela construção do esqueleto axial (vértebras, costelas, cartilagem e ligamentos). As células da porção lateral do somito (a região mais distante do tubo neural) também se dispersam. Essas células formam os precursores dos músculos, dos membros e da parede do corpo. Ordahl e Le Douarin (1992) seguiram essas células transplantando porções de somitos de codorna em somitos de embriões de galinha. As células dos pintos e das codornas podem ser distinguidas pela sua morfologia nucleolar. Os pesquisadores notaram que aquelas células que estavam mais distantes do tubo neural migram para formar a parede do corpo e a musculatura dos membros, mesmo se essas células doadoras forem original- mente da porção medial do somito. Uma vez que o esclerótomo e os precursores das células musculares dos mem- bros e da parede do corpo migraram para longe dos somitos, as células somíticas próximas ao tubo neural migram ventralmente em direção à porção epitelial remanes- cente do somito para formar uma sólida camada epitelial dupla chamada dermamiótomo (veja Figuras 9.2 e 9.5 ). A camada dorsal dessa estrutura é chamada de dermátomo, sendo a responsável pela geração do tecido conectivo mesenquimatoso da pele dorsal: a derme. (A derme de outras áreas do corpo se forma de outras células mesenquimatosas e não de somitos.) A camada interna de células é chamada de miótomo, e essas células dão origem aos músculos vertebrais que Figura 9.5Figura 9.5Figura 9.5Figura 9.5Figura 9.5 Diagrama de uma seção transversal através do tronco de (A) um embrião humano preco- ce de 4 semanas e (B) um embrião tardio de 4 semanas, mostrando a formação das estrutu- ras do somito. (A) As células do esclerótomo começam a migrar afastando-se do dermáto- mo e miótomo. (B) Ao fim da quarta semana, as células do esclerótomo estão se conden- sando para formar vértebras cartilaginosas, o dermátomo começa a formar a derme, e as células do miótomo estendem-se ventralmen- te ao longo das paredes do embrião. (C-E) A estrutura do somito do pinto em mudança enquanto ocorrema migrações celulares. (A e B segundo Langman, 1981; C-E segundo Ordahl, 1993). (A) (B) Esclerótomo Células do esclerótomo em migração Dermátomo Condensação de condrócitos das células do esclerótomo Miótomo Aorta dorsal Nefrótomo do rim em desenvolvimento Intestino Celoma intra-embrionário Camada mesodérmica somática Camada mesodérmica somática Camada mesodérmica esplâncnica ( C ) (D) (E) Tubo neural Dermamiótomo Dermátomo Células migratórias (Musculatura dos membros e ventrolateral) Notocorda Medial Lateral Esclerótomo Miótomo 346 PARTE II Padrões de Desenvolvimento circundam as vértebras permitindo que as costas se curvem (Chevallier et al., 1977; Christ et al., 1977). Dessa maneira, os somitos são essenciais para a formação das costas de nosso corpo: as vértebras que circundam a espinha dorsal, os músculos e o tecido conectivo que seguram as junções vertebrais, a subcamada dérmica da pele das costas, e a musculatura das costas. E o que acontece com a notocorda, aquela estrutura mesodérmica central? Após ter fornecido a integridade axial do embrião precoce, e induzido a formação do tubo neural dorsal, a maior parte degenera. Em qualquer lugar onde as célulasdo esclerótomo formaram o corpo vertebral, as célu- las da notocorda morrem. No entanto, entre as vértebras, as células da notocorda formam o tecido dos discos intervertebrais, chamados núcleos pulposos. Esses são os discos que se “deslocam” em certos tipos de lesões nas costas. A especificação do somito é completada pela interação de diversos tecidos que formam o seu ambiente. A porção mediana-ventral do somito é induzida a se tornar esclerótomo por fatores, especialmente pela proteína Sonic hedgehog, secretada pela notocorda e pela placa do assoalho do tubo neural (Fan e Tessier-Lavigne, 1994; Johnson et al., 1994). Se porções da notocorda (ou outra fonte de Sonic hedgehog) forem transplantadas próximas a outras regiões do somito, essas regi- ões, também, se tornarão células do esclerótomo. Essas células expressam um novo fator de transcrição, Pax1, que ativa genes específicos da cartilagem e cuja presença é necessária para a formação das vértebras (Figura 9.6; Smith e Tuan, 1996). Elas também expressam I-mf, um inibidor da família de fatores de transcrição MyoD que dá início à formação muscular (Chen et al., 1996). Por caminhos similares, o miótomo é induzido por dois sinais distintos. As células musculares epaxiais (que circundam o eixo do corpo) vêm da porção medial do somito e são induzidas por fatores do tubo neural dorsal, provavelmente membros da família Wnt (Münsterberg et al., 1995; Stern et al., 1995). Os músculos hipaxiais (que são formados pela porção medial do somito e formam a musculatura dos membros e parede do corpo) são provavelmente induzidos através da combinação de proteínas Wnt procedentes da epiderme e da proteína-4 morfogenética do osso, (BMP4) da placa lateral do mesoderma (Cossu et al., 1996a; Pourquié et al., 1996). Esses fatores levam as células do miótomo a expres- sarem fatores de transcrição particulares (MyoD e Myf5) que ativam os genes espe- cíficos do músculo. O dermátomo se diferencia em resposta a outro fator secretado pelo tubo neural, neurotrofina 3 (NT-3). Anticorpos que bloqueiam as atividades da Figura 9.6Figura 9.6Figura 9.6Figura 9.6Figura 9.6 Modelo das principais interações postuladas para a modelagem do somito. (A) Sonic hed- gehog da notocorda e placa do assoalho induz formação do esclerótomo; Wnt do tubo neural induz a região do miótomo que forma muscu- latura apaxial, e a combinação da proteína Wnt da epiderme e BMP4 (e talvez FGF5) do me- soderma da placa lateral induz a porção do miótomo que dá origem aos músculos da pare- de corporal. Neurotrofina 3 do tubo neural pode causar a diferenciação das células do derma- miótomo. (B) diferentes fatores de transcrição nas diferentes regiões do somito anunciam o destino celular. As células do esclerótomo ex- pressam Pax1, enquanto as células medianas do dermamiótomo expressam a proteína miogênica Myf5. As células laterais do derma- miótomo expressam o fator de transcrição miogênico o MyoD assim como o receptor c- met para o fator de espalhamento. A porção central do dermamiótomo torna-se a derme e expressa Pax3. (Segundo Cossu et al., 1996b.) Pax1 (A) Ectoderma dorsal Ectoderma dorsalMusculatura apaxial Derme Medial Dermamiótomo Músculos da parede corporalNT-3 Derme Wnt Células musculares apaxiais ?Wnt Lateral Tubo neural Myf5 BMP4 ?FGF5 Tubo neural Shh Aorta dorsal Esclerótomo Notocorda Mesoderma lateral Notocorda Mesoderma lateral Músculos dos membros Myf5 c-met, MyoD Pax3 CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 347 NT-3 previnem a conversão do dermátomo epitelial em mesênquima dérmico solto que migra por baixo da epiderme (Brill et al., 1995). Além desses sinais positivos, existem pelo menos dois outros conjuntos de proteínas necessárias para a padroni- zação do somito em suas regiões particulares. Um desses fatores previne a ativação de um grupo de células pelas proteínas inapropriadas. Por exemplo, o sinal BMP4 do mesoderma da placa lateral é neutralizado por um fator do tubo neural que previne níveis reduzidos de BMP4 de agir em mais células mediais. O outro conjunto de proteínas é necessário para a manutenção do padrão da expressão do gene iniciada pelo sinal original (Pownall et al., 1996). [mesend1.html] Miogênese: Diferenciação do Músculo EsqueléticoMiogênese: Diferenciação do Músculo EsqueléticoMiogênese: Diferenciação do Músculo EsqueléticoMiogênese: Diferenciação do Músculo EsqueléticoMiogênese: Diferenciação do Músculo Esquelético A célula do músculo esquelético é extremamente grande, célula alongada que con- tém muitos núcleos. Em meados da década de 1960, biologistas do desenvolvimento debateram se cada um dessas células (freqüentemente chamadas de miotubos) era derivada de uma fusão de diversas células precursoras musculares mononucleadas (mioblastos) ou de um único mioblasto que sofre divisão nuclear sem citocinese. Evidência da fusão de mioblastos esqueléticos para a formação de miotubos multinucleados vem de duas fontes independentes. A evidência crucial para a fusão do mioblasto esquelético veio de camundongos quiméricos. Esses camundongos podem ser formados pela fusão de dois embriões precoces, que se ajustam para produzir um único camundongo contendo duas populações de células distintas (veja Figura 5.28). Mintz e Baker (1967) fundiram embriões de camundongos que produziam diferentes tipos da enzima isocitrato desidrogenase. Essa enzima, encon- trada em todas as células, é composta de duas subunidades idênticas. Dessa manei- ra, se miotubos são formados de uma célula cujo núcleo se divide sem citocinese, esperava-se encontrar duas formas distintas de enzimas, isto é, as duas formas parentais no camundongo alofênico (Figura 9.7). Mas se os miotubos são formados pela fusão entre as células, a expectativa seria de se encontrar células musculares expressando não somente os dois tipos parentais de enzimas (AA e BB), mas tam- bém uma terceira classe composta de uma subunidade procedente de cada tipo parental (AB). As formas diferentes de isocitrato desidrogenase podem ser separa- das e identificadas pela sua mobilidade eletroforética. Os resultados demonstraram claramente que apesar dos dois tipos parentais estarem presentes em todos os outros tecidos do camundongo alofênico, a enzima híbrida (AB) estava presente em extratos de tecido muscular esquelético. Dessa maneira, os miotubos devem ter se formado pela fusão de inúmeros mioblastos. Essa evidência foi importante para mostrar que a fusão do mioblasto realmente ocorreu dentro do embrião. A análise de como essa fusão acontece foi baseada em eventos de fusão ocorridos em cultura. Konigsberg (1963) descobriu que mioblastos isolados de embriões de pinto proliferariam em placas de Petri revestidas com colá- geno. Após aproximadamente dois dias, no entanto, esses mioblastos pararam de se dividir e começaram a se fundir com seus vizinhos para produzir extensos miotubos sintetizantes de proteínas específicas do músculo. A síntese de DNA e a divisão nuclear não foram encontradas em miotubos multinucleados. Esse processo de fu- são é uma complexa orquestração de eventos bioquímicos na superfície da célula mioblasto. A primeira etapa parece ser a retirada das células do ciclo da primeira divisão. Enquanto existir fatores de crescimento no meio (particularmente fatores de crescimento do fibroblasto), o mioblasto vai proliferar sem se diferenciar. Quando esses fatores são exauridos, o mioblasto cessa de se dividir, secreta fibronectina para sua matriz extracelular, fixando-se a essa através da sua integrina α5β1 , o principal receptor de fibronectina (Menko e Boettiger, 1987; Boettiger et al., 1995). Se essa adesão é bloqueada, não resulta desenvolvimento muscular adicional al- gum, e parece que o sinal da ligação integrina-fibronectina é decisivo para iniciar a diferenciação do mioblasto em célula muscular (Figura 9.8). A segunda etapa é o 348 PARTE II Padrõesde Desenvolvimento alinhamento dos mioblastos em cadeias. Essa etapa é mediada por glicoproteínas das membranas celulares, incluindo diversas caderinas e CAMs (Knudsen,1985: Knudsen et al., 1990). O reconhecimento e alinhamento entre células acontece somente se as duas células forem mioblastos. A fusão pode acontecer mesmo entre os mioblastos de rato e galinha (Yaffe e Feldman,1965); as identidades das espécies não são cruciais em cultura. A terceira etapa consiste no próprio evento da fusão celular. Como na maioria das fusões de membranas, íons de cálcio são cruciais, e a fusão pode ser ativada pelos ionóforos de cálcio tais como A23187, que transporta íons de cálcio através das membranas celulares (Shainberg et al., 1969; David et al., 1981). A fusão parece ser mediada por um conjunto de metaloproteinases chamadas meltrinas. Essas pro- teínas foram descobertas durante uma pesquisa para se encontrar proteínas de mioblastos que poderiam ser homólogas à fertilina, uma proteína envolvida na fusão óvulo-espermatozóide. Yagami-Hiromasa e colegas (1995) descobriram que uma des- sas meltrinas (meltrina-α) é expressa em mioblastos aproximadamente ao mesmo tempo em que começa a fusão, e que o RNA antisenso para a mensagem meltrina-α inibiu a fusão quando adicionado aos mioblastos. Figura 9.7Figura 9.7Figura 9.7Figura 9.7Figura 9.7 Os dois mecanismos possíveis da formação do músculo esquelético, e como distinguí-los. Ca- mundongos quiméricos são produzidos da fusão de embriões de duas raças diferentes de camun- dongos, cada uma produzindo uma forma diferente da enzima isocitrato desidrogenase. Essa enzima é composta de duas subunidades; uma raça produz isocitrato desidrogenase AA (indicada em negro) e a outra produz BB (colorida). (A) Se as enzimas forem produzidas em uma única célula ou em células multinucleadas surgindo de divisões nucleares dentro de uma única célula, a enzima será puramente AA ou BB. (B) Se houver dois diferentes núcleos em uma mesma célula, porém, um poderá codificar para subunidades B enquanto o outro poderá codificar para A, com o resultado de que algumas moléculas da enzima serão híbridas (AB). Por eletroforese pode-se separar esses três tipos de moléculas. A presença de moléculas AB no músculo esquelético (mas não em outro tipos de células) confirma o modelo de fusão. (Segundo Mintz e Bakerr, 1967.) Figura 9.8Figura 9.8Figura 9.8Figura 9.8Figura 9.8 Auto-radiografia mostrando síntese de DNA em mioblastos e saída de células em fusão do ciclo celular. Fosfolipase C pode “congelar” os mioblastos após eles terem se alinhado com outros mioblastos, mas antes da fusão das membranas. Esses mioblastos cultivados fo- ram tratados com fosfolipase C e expostos à timidina radioativa. Mioblastos não fixados ainda se dividem e incorporam a timidina ra- dioativa em seu DNA. Células alinhadas (mas ainda não fundidas) (setas) não incorporam o marcador. (de Nameroff e Munar, 1976, cor- tesia de M. Nameroff.) Genótipo AA Polipeptídeo A Enzima AA Genótipo BB Polipeptídeo B Enzima BB Enzima AB (A) Modelo de divisão (B) Modelo de fusão Mioblastos Músculo Músculo Miotubos Homogenize e coloque na origem de uma placa de eletroforese Enzima híbrida formada Origem AA AB BB Enzimas de isocitrato desidrogenase vistas por eletroforese Origem AA BB CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 349 Informações adicionais Especulações& omo uma célula mesenquimatosa embrionária é instruída a formar uma célula muscular em lugar de uma célula da cartilagem, um fibroblasto ou uma célula adiposa? Quais moléculas comprometem seu destino para uma linha- gem e não para outra? Em 1986, Lassar e colaboradores tomaram DNA de células mioblastos e o transfectaram em um certo tipo de célula embrionária de camundon- go, a célula C3H10T 1 2 . Essa célula tem um aspecto semelhante ao do fibroblasto, mas parece mesênquima primitivo, pois pode se tornar célula adiposa, uma célula mus- cular ou cartilagem. Quando DNA do mús- culo foi adicionado a essas células, as célu- las C3H10T 1 2 foram transformadas em cé- lulas musculares. DNA isolado de fibro- blastos ou de outros tipos celulares não pode efetuar essa conversão. Através de clonagem de subtração (veja Capítulo 2), foi encontrado um mRNA específico do mioblasto que também podia efetuar essa mudança em um fenótipo diferenciado. O mRNA mioblasto codificava uma proteína chamada proteína 1 de determinação do mioblasto ou, mais comumente, MyoD (Davis et al., 1987). O gene MyoD somente é expresso em células das linhagens muscu- lares. Parece ser um gene “comutador-mor” pois pode converter outros tipos celulares em músculo se esse gene nelas for ativo. Essa hipótese foi testada clonando o gene MyoD em um vetor viral de modo a mantê- lo sob o controle de um promotor viral constitutivamente ativo (estava sempre “li- gado”). Quando esse gene de fusão MyoD foi transfectado em várias células, células pigmentadas, células nervosas, células adiposas, fibroblastos e células do fígado, foram convertidas em células semelhantes às musculares (Figura 9.9; Weintraub et al., 1989). Assim, MyoD parece ser suficiente para ativar os genes específicos do múscu- lo que compõem o fenótipo muscular. MyoD codifica uma proteína nuclear ligante de DNA que pode se ligar a regi- ões do DNA adjacentes aos genes especí- ficos do músculo, e ativá-los. Por exemplo, Construção Muscular e a Família MyoD de Reguladores Transcricionais a proteína MyoD parece ativar diretamente o gene da fosfoquinase da creatina espe- cífica do músculo, ligando-se ao DNA imediatamente superior aquele (Lassar et al., 1989). De maneira semelhante, há dois sítios ligantes de MyoD no DNA adja- cente à uma subunidade do gene do re- ceptor da acetilcolina do músculo da gali- nha (Piette et al., 1990). Ele também ativa a si próprio diretamente. Uma vez que o gene MyoD está ligado, seu produto protéico liga-se ao DNA imediatamente a montan- te do gene MyoD e o impede de ser desli- gado (Thayer et al., 1989). Em outros ca- sos, os efeitos de MyoD podem ser indi- retos. Nem todos os genes envolvidos na produção do fenótipo muscular podem ser ativados diretamente pela proteína MyoD. MyoD provavelmente atua indiretamente ativando outros genes reguladores, que em seguida ativam os genes estruturais específicos do músculo. MyoD não é o único gene comutador de músculo. Há uma família de proteínas semelhantes à MyoD que tem estruturas muito semelhantes e parecem ser capazes de substituir extensamente uma a outra. Essa família (algumas vezes chamada a “família MyoD” ou “proteínas miogênicas bHLH”) inclui miogenina, Myf5 e MRF4; essas pro- teínas parecem ligar-se a sítios semelhan- tes no DNA (a ser discutido no Capítulo 10). A transfecção de qualquer desses ge- nes miogênicos para um extenso espectro de células em cultura também as converte em músculo. A expressão de MyoD leva à expressão da miogenina, e a transfecção dos genes da miogenina ativa a expressão de MyoD. Assim, há um enlace de retroalimen- tação recíproca positiva que faz com que quando miogenina ou MyoD é ativado, tam- bém o é o outro gene (Thayer et al., 1989). No pinto, MyoD é ativado em células somíticas que geram a musculatura abdo- minal e dos membros, enquanto myf5 é ati- vado em células produzindo os músculos do dorso. Em ambos os casos, essa ativa- ção compromete as células somíticas à li- nhagem miogênica. Ambos grupos celula- res expressam miogenina e MRF4 para produzir seus miotubos e miofibras (Figu- ra 9.10; Lyons e Buckingham, 1992; Pownall e Emerson, 1992a,b; Braun e Arnold, 1996; Cossu et al., 1996a). Em alguns casos, esses fatores de transcrição miogênica podem compensar para a perda de um ou de outro. Usando uma técnica de alvejar genes (veja Capí- tulo 2), Rudnicki e colegas (1992) mostra- ram que Myf5 e MyoD podemrealizar as mesmas funções. Quando camundongos carecem de ambos genes MyoD, a expres- são do gene myf5 assume o controle. Os camundongos resultantes têm desenvol- C Figura 9.9Figura 9.9Figura 9.9Figura 9.9Figura 9.9 Sumário de vários experimentos em que o gene MyoD foi ativado por um promotor viral e transfectado para células não musculares. A proteína MyoD parece não levar em conta os reguladores originais do fenótipo celular, convertendo as células em músculos. Proteínas específicas do músculo (desmina, cadeias pesadas de miosina) Gene MyoD Neuroblastos, células gordurosas, fibroblastos Promotor viral ativo Núcleo Receptores específicos do músculo e moléculas de membrana Miotubo 350 PARTE II Padrões de Desenvolvimento vimento muscular normal. Quando os ca- mundongos carecem de seus genes myf5, eles também têm desenvolvimento mus- cular normal. Porém, a ausência da proteí- na Myf5 atrasa em vários dias a formação do miótomo, causando falha no desen- volvimento adequado da porção lateral do esclerótomo. Embora esses camundongos tenham músculos normais, suas caixas torácicas estão distorcidas e eles são in- capazes de respirar (Braun et al., 1992). Experimentos recentes no laboratório de Rudolf Jaenisch (Rudnicki et al., 1993) mostram que quando os genes myf5 e MyoD estão ambos ausentes do embrião, não se formam músculos e costelas.* En- quanto MyoD e Myf5 podem substituir uma a outra, não parece haver redundân- cia nas funções da miogenina. Camun- dongos homozigotos para uma mutação alvejada no gene myogenina morrem logo após o nascimento por causa dos defei- tos na formação de suas células muscula- res (Hasty et al., 1993; Nabeshima et al., 1993). Os somitos se formaram normal- mente e foram compartimentalizados em miótomo, esclerótomo e dermátomo, mas os mioblastos deixaram de se diferenciar em miofibras (Venuti et al, 1995). MyoD e seus parentes parecem ser crí- ticos para a remoção de mioblastos do ci- clo celular. Conforme já mencionado, mioblastos em divisão não se diferenciam. Essa distinção entre divisão e diferencia- ção é característica de vários tipos celula- res derivados de populações de células germinativas (Bischoff e Holtzer, 1969; Holtzer et al., 1975). Parece haver duas maneiras pelas quais o mioblasto se retira do ciclo celular. O primeiro mecanismo é inibir o caminho da divisão celular. Para isso, a proteína MyoD induz a expressão de p21, um inibidor de quinases depen- dentes de ciclina (Figura 9.11; Halevy et al., 1995). O segundo mecanismo envolve a sub-regulação de seus receptores para o fator de crescimento. Um dos principais fatores de crescimento que promove a di- visão das células mioblastos é o fator de crescimento fibroblástico básico. O FGF2 promove divisão da célula mioblasto, ao mesmo tempo que inibe a diferenciação do mioblasto suprimindo a transcrição de MyoD e myogenina (Vaidya et al., 1989; Brunetti e Goldfine, 1990). Os receptores FGF são perdidos quando o mioblasto se diferencia em uma célula muscular (Olwin e Hauschka, 1988; Moore et al., 1990). Como são ativadas as proteínas da fa- mília MyoD? Novos experimentos forne- ceram as bases para algumas fascinantes especulações. George-Weinstein e seus colegas (1996) demonstraram que quan- do epiblastos de galinha são isolados do resto da gástrula e separados em células individuais, essas células epiblastos se tornam músculo. Além disso, os pesqui- sadores acharam que o mRNA de MyoD (e talvez a proteína) está presente nessas células. Parece que células epiblastos têm a capacidade “preferencial” de ficarem comprometidas com os mioblastos, e que *Isso significa que existe alguma redundância no desenvolvimento dos músculos esqueléticos. Tal redundância já é do conhecimento dos embriologistas há longa data (Spemann, 1938), mas os geneticistas a estão redescobrindo (para sua consternação, já que confunde a interpretação de tais experimentos). Gould (1990) considera a redundância desenvolvimental essencial para evolução ocorrer, já que um dos sócios redundantes fica livre para conseguir uma nova função enquanto o outro sócio mantém a função original. Figura 9.10Figura 9.10Figura 9.10Figura 9.10Figura 9.10 Comprometimento e diferenciação muscular mediada pela família MyoD de fatores de transcrição. (A) Papéis postulados para proteínas miogênicas durante a formação do músculo esquelético no camundongo. (B) Hibridização in situ indicando a ausência do mRNA myf5 no mesoderma paraxial não segmentado do embrião. O lado esquerdo mostra fotografia sob o microscópio óptico da área. (C) Hibridização in situ mostrando a presença do mRNA myf5 no miótomo do somito embrionário do camundongo. (A segundo Rudnicki et al., 1993; fotografias cortesia de G. Lyons.) (A) Myf5 ou MyoD Miogenina MRF4 Célula no somito Mioblasto Miotubo Miofibra Mesoderma Paraxial Tubo neural Dermátomo Miótomo (B) Células do sangue Notocorda (C) CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 351 é somente suas interações com outros tipos de células que as previnem de se tornarem músculos. Nesse caso, os fato- res que promovem a miogênese (como as proteínas Wnt) podem fazê-lo através da repressão dos inibidores. Um desses ini- bidores pode ser a proteína Twist. Essa proteína é um ligante de DNA muito pare- cido com MyoD. Porém, ela parece inibir MyoD e outras proteínas ligadas aos pro- motores de seus genes-alvo específicos do músculo. O gene twist está original- mente presente em todo o somito preco- ce, mas em seguida se torna especifica- mente ausente no miótomo (Spicer et al., 1996). É possível que MyoD e outras pro- teínas bHLH miogênicas já estejam pre- sentes nas células epioblastos mas que estejam proibidas de funcionar até que a proteína twist fique sub-regulada. Essa sub-regulação pode possivelmente vir como um resultado da secreção da proteí- na Wnt (pela epiderme ou tubo neural), que poderia anular um efeito inibitório media- do por Notch1. Além das proteínas bHLH, outro fator de transcrição, MEF2A, parece ser de im- portância para o desenvolvimento muscu- lar esquelético. MEF2A também induz fibro- blastos a se tornarem músculos, e parece cooperar com MyoD nos intensificadores de genes específicos do músculo. Kaushal e colegas (1994) especulam que MEF2A for- nece especificidade adicional para a adesão do MyoD de tal forma que MyoD não ative inadvertidamente genes não musculares que possuam seqüências de regulação ca- pazes de ligar proteínas bHLH. Osteogênese: O Desenvolvimento dos OssosOsteogênese: O Desenvolvimento dos OssosOsteogênese: O Desenvolvimento dos OssosOsteogênese: O Desenvolvimento dos OssosOsteogênese: O Desenvolvimento dos Ossos Algumas das estruturas mais óbvias que derivam do mesoderma somítico são os ossos. Neste capítulo descreveremos em linhas gerais os mecanismos da formação dos ossos, e estudantes que gostariam de obter maiores detalhes podem fazê-lo ao consultar livros de histologia os quais dedicam capítulos inteiros a esse tema. Existem três linhagens que geram o esqueleto. O esclerótomo gera o esqueleto axial, o mesoderma da placa lateral gera o esqueleto dos membros, e a crista neural craniana dá origem ao arco branquial e os ossos craniofaciais e a cartilagem.* Existem dois modos principais de formação dos ossos, ou osteogênese, e ambos envolvem a transformação de um tecido mesenquimatoso préexistente no tecido ósseo. A conversão direta do tecido mesenquimatoso em osso é chamada de ossificação intramembranosa. Isso ocorre primeiramente nos ossos do crânio. Em outros casos, as células mesenquimatosas se diferenciam em cartilagem, e essa cartilagem posteriormente é reposta pelo osso. Esse processo pelo qual uma cartilagem intermediária é resposta por células ósseas é cha- mada de ossificação endocondral. OSSIFICAÇÃO INTRAMEMBRANOSA. Ossificação intramembranosa é o meio ca- racterístico peloqual são formados os ossos chatos do crânio. Células mesenquima- tosas derivadas da crista neural interagem com a matriz extracelular das células epiteliais da cabeça para formar o osso. Se as células mesenquimatosas não contatam essa matriz, não será formado osso algum (Tyler e Hall, 1977; Hall, 1988). Isso foi demons- trado in vitro por Hall e colegas (1983), que isolaram células mesenquimatosas da * O desenvolvimento da cartilagem craniofacial foi discutido no Capítulo 7 e será revisado no Capítulo 23; o desenvolvimento dos membros será detalhado no Capítulo 18. Figura 9.11Figura 9.11Figura 9.11Figura 9.11Figura 9.11 Comutação entre proliferação e diferenciação. (A) Condições favorecendo proliferação (como quando há abundância de fatores de crescimen- to de fibroblastos no meio) favorecem a conti- nuada expressão da quinase 4 dependente de ciclina. Essa quinase é capaz de reprimir a expressão de MyoD. (B) Reciprocamente, uma vez formada, o MyoD pode suprimir cdk4 através das ativação da proteína p21. Dessa maneira, as células em divisão não se diferen- ciarão e as células diferenciadas não se dividi- rão. (Segundo Halevy et al., 1995.) (A) Proliferação Diferenciação Ciclina D1 MyoD Cdk4 p21 Ativação Inibição (B) Proliferação Diferenciação Ciclina D1 MyoD Cdk4 p21 352 PARTE II Padrões de Desenvolvimento cabeça e as colocaram em placas de cultura. Se nenhuma matriz extracelular estiver presente na superfície dessas placas, as células permanecem mesenquimatosas. No entanto, se células epiteliais da cabeça tivessem secretado primeiro uma matriz extra- celular na superfície, as células se diferenciariam em células ósseas. Os mecanismos responsáveis pela conversão de células mesenquimatosas em células ósseas ainda é desconhecido, mas evidências recentes apontam para um gru- po de moléculas em particular na junção epitélio-mesênquima. Proteínas morfogenéticas do osso podem ser isoladas do osso adulto e injetadas em músculo embrionário ou tecidos conjuntivos. Quando isso é realizado, a cartilagem se desen- volve das células dentro desses tecidos e é posteriormente substituída pelas células ósseas (Syftestad and Caplan, 1984; Urist et al., 1984; veja Capítulo 17). Durante a osssificação intramembranosa, as células mesenquimatosas se prolife- ram e se condensam em nodos compactos. Algumas dessas células se desenvolvem em capilares, outras mudam sua forma para se tornar osteoblastos, células capazes de secretar a matriz óssea. A matriz colágeno-proteoglicana secretada é capaz de aglome- rar sais de cálcio, levados para essa região através dos capilares. Desse modo, a matriz se torna calcificada. Na maioria dos casos, os osteoblastos são separados da região de calcificação por uma camada de matriz pré-óssea (osteóide) secretada por eles. Ocasionalmente, esses osteoblastos ficam presos na matriz calcificada e se tornam osteócitos - células ósseas. Com a continuidade da calcificação, as espículas ósseas se irradiam para fora do centro, que é onde começou a ossificação (Figura 9.12). Ademais, a região inteira de espículas calcificadas fica rodeada por células mesenqui- matosas compactas que formam o periósteo. As células da parte interna do periósteo também se tornam osteoblastos e depositam matriz óssea em paralelo com àquela das espículas já existentes. Dessa maneira, muitas camadas de osso são formadas. OSSIFICAÇÃO ENDOCONDRAL. Ossificação endocondral envolve a formação de tecido cartilaginoso de células mesenquimatosas agregadas e a subseqüente reposi- ção desse tecido por osso (Horton, 1990). O tecido cartilaginoso é um modelo para o osso que o sucede. Os componentes esqueléticos da coluna vertebral, a pélvis, e as extremidades são primeiramente formados de cartilagem e posteriormente mudados para osso. Esse processo notável coordena a condrogênese (produção de cartilagem) com a osteogênese (crescimento do osso); os elementos esqueléticos estão simulta- neamente suportando uma carga, crescendo em largura e respondendo a estresses locais. As células que formam tecidos cartilaginosos expressam Scleraxis, um fator de transcrição ao qual é atribuída a ativação de genes específicos da cartilagem (veja Figura 9.13; Página de rosto; Cserjesi et al., 1995). Dessa maneira, a Scleraxis é expres- sa nos esclerótomos, no mesênquima facial que forma os precursores cartilaginosos Figura 9.12Figura 9.12Figura 9.12Figura 9.12Figura 9.12 Diagrama esquemático da ossificação mem- branosa. (A) Células mesenquimatosas, pro- vavelmente derivadas da crista neural, se con- densam para produzir osteoblastos, que de- positam matriz osteóide. Esses osteoblastos ficam enfileirados ao longo da região calcificada da matriz. Osteoblastos aprisiona- dos dentro da matriz óssea tornam-se osteócitos. (B) Espalhamento de espículas ósseas do local da ossificação primária nos ossos chatos do crânio de um embrião huma- no de três meses. Os ossos mostrados em negro são formados por ossificação endocon- dral. (Segundo Langman, 1981.) Osteoblastos Matriz osteóide Osso calcificado Célula óssea (osteócito) Espículas do osso parietal Espículas do osso frontal (A) Mesênquima frouxo Osteoblastos (B) CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 353 do osso e no mesênquima do membro. Essa proteína se mantém ativa até a cartilagem começar a ser substituída por tecido ósseo. [mesend2.html] A formação da cartilagem pode ser dividida em três fases: proliferação do mesênquima, condensação do mesênquima pré-cartilaginoso e diferenciação do condrócito. A condrogênese é iniciada quando as células mesenquimatosas dividi- das da pré-cartilagem começam a expressar proteínas da matriz extracelular causan- do-as a se condensarem em nódulos. A N-caderina parece ser importante na inicia- ção dessas condensações, e N-CAM também aparenta ser essencial para mantê-las nessa situação (Oberlender e Tuan, 1994; Hall e Miyake, 1995). Uma vez condensadas, as células se tornam condrócitos e começam a secretar proteoglicanos e colágenos específicos do condrócito.* Em humanos, os “ossos longos” dos brotos dos membros embrionários se formam de células mesenquimatosas que formam nódulos nessa região que irão se transfor- mar em ossos. Essas células se tornam condrócitos, e secretam a matriz extracelular da cartilagem. As células mesenquimatosas em sua volta se tornam o periósteo (Figura * Mutações que afetam a formação de nódulos freqüentemente causam anomalias nos membros. Nas galinhas, as mutações talpid são caracterizadas pela duplicação e fusão dos membros. Isso, por sua vez, descobriu-se, ter sido causado por condensações pré-condrogênicas anormalmente grandes. Esses grandes nódulos são causados pelo excesso de adesividade das células mesenquimatosas nessas condensações, e foi diretamente ligado a uma super expressão de N-CAM (Ede 1983; Chuong et al., 1993). Em humanos, o gene SOX9 é expresso por condensações pré-cartilaginosas, e isso codifica uma proteína ligante de DNA. As mutações do gene SOX9 causa displasia camptomelica, uma doença rara do desenvolvimento esquelético, causando uma série de deformidades nos ossos do corpo. A maioria dos bebês afetados morrem de parada respiratória devido a má-formação das cartilagens traqueobronquiais e das costelas. (Wright et al., 1995). (A) (B) Figura 9.13Figura 9.13Figura 9.13Figura 9.13Figura 9.13 Localização da mensagem da scleraxis nos locais de formação dos condrócitos. (A) Ex- pressão de scleraxis em somitos de um em- brião de camundongo de 12,5 dias. Essa seção foi cortada tangencialmente, e o tubo neural corre ao longo do eixo ântero-posterior. (B) Seção através de um embrião de camundongo de 11,5 dias onde transcrições de scleraxis são vistas na cartilagem condensada do nariz e face e nos precursores dos membros e costelas. (Se- gundo Cserjesi et al., 1995; fotografias corte- sia do Dr. E. Olson.) 354PARTE II Padrões de Desenvolvimento 9.14). Logo após o “modelo” cartilaginoso ser formado, as células na parte central do modelo se tornam dramaticamente maiores e começam a secretar um tipo diferente de matriz, que contém tipos diferentes de colágeno, mais fibronectina e menos inibidor de protease. Essas células são os condrócitos hipertróficos. A sua matriz é mais suscep- tível à invasão pelas células de vasos sangüíneos do periósteo. Um capilar do periósteo invade, em seguida, o centro da haste da cartilagem previamente avascular. Com a degradação da matriz da cartilagem, as células da cartilagem hipertrófica morrem, e osteoblastos (células formadoras de ossos), transportados pelos vasos sangüíneos, começam a secretar matriz óssea sobre a cartilagem parcialmente degradada (Hattori et al.,1995). Finalmente toda a cartilagem é substituída por osso. Como o centro do modelo da cartilagem é convertido em osso, é formada uma frente de ossificação entre o osso recém-sintetizado e o restante da cartilagem. O lado da cartilagem dessa frente contém a cartilagem hipertrófica que prepara a haste para a invasão pelos vasos sangüíneos, e o lado do osso contém as células osteoblásticas depositando a matriz óssea. Essa frente se espalha de dentro para fora em ambas as direções a partir do centro, enquanto mais cartilagem se transforma em osso. Se isso fosse tudo, no entanto, não existiria crescimento, e nossos ossos seriam somente do tamanho do modelo cartilaginoso original. Porém, com a frente de ossificação se apro- ximando dos finais do modelo cartilaginoso, os condrócitos próximos à frente de ossificação se proliferam antes de sofrer hipertrofia. Isso estica a parte final cartilaginosa do osso, fornecendo uma fonte para nova cartilagem. Essas regiões cartilaginosas no final dos ossos longos são chamadas placas de crescimento epifisário. Essas placas contêm três regiões: uma região de proliferação de condrócitos, uma região de condrócitos maduros, e uma região de condrócitos hipertrofiados (Figura 9.15; Chen et al.,1995). Como essa cartilagem se hipertrofia e a frente de ossificação se estende mais adiante, a cartilagem remanescente na placa epifisária se prolifera. Essa cartila- gem forma a área de crescimento do osso. Dessa maneira, o osso se mantém em crescimento pela produção de novas células cartilaginosas que sofrem hipertrofia, permitindo aos vasos sangüíneos entrarem, e morrem à medida que a matriz óssea é Figura 9.14Figura 9.14Figura 9.14Figura 9.14Figura 9.14 Diagrama esquemático da ossificação endocon- dral. (A,B) Células mesenquimatosas se con- densam em nódulos cartilaginosos que formam o modelo do osso. (C) Condrócitos no centro da haste sofrem hipertrofia e alteram sua matriz extracelular, permitindo a entrada de vasos sangüíneos. (D,E) Vasos sangüíneos trazem osteoblastos que se ligam à matriz cartilaginosa em degeneração e deposita matriz óssea. (F-H) Formação das placas de crescimento epipifisário pelos condrócitos, que se proliferam antes de hipertrofiar. Centros secundários de ossificação também se formam quando vasos sangüíneos penetram perto das extremidades do osso. (Se- gundo Horton, 1990.) Medula óssea Cartilagem epifisária Mesênquima Cartilagem Condrócitos hipertróficos Osteoblastos (osso) Vasos sangüíneos Condrócitos proliferando Placa de cresci- mento Placa de cresci- mento Osso Centro de ossificação secundária (F)(E)(D)(C)(B)(A) (G) (H) CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 355 depositada. Enquanto as placas de crescimento epifisário forem capazes de produzir condrócitos o osso continua a crescer. As placas de células de crescimento epifisário são muito sensíveis a hormônios, e sua proliferação é estimulada pelo hormônio de crescimento e fatores de crescimento semelhantes à insulina. Nilsson e colegas (1986) mostraram recentemente que hormônios de crescimento estimulam a produção do fator I de crescimento semelhan- te à insulina (IGF-I) nesses condrócitos e que esses condrócitos respondem a isso proliferando-se. Quando eles adicionaram hormônio de crescimento à placa de cresci- mento da tíbia de um camundongo jovem (que não conseguia fabricar o seu próprio hormônio de crescimento porque suas hipófises haviam sido removidas), os hormônios de crescimento estimularam a formação de IGF-I dos condrócitos na zona proliferativa (veja Figura 9.15). A combinação de hormônios de crescimento e IGF-I parece fornecer um sinal mitótico extremamente forte. Os pigmeus da floresta Ituri, no Zaire, têm níveis normais de hormônios de crescimento e IGF-I até a puberdade. No entanto, na puber- dade, os níveis de IGF-I nos pigmeus caem para aproximadamente um terço em compa- ração com os de outros adolescentes. Parece que IGF-I é essencial para uma arrancada normal no crescimento durante a puberdade (Merimee et al., 1987). Hormônios também são responsáveis pela interrupção no crescimento. No final da puberdade, níveis eleva- dos de estrógeno e testosterona fazem com que a cartilagem remanescente da placa epifisária sofra hipertrofia. Essas células cartilaginosas crescem, morrem e são substitu- ídas por ossos. Sem alguma cartilagem adicional, o crescimento desses ossos cessa. A reposição de condrócitos por osteoblastos parece depender da mineralização da matriz extracelular. Em embriões de galinha, a fonte de cálcio é o carbonato de cálcio da casca do ovo, e durante o seu desenvolvimento, o sistema circulatório da galinha transloca aproximadamente 120 mg de cálcio da casca do ovo para o esque- leto (Tuan, 1987). Quando embriões de galinha são removidos de suas cascas no terceiro dia e crescem em cultura sem a casca (em envelopes plásticos) durante o restante do seu desenvolvimento, muito do esqueleto cartilaginoso deficiente em cálcio não se desenvolve em tecido ósseo (Figura 9.16; Tuan e Lynch, 1983). Nos mamíferos, o cálcio é transferido através da placenta e depositado na matriz pelos Figura 9.15Figura 9.15Figura 9.15Figura 9.15Figura 9.15 Proliferação de células na placa epifisária em resposta ao hormônio de crescimento. (A) Re- gião cartilaginosa em um rato jovem tornado deficiente em hormônio de crescimento pela remoção de sua hipófise. (B) A mesma região no rato após injeção de hormônio de cresci- mento. (C) Cartilagem corada em regiões parti- culares da placa de crescimento. (Fotografias de I. Gersh, de Bloom e Fawcett, 1975: C de Chen et al., 1995; cortesia de P. Goetinck.) (A) (B) (C) Cartilagem de reserva Células cartilaginosas em proliferação Zona de condrócitos maduros Zona de degeneração e ossificação de cartilagem Osso calcificado Hipertrofia e calcificação das células cartilaginosas 356 PARTE II Padrões de Desenvolvimento condrócitos. Já foi demonstrado que condrócitos hipertróficos mudam a respiração de aeróbica para anaeróbica (Brighton e Hunt, 1974; Brighton, 1984), causando uma diminuição no ATP celular e no emprego de uma via para energia mediada pela fosfocreatina, tal como a usada em músculos esgotados de oxigênio (Shapiro et al., 1992). Por algum mecanismo ainda desconhecido, imagina-se que essas mudanças metabólicas resultem em depósito de cálcio na matriz extracelular, dentro de peque- nas estruturas limitadas por membranas, conhecidas como vesículas da matriz (Wuthier, 1982). Isso inicia o processo da calcificação e permite os osteoblastos aderir e iniciar a formação do osso (Figura 9.17). À medida que novo material ósseo é adicionado perifericamente da superfície interna do periósteo, ocorre uma cavitação na região interna para formação da cavida- de da medula óssea. Essa destruição de tecido ósseo é devida aos osteoclastos, células multinucleadas que adentram o osso através dos vasos sangüíneos (Kahn e Simmons, 1975; Manolagas e Jilka, 1995). Osteoclastos são provavelmente derivados dos mesmos precursores que as células sangüíneas, e são responsáveispela dissolu- ção de ambas porções da matriz do osso, a inorgânica e a proteína (Ash et al., 1980; Blair et al., 1986). Os osteoclastos estendem numerosos processos celulares na matriz, bombeando íons de hidrogênio oriundos do osteoclasto para o material em seu redor, acidificando-o e solubilizando-o (Figura 9.18; Baron et al., 1985, 1986). Os vasos sangüíneos também importam as células formadoras de sangue, que irão residir na medula pelo resto da vida do organismo. (A) (B) Figura 9.16Figura 9.16Figura 9.16Figura 9.16Figura 9.16 Mineralização esquelética em um embrião de pinto de 17 dias que se desenvolve (A) em uma cultura sem casca e (B) dentro da casca durante a incubação normal. Os embriões fo- ram fixados e corados com vermelho de Alizarina par mostrar a matriz calcificada. (de Tuan e Lynch, 1983, cortesia de R. Tuan.) Figura 9.17Figura 9.17Figura 9.17Figura 9.17Figura 9.17 Deposição de cálcio pelos condrócitos na região distal da zona hipertrófica. Cálcio (corado em escuro nesta montagem de micrografia eletrônica) é colocado na matriz pelas células em cresci- mento. (de Brighton e Hunt, 1974; cortesia de C. T. Brighton.) Condrócitos Cálcio na matriz extracelular CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 357 ESCOBERTAS RECENTES de mu- tações do desenvolvimento es- quelético de seres humanos e murinos for- neceram notáveis visões sobre como a di- ferenciação, proliferação e padronização de condrócitos são reguladas. Receptores do Fator de Crescimento Fibroblástico A proliferação das células epifisárias das células da placa de crescimento e da carti- lagem facial pode ser interrompida pela presença de fatores de crescimento fibro- blástico (Deng et al., 1996; Webster e Donoghue, 1996). Esses fatores parecem instruir os precursores da cartilagem de se diferenciarem em vez de se dividirem. Em humanos, mutações nos receptores para fatores de crescimento de fibroblas- tos podem fazer com que esses recepto- res se tornem prematuramente ativados. Isso dá origem aos principais tipos de na- nismo humano. A acondroplasia é uma mutação dominante causada por muta- ções na região transmembrana do recep- tor 3 do fator de crescimento fibroblásti- co (FGFR3). Aproximadamente 95% dos anões acondroplásicos têm a mesma mu- tação de FGFR3, uma substituição do par de bases que converte glicina em arginina na posição 380 na região transmembrana da proteína. Além disso, mutações na por- ção extracelular da proteína FGFR3 ou no domínio da tirosina quinase intracelular resultaram na displasia tanatofórica, uma forma letal de nanismo que se parece com a acondroplasia homozigota (Figura 9.19; Bellus et al., 1995; Tavormina et al., 1995). Mutações em FGFR1 podem causar a sín- drome de Pfeiffer, caracterizada por de- feitos nos membros e fusão prematura das suturas cranianas (craniosinostose), resultando em formas anormais do crâ- nio e da face. Mutações diferentes em FGFR2 podem originar várias anomalias nos membros e/ou face (Park et al., 1995; Wilkie et al., 1995). [cell7.html] A matriz extracelular da cartilagem também é crítica para a diferenciação e organização apropriadas de condrócitos da placa de crescimento. Mutações que afetam o colágeno do tipo IV ou a sulfatação de proteoglicanos da cartila- gem podem causar severas anomalias esqueléticas. Camundongos com defici- ência de colágeno de tipo XI morrem ao nascer com anormalidades nas cartila- gens dos membros, mandíbula, costelas e traquéia (Li et al., 1995). Falência em adicionar grupos sulfato a glicoproteo- glicanos da cartilagem causa displasia distrófica, um nanismo humano caracte- rizado por uma severa curvatura da espi- nha, pé torto e lóbulos da orelha defor- mados (Hästbacka et al., 1994).[cell6.html] Receptores de Estrógeno Hormônios também são conhecidos por ter um efeito marcado sobre a epífise humana. O surto de crescimento puberal e amadu- recimento subseqüente da placa epifisária Controle da Condrogênese na Placa de Crescimento Informações adicionais Especulações& D (A) (B) (C) Figura 9.18Figura 9.18Figura 9.18Figura 9.18Figura 9.18 Atividade osteoclástica na matriz óssea. (A) Micrografia eletrônica da membrana franzida de um osteoclasto de pinto cultivado em uma matriz óssea reconstituída. (B) Seção da membrana franzida corada para detectar presença de uma ATPase capaz de transportar íons de hidrogênio da célula. A ATPase está restrita à membrana do processo celular. (C) Solubilização de componentes inorgânicos e colagenosos da matriz (conforme medido pela liberação de [45Ca] e prolina [3H], respectivamente) pelos 10.000 osteoclastos incubados sobre fragmentos ósseos marcados. (A e C de Blair et al., 1986; B de Baron et al., 1986, cortesia dos autores.) P or ce nt ag em d o os so s ol ub il iz ad o Tempo (horas) [3H] Prolina 45Ca 358 PARTE II Padrões de Desenvolvimento ainda possuía proliferação de condrócitos aos 28 anos de idade. Sua “idade óssea” - a quantidade de cartilagem epifisária que ha- via retido - era aproximadamente a metade de sua idade cronológica. Descobriu-se que nessa pessoa não estava presente qualquer receptor de estrógeno funcional. Portanto, o estrógeno cumpre um papel na maturação epifisária no sexo masculino tanto quanto no feminino. Hormônios da tireóide e hormônios relacionados à paratireóide tam- bém são importantes na regulação da matu- ração e no programa de hipertrofia da placa de crescimento epifisário (Ballock e Reddi, 1994). Dessa forma, crianças com hipotireoi- dismo são susceptíveis a desenvolver do- enças da placa de crescimento.[limb3.html] (i.e., a conversão de células em prolifera- ção para cartilagem madura e osso) são induzidas por hormônios sexuais (Kaplan e Grumbach, 1990). Em condições de pu- berdade precoce, existe uma arrancada no crescimento inicial (tornando o indivíduo mais alto do que o seu par), seguido pela interrupção da divisão celular epifisária (permitindo que seu par alcance e ultra- passe o seu peso). Não se pensava que, no sexo masculino, o estrógeno tivesse al- guma participação nesses eventos. No en- tanto, em 1994 Smith e colegas relataram o caso verídico de um homem cujo cresci- mento ainda era linear apesar de ter passa- do por uma puberdade normal. Suas pla- cas epifisárias não haviam maturado, e ele Mesoderma da Placa Lateral Nem todos os mantos mesodérmicos são organizados em somitos. Adjacente ao mesoderma somítico está a região mesodérmica intermediária. Essa corda de célu- las mesodérmicas se desenvolve no túbulo pronéfrico, que é precursor do rim e dos dutos genitais. O desenvolvimento desses sistemas de órgãos será discutido em detalhe nos Capítulos 17 e 19, respectivamente. Mais adiante lateralmente em cada lado chegamos à placa mesodérmica lateral. Essas placas se dividiem horizontal- mente em mesoderma (parietal) somático dorsal, abaixo do ectoderma e o mesoderma (visceral) esplâncnico ventral, que se superpõe ao endoderma (veja Figura 9.2C). Entre essas camadas está a cavidade corporal - o celoma - que se estende da futura região do pescoço até a parte posterior do corpo. Mais tarde no desenvolvimento, os celomas do lado direito e esquerdo se fundem e se dobram alongando-se do Figura 9.19Figura 9.19Figura 9.19Figura 9.19Figura 9.19 Displasia óssea humana causada por mutações dominantes ativadoras do receptor 3 do fator de crescimento fibroblástico. (A) Displasia tanatofórica, uma condição fatal caracterizada por severo encurtamento das costelas e mem- bros devido à cobertura das epífises por tecido ósseo. A morte é devido a problemas respira- tórios. (B) Fotografia por raios-X de um infan- te nascido com displasia tanatofórica. (C) Se- ção microscópica mostrando a desorganização de uma epífise na displasia tanatofórica. Notar a ausência de condrócitos em divisão. (de Gilbert-Barness eOpitz, 1996.) (A) (B) (C) CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 359 mesoderma somático, dividem o celoma em cavidades separadas. Nos mamíferos, o celoma é subdividido em espaços pleural, pericardíaco e peritoneal, envolvendo o tórax, coração e abdome, respectivamente. O mecanismo para a criação de somitos mesodérmicos e revestimento corporais mudou pouco através da evolução dos vertebrados, e o desenvolvimento do mesoderma da galinha pode ser comparado com estágios similares nos embriões da rã (Figura 9.20). Formação das Membranas Extra-EmbrionáriasFormação das Membranas Extra-EmbrionáriasFormação das Membranas Extra-EmbrionáriasFormação das Membranas Extra-EmbrionáriasFormação das Membranas Extra-Embrionárias O desenvolvimento embrionário nos répteis, aves e mamíferos tomou uma nova dire- ção. Os répteis desenvolveram um mecanismo para depositar ovos na terra seca, dessa forma liberando-os para explorar nichos que não estavam tão perto das águas. Para conseguir isso, o embrião produziu quatro conjuntos de membranas extra-em- brionárias para mediá-lo com o ambiente, e mesmo que a maior parte dos mamíferos tenha desenvolvido placentas ao invés de cascas, o padrão básico das membranas extra-embrionárias permaneceu o mesmo. Em répteis, aves e mamíferos em desenvolvi- mento, inicialmente não existe distinção entre domínios embrionários e extra-embrio- nários. No entanto, como o corpo do embrião toma forma, o epitélio lateral se divide desigualmente para criar dobras corporais, isolando o embrião do vitelo e delineando quais áreas deverão ser embrionárias e quais extra-embrionárias (Miller et al., 1994). Figura 9.20Figura 9.20Figura 9.20Figura 9.20Figura 9.20 Comparação entre o desenvolvimento meso- dérmico em embriões de rã e pinto. (A) Em- briões de rã em estágio de nêurula mostrando desenvolvimento progressivo do mesoderma e celoma. (B) Seção transversa de um em- brião de pinto. (C) Quando o embrião de pin- to é separado da sua enorme massa de vitelo, parece uma nêurula anfíbia em estágio seme- lhante. (A segundo Rugh, 1951; B e C segun- do Patten, 1951.) (A) EMBRIÃO DE Rà Placa neural Crista neural Somito Tubo neural Notocorda Mesoderma somático Celoma Endoderma Mesoderma Esplâncnico Intestino médio Mesoderma da placa lateral (B) EMBRIÃO DO PINTO Cortes para remoção do embrião Intestino primitivo Vitelo Rasgo Rasgo ( C ) PINTO “TRANSFORMADO” EM Rà Tubo neural Somito Celoma Intestino primitivo Vitelo EMBRIÂO DE PINTO (removido do vitelo; margens rejuntadas) EMBRIÃO DE Rà 360 PARTE II Padrões de Desenvolvimento As dobras membranosas são formadas pela extensão do epitélio ectodérmico e endodérmico escorado pelo mesoderma. A combinação de ectoderma e mesoderma, freqüentemente referida como somatopleura, forma as membranas do âmnio e cório e a combinação de endoderma e mesoderma - a esplancnopleura - forma o saco vitelínico e a alantóide. Os tecidos endodérmicos e ectodérmicos agem como células epiteliais funcionais; e o mesoderma gera o suprimento de sangue essencial para lá e para cá do epitélio. A formação dessas dobras pode ser observada na Figura 9.21. Figura 9.21Figura 9.21Figura 9.21Figura 9.21Figura 9.21 Desenho esquemático das membranas extra- embrionárias do pinto. O embrião está corta- do longitudinalmente e os revestimentos de albumina e da casca não são mostrados. (A) embrião de 2 dias. (B) Embrião de 3 dias. (C) Diagrama esquemático detalhado da região caudal (posterior) do embrião do pinto, mos- trando a formação da alantóide. (D) Embrião de 5 dias. (E) Um embrião de 9 dias. (Segun- do Carlson, 1981.) Membrana alantóica (A) (B) Cabeça do embrião Celoma extra-embrionário Celoma extra-embrionário Dobra da cabeça do âmnio EmbriãoDobra da cabeça do âmnio Ectoderma Ectoderma Dobra caudal do âmnio Mesoderma somático Mesoderma somático Mesoderma esplâncnicoMesoderma esplâncnico Endoderma Envoltório vitelínico Envoltório vitelínico ViteloVitelo Endoderma (C) Cório Cavidade amniótica Ectoderma Âmnio Cavidade cório-amnióticaTubo neural Notocorda Aorta Intestino médio Mesênquima Intestino posterior Endoderma Mesoderma Proctódeo Esplâncnopleura do saco vitelínico Alantóide adentrando o celoma extra-embrionárioInvaginação Alantóica (D) (E) Embrião Embrião Membrana alantóica Âmnio Intestino Cavidade amniótica Cório Vitelo Alantóide Intestino Âmnio Cavidade amniótica Cório Vitelo Saco vitelínico CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 361 O primeiro problema de um ovo vivendo na terra é a dessecação. Células embri- onárias secariam rapidamente se não estivessem em um ambiente aquoso. Esse ambiente é suprido pelo âmnio. As células dessa membrana secretam fluido amniótico; assim, a embriogênese ainda acontece na água. Esse avanço evolucionário é tão significativo e característico que répteis, aves e mamíferos estão agrupados como vertebrados amnióticos. O segundo problema desses ovos é a troca de gases. Essa troca é realizada pelo cório, a membrana extra-embrionária mais externa. Nas aves e répteis, essa membrana se adere à casca, permitindo a troca de gases entre o ovo e o ambiente. Nos mamíferos, como havíamos dito, o cório evoluiu tornando-se placenta, que tem muitas funções além da respiração. A alantóide armazena resíduos urinários e media a troca de gases. Nos répteis e aves, a alantóide se torna um grande saco, já que não existe outro modo para manter os subprodutos do metabolismo do embrião em desenvolvimento. A camada mesodérmica da membrana da alantóide freqüentemente alcança e se funde com a camada mesodérmica do cório para criar a membrana corioalantóica. Esse envelope extrema- mente vascularizado é crucial para o desenvolvimento da ave, e é o responsável pelo transporte de cálcio da casca do ovo para o embrião para produção de ossos (Tuan, 1987). Nos mamíferos, o tamanho da alantóide depende do sucesso da remoção dos resíduos de nitrogênio pela placenta coriônica. Em humanos a alantóide é um saco vestigial; enquanto nos porcos é um órgão grande e importante. O saco vitelínico é a primeira membrana extra-embrionária a ser formada, visto que ele medeia a nutrição em aves e répteis em desenvolvimento. Ele é derivado de células endodérmicas que crescem sobre o vitelo para englobá-lo. O saco vitelínico é conectado ao intestino médio por um tubo aberto, o duto vitelínico, para que as paredes do saco vitelínico e do intestino sejam contínuas. Os vasos sangüíneos dentro do mesoderma da esplancnopleura transportam nutrientes do vitelo para o corpo, pois o vitelo não é levado diretamente para o corpo através do duto vitelínico. Ao contrário, células endodérmicais digerem a proteína em aminoácidos solúveis, que podem então ser passados aos vasos sangüíneos envolvendo o saco vitelínico. Outros nutrientes, incluindo vitaminas, íons e ácidos graxos são armazenados no saco vitelínico e trans- portados pela circulação embrionária. Por esses caminhos, as quatro membranas ex- tra-embrionárias permitem que o embrião se desenvolva em terra. O CoraçãoO CoraçãoO CoraçãoO CoraçãoO Coração O sistema circulatório é uma das grandes conquistas do mesoderma da placa lateral. Consistindo de um coração, células sangüíneas e um intricado sistema de vasos san- güíneos, o sistema circulatório fornece a nutrição para o embrião vertebrado em de- senvolvimento. O sistema circulatório é a primeira unidade funcional no embrião em desenvolvimento, e o coração é o primeiro órgão funcional. O coração vertebrado surge de duas regiões do mesoderma esplâncnico que interagiu com tecido adjacente para se tornar específico para o desenvolvimento do coração. Essas células cardiogênicas migram para uma posição mediana ventral e se fundem para se tornar um tubo simples de células musculares que se contraem. Esse coraçãotubular se contorce formando uma estrutura em forma de S, com um único átrio e um único ventrículo. Com a continuação do desenvolvimento, o ventrículo forma suas camadas e se prolifera mais rapidamente que o átrio, os septos separam as câmaras do coração e as válvulas se desenvolvem. FUSÃO DOS RUDIMENTOS DO CORAÇÃO. Nos anfíbios, as duas prováveis regiões formadoras do coração são inicialmente encontradas na posição mais an- terior da manta mesodérmica. Enquanto o embrião está sofrendo neurulação, es- sas duas regiões se juntam na região ventral do embrião para formar uma cavidade pericardial comum. Nas aves e mamíferos, o coração também se desenvolve pela 362 PARTE II Padrões de Desenvolvimento fusão de primórdios pareados, mas a fusão desses dois rudimentos ocorre muito mais tardiamente no desenvolvimento. Nesses vertebrados amnióticos, o embrião é um disco achatado, e o mesoderma da placa lateral não circunda completamente o saco vitelínico. As prováveis células do coração se originam no sulco primitivo precoce, um pouco posterior ao nódulo de Hensen e se estendem até cerca da metade do seu comprimento (Figura 9.22A). Essas células migram através do sulco e formam dois grupos de células mesodérmicas laterais ao (e no mesmo nível do) nódulo de Hensen (Figura 9.22B; Garcia-Martinez e Schoenwolf, 1993). Quando o embrião do pinto tiver somente 18 a 20 horas de idade, essas prováveis células do coração se movem anteriormente entre o ectoderma e o endoderma em direção ao meio do embrião, permanecendo em estreito contato com a superfície endodérmica (Figura 9.22C; Linask e Lash, 1986). Quando as células alcançam a área onde o intestino se estendeu até a região anterior do embrião, a migração cessa. O direcionamento para essa migração parece ser fornecido pelo endoderma. Se o endoderma da região cardíaca é girado com respeito ao resto do embrião, a migra- ção das células mesodérmicas pré-cardíacas é invertida. Pensa-se que o compo- nente endodérmico responsável por esse movimento é um gradiente ântero-pos- terior de concentração da fibronectina. Anticorpos contra a fibronectina interrom- pem a migração, enquanto anticorpos contra outros componentes da matriz extra- celular não o fazem (Linask e Lash, 1988a,b). Figura 9.22Figura 9.22Figura 9.22Figura 9.22Figura 9.22 Células formadoras do coração no embrião do pinto. (A) Origem de células cardíacas no embrião precoce do pinto (estágio 3b). O padrão ântero-posterior geral do sulco primitivo é visto no endocárdio e miocárdio do coração. (B) Modelo para a especificacão do mesoderma cardíaco. Os caminhos da migração mesodérmica nas várias regiões do sulco primitivo estão representados por setas. Sinais que induzem miogênese cardíaca estão representados por + , e inibidores da indução cardíaca estão representados como - . O mesoderma migratório na região 1 não encontra indutores ou repressores. Células migrando da região 3 encontram ambos. Somente células migrando da região 2 encontram o indutor sem o inibidor. (C) Micrografia eletrônica de varredura do mesoderma formador do coração no embrião de pinto de 24 horas. O mesoderma é facilmente separado do ectoderma, mas permanece em íntima associação com o endoderma. (A segundo Garcia-Martinez e Schoenwolf, 1993; B segundo Schultheiss et al., 1995; C de Linask e Lash, 1986, cortesia de K. Linask.) (C) Células se tornam notocordaAnterior (rostral) Células se tornam coração Tronco arterioso Nódulo de Hensen Ventrículo Bulbus cordis Seio venoso (A) Posterior (caudal) µm d is ta nt e do n ód ul o de H en se n (B) + = promotor de determinantes cardíacos - = repressor de determinantes cardíacos Ectoderma Mesoderma Endoderma CAPÍTULO 9 Mesoderma e Endoderma 363 O endoderma também faz com que as células pré-cardíacas comecem seu desen- volvimento como músculos do coração. O endoderma anterior pode fazer com que as células mesodérmicas não cardíacas expressem proteínas específicas do coração tan- to em aves como em anfíbios (Jacobson, 1961; Sugi e Lough, 1994; Nascone e Mercola, 1995; Schultheiss et al., 1995). Essa diferenciação ocorre independentemente nos dois primórdios formadores do coração, um migrando ao encontro do outro. As presuntivas células do coração de aves e mamíferos formam um tubo de parede dupla consistindo de um endocárdio interior e um epimiocárdio exterior. O endocárdio formará o revesti- mento interno do coração, e o revestimento externo formará a camada dos músculos do coração que irão bombear por toda a vida do organismo. Com a continuação da neurulação, o intestino anterior é fechado pelo dobramento interno do mesoderma esplâncnico (Figura 9.23). Esse movimento junta os dois tubos, finalmente unindo o epimiocárdio em um tubo único. Os dois endocárdios ficam em uma câmara comum por um curto período, mas também irão se fundir. Nessa altura, a dupla câmara celômica original se une para formar a cavidade do corpo que aloja o coração. A origem bilateral do coração pode ser demonstrada através de intervenção cirúrgica, prevenindo a fusão do mesoderma da placa lateral (Gräper, 1907; DeHaan, 1959). Isso resulta em uma condição chamada cárdia bífida, na qual um coração em separado se forma em cada lado do corpo (Figura 9.24). A próxima etapa na formação do coração é a fusão dos tubos endocárdicos para formação de uma única câmara de bombeamento (veja Figura 9.23C,D). Essa fusão ocorre aproximadamente às 29 horas do desenvolvimento das aves e na terceira semana da gestação humana. As partes posteriores não fundidas do endocárdio se tornam as aberturas das veias vitelínicas para o coração (Figura 9.25). Essas veias vão carregar nutrientes do saco vitelínico para o seio venoso. O sangue então passa através de uma lâmina semelhante à válvula de forma achatada, para a região atrial do coração. Contrações do tronco arterioso aceleram o sangue para a aorta. As pulsações do coração começam enquanto os primórdios pareados ainda estão se fundindo. O marcapasso dessa contração é o seio venoso. Contrações começam aqui e uma onda de contração muscular é então propagada até o coração tubular. Desse modo, o coração pode bombear sangue mesmo antes do seu intricado sistema de válvulas ter sido completado. As células musculares do coração têm na sua própria herança a habilidade de contrair, e células do coração isoladas de um rato com 7 dias ou de embriões de pintos, vão continuar a bater em placas de Petri (Harary e Farley, 1963; DeHaan, 1967). No embrião, essas contrações se tornam reguladas por estímu- los elétricos procedentes da medula oblongata via nervo vago, e em 4 dias, o eletrocardiograma de um embrião de pinto se aproxima daquele de um animal adulto. FORMAÇÃO DAS CÂMARAS DO CORAÇÃO. Em um embrião de pinto de 3 dias ou um embrião humano de 5 semanas, o coração é um tubo de duas câmaras, com um átrio e um ventrículo. Em um embrião de pinto podemos observar a olho nu, o extraordinário ciclo do sangue entrando na câmara de baixo e sendo bombeado para fora através da aorta. A separação desse tubo em um átrio e um ventrículo distintos é completada quando células do miocárdio produzem um fator (provavelmente o fator transforma- dor de crescimento β3) que faz com que as células do endocárdio adjacente se des- prendam e entrem na “gelatina cardíaca” rica em hialuronato situada entre as duas camadas (Markwald et al., 1977; Potts et al., 1991). Nos seres humanos, essas células causam a formação do colchão endocárdico que divide o tubo nos canais átrio- ventriculares direito e esquerdo (Figura 9.26). Enquanto isso, o átrio primitivo é dividi- do pelo crescimento de dois septos que crescem ventralmente em direção aos col- chões endocárdicos. Os septos, no entanto, possuem orifícios para que o sangue ainda possa atravessá-los. Esse atravessar do sangue é necessário para a sobrevivên- cia do feto antes
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