ETAPAS DA TERAPIA GÊNICA

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ETAPAS DA TERAPIA GÊNICA
As etapas envolvidas em um experimento de terapia gênica são: o isolamento do gene, a construção de um vetor, a transferência para células no tecido-alvo, e a produção da proteína codificada e expressa pelo gene terapêutico nessas células.
- Isolamento do gene: Um gene é uma porção de DNA que contém a informação necessária para sintetizar uma proteína. O primeiro passo para a terapia gênica, é identificar o gene responsável pela enfermidade. Depois, através de técnicas de biologia molecular é possível adquirir um pedaço de DNA que contém este gene. 
- Construção de um vetor: vetores funcionam como veículos carreadores de genes para o interior das células. Eles podem ser de natureza biológica, como por exemplo, os vírus, ou ainda de natureza química ou física. O vetor ideal deve ser de fácil produção, não deve gerar resposta imunológica ao vírus ou ao transgene pelo paciente e deve promover a expressão do transgene de modo eficiente e por longo tempo.
Vetores virais: são vírus manipulados geneticamente, para que se reduza a sua patogenicidade, sem anular totalmente o seu poder de infectar as células do hospedeiro. Com as técnicas da engenharia genética, é possível somar ao DNA do vírus o gene que se quer transferir a determinada célula.
·         Retrovírus - possuem a habilidade de integrar o seu DNA dentro dos cromossomos da célula infectada (sendo transmitidos a todas as células-filhas das infectadas); infectam somente as células que estão em divisão, limitando seu uso em células que não sofrem divisão, como os neurônios; outra desvantagem é que como eles se integram preferencialmente próximo a sequências promotoras, os retrovírus podem alocar-se próximo a um proto-oncogene, ativando-o e, assim, causando a formação de um tumor.
·         Adenovírus - não são capazes de integrar o seu DNA ao cromossomo da célula hospedeira; podem transportar genes de grandes dimensões; apesar de apresentarem alta eficiência, induzem uma elevada resposta imunológica que reduz o tempo de expressão do transgene; necessitariam de repetidas reinfecções do tecido acometido; a pesquisa atual está se concentrando em adenovírus do tipo “gutless” em que quase todo o genoma viral é removido para reduzir a resposta imune e aumentar o tamanho potencial de inserção.
·         Adenoassociados (precisam da presença de um adenovírus para a sua replicação) - integram o seu DNA ao cromossomo da célula hospedeira; podem transduzir células que não estão em divisão; não são capazes de transportar genes de dimensões grandes; são relativamente fáceis de se obter;  produzem pouca resposta imune e têm pouco efeito patogênico; são capazes de manter a expressão terapêutica de meses a anos. Eles se tornaram muito mais populares como vetores de terapia gênica durante os últimos anos.
·         Lentivírus: são retrovírus RNA complexos que, diferente dos retrovírus simples, podem transduzir células que não estão em divisão através de poros na membrana nuclear. Os lentivírus podem se integrar com estabilidade ao genoma, e podem aceitar inserções razoavelmente grandes. Eles são atualmente o foco de muita pesquisa e desenvolvimento.   
Vetores não-virais: um dos mais extensamente estudados é o lipossomo, um corpo adiposo que pode aceitar grandes inserções de DNA. Os lipossomos às vezes se fundem com células, permitindo que a inserção de DNA entre na célula. Como o lipossomo não tem peptídeos, ele não provoca uma resposta imune. Sua principal desvantagem é que ele carece da eficiência de transferência dos vírus: a maioria dos lipossomos é degradada no citoplasma.
Também é possível inserir plasmídeos contendo DNA humano diretamente em células sem o uso de absolutamente nenhum vetor de transferência. Embora a maior parte do DNA “nu” seja repelida pela membrana celular, o DNA ocasionalmente entra na célula, escapa da degradação e codifica proteínas temporariamente. Ainda estão sendo feitas tentativas para usar o DNA “nu” como vacina.
Está em desenvolvimento a síntese de cromossomos humanos artificiais. Como esses cromossomos sinteticamente construídos contem centrômeros e telômeros funcionais, eles devem ser capazes de se integrar e se replicar em núcleos de células humanas.  
- Transferência para células:
Procedimentos in vivo: consistem em transferir o DNA diretamente para as células ou para os tecidos do paciente.
Procedimentos ex-vivo: o DNA é primeiramente transferido para células isoladas de um organismo, previamente crescidas em laboratório. As células isoladas são modificadas e podem ser introduzidas no paciente. Este método apesar de mais demorado, é mais eficaz e oferece a possibilidade de selecionar e ampliar as células modificadas antes da reintrodução.
Os procedimentos de transferência do DNA in vivo ou em ex-vivo têm o mesmo propósito: o gene deve ser transferido para dentro das células, e uma vez inserido, tem que resistir bastante tempo. Neste tempo, o gene tem que produzir grandes quantidades de proteína para reparar o defeito genético.