Livro parte 1 silva e queiroz

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�Dirceu Jorge Silva e Augusto César de Queiroz
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�Análise de alimentos – Métodos químicos e biológicos
Análise de Alimentos
Métodos Químicos e Biológicos
	Universidade Federal de Viçosa
	Reitor
	
	Evaldo Ferreira Vilela
	Vice-Reitor
	
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	Pró-Reitor de Extensão e Cultura
	
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A Editora UFV é filiada à
(Associação Brasileira de Editoras Universitárias)
Dirceu Jorge Silva
Professor Titular Aposentado da UFV
Augusto César de Queiroz
Professor Titular da UFV
Análise de Alimentos
Métodos Químicos e Biológicos
Universidade Federal de Viçosa
2002
( 1981 by Dirceu Jorge Silva
1a edição: 1981
2a edição: 1990
1a reimpressão: 1998
2a reimpressão: 2001
3a edição: by Dirceu Jorge Silva e Augusto César de Queiroz
Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação pode ser reproduzida sem a autorização escrita e prévia dos detentores do copyright.
Impresso no Brasil
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e 
Classificação da Biblioteca Central da UFV
	
S586a
2002
	Silva, Dirceu Jorge
Análise de Alimentos : métodos químicos e biológicos / Dirceu Jorge Silva, Augusto César de Queiroz. 3.ed. – Viçosa : UFV, 2002.
235p. : il.
ISBN: 85-7269-105-7
1. Animais - Alimentos - Análise. 2. Animais - Alimentos - Valor nutritivo. 3. Nutrição animal. 4. Alimentos - Composição. 5. Alimentos - Teor mineral. 6. Forragens. I. Queiroz, Augusto César de. II. Título.
CDD 19.ed. 636.085
CDD 20.ed. 636.085
Capa
Layout: Sérgio Ramos
Fotolito: Betel Studio Gráfico
Revisão lingüística: Nelson Coeli
Editoração eletrônica: José Roberto da Silva Lana
Impressão e acabamento: Divisão de Gráfica Universitária da UFV
Editora UFV
Edifício Francisco São José, s/n
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36571-000 Viçosa, MG, Brasil
Tel. (0xx31) 3899-2220
Fax (0xx31) 3899-2143
E-mail: editora@ufv.br
Agradecimentos
Aos professores, estudantes pós-graduandos e funcionários do Laboratório de Nutrição Animal do Departamento de Zootecnia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Viçosa apresentamos nossos mais sinceros agradecimentos.
A todos, portanto, que de uma maneira ou outra incentivaram os autores nesta terceira edição.
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Apresentação
A publicação deste livro, agora em sua terceira edição, reveste-se do intuito de suprir as lacunas da literatura disponível para os que lidam com análises químicas laboratoriais e com valor nutritivo de alimentos no Brasil.
As tradicionais obras que versam sobre o tema, entre elas o “Official Methods of Analysis – AOAC”, além de representarem literatura de difícil aquisição, não foram ainda editadas em português.
Na presente edição, foram feitas algumas modificações nos capítulos referentes aos procedimentos laboratoriais, com o acréscimo de outros capítulos de procedimentos laboratoriais ainda não contemplados ou novos.
O livro “Análise de Alimentos – Métodos Químicos e Biológicos” representa, nessa circunstância, uma tentativa de oferecer contribuição aos estudiosos do assunto, especialmente aos que se dedicam ao desenvolvimento da Engenharia Agronômica e de Alimentos, Nutrição Humana, Zootecnia, Bioquímica e áreas afins.
Os Autores
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Prefácio
Em boa hora, vem a lume o livro “Análise de Alimentos – Métodos Químicos e Biológicos”, dos Professores Dirceu Jorge Silva e Augusto César de Queiroz, revisado e ampliado, destinado a servir de base e de referência a todos aqueles que se dedicam às atividades de avaliação nutricional dos alimentos, em geral.
Esta obra é, basicamente, uma ampliação objetiva e detalhada da disciplina ZOO 644 – Análise de Alimentos. Nela, o leitor encontrará as informações necessárias, pertinentes às determinações que freqüentemente se processam num laboratório de análise de alimentos, além de outras de uso menos freqüente.
Este livro, especialmente proposto para os estudantes pós-graduandos de Zootecnia, que, em sua maioria, gastam boa parte de seu treinamento em laboratórios, analisando os mais variados tipos de alimentos e de tecidos animais, a fim de preparar suas teses, é igualmente útil a todos aqueles que desejarem uma obra de referência, de fácil acesso, em suas atividades laboratoriais de análise de alimento.
Devem, pois, os autores sentir-se recompensados pelo esforço desenvolvido, durante meses, para concluir a presente obra, dando, assim, valiosa contribuição ao meio científico brasileiro.
José Alberto Gomide, Ph. D.
Professor Titular da UFV
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Sumário
Capítulo 1
Conceitos Gerais Sobre Análise de Alimentos, Preparação de amostras e Determinação da Matéria Seca	15
Capítulo 2
Determinação de Gordura Bruta ou do Extrato Etéreo	39
Capítulo 3
Determinação da Fibra Bruta	47
Capítulo 4
Determinação da Celulose	53
Capítulo 5
Determinação do Nitrogênio Total e da proteína bruta 	57
Capítulo 6
Determinação da Cinza ou Matéria Mineral	77
Capítulo 7
Preparo de Solução Mineral	83
Capítulo 8
Determinação da Energia Bruta	87
Capítulo 9
O Método Van Soest na Determinação da Qualidade de Forrageiras	97
Capítulo 10
Avaliação da Digestibilidade “In Vitro” de Forrageiras pelo Procedimento em Duas Etapas	129
Capítulo 11
Determinação dos Carboidratos Solúveis (Amilose + mono e dissacarídeos)	143
Capítulo 12
Determinação dos Carboidratos Ácido-Digeríveis – CAD (Amido + mono e dissacarídeos)	149
Capítulo 13
Determinação dos Carboidratos Totais Não-Estruturais (CTN)	155
Capítulo 14
Determinação do pH, da Acidez Titulável e do Ácido Lático da Silagem	163
Capítulo 15
Determinação do Fósforo Inorgânico Total	169
Capítulo 16
Determinação do Teor de Caroteno em Plantas Forrageiras - Procedimento Simplificado	179
Capítulo 17
Conceitos Básicos Sobre Absorção Atômica	187
Capítulo 18
Determinação do Cálcio Inorgânico Total 	213
Capítulo 19
Determinação do Cromo (Óxido Crômico – Cr2o3) em Fezes 	219
Capítulo 20
Tabelas de Conversão e de Elementos Comumente Usadas nos Laboratórios	225
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Capítulo 1
Conceitos Gerais Sobre Análise de Alimentos, Preparação de amostras e Determinação da Matéria Seca
Considerações Gerais
A análise dos alimentos é um dos principais pontos a serem observados no setor de nutrição animal. O objetivo principal da análise é conhecer a composição química, além de verificar a identidade e pureza, sejam elas de natureza orgânica ou inorgânica. Em face da sua importância, serão apresentados e discutidos aqui alguns métodos e técnicas rotineiros que interessam ao pesquisador, principalmente o da área de nutrição animal.
Um estudo mais completo dos alimentos e forragens compreenderá o conhecimento das propriedades gerais, como aspecto, aroma, sabor, alterações e estrutura microscópica, e, ainda, a determinação do teor das substâncias nutritivas, por intermédio da análise proximal. Além da análise proximal de um alimento, o nutricionista, o zootecnista etc. desejam conhecer também sua digestibilidade, isto é, a parte do alimento que estaria disponível para o animal.
Entende-se como substâncias nutritivas aquelas necessárias ao organismo para que este possa exibir todas asmanifestações vitais, bem como as necessárias à construção e reconstituição dos tecidos.
A digestibilidade dos alimentos é medida nas diferentes espécies animais, conforme interesse do pesquisador, e usando-se distintas técnicas de campo e de laboratório.
O método usado para as análises que se fazem normalmente é o chamado Weende. Por esse método é que se tem a análise proximal dos alimentos, desde 1864. As técnicas ainda são quase as mesmas, com exceção do nitrogênio, que é feito segundo o método Kjedahl (AOAC, 1984).
As análises clássicas comumente feitas visam obter informações sobre os seguintes componentes dos alimentos:
- matéria seca;
- proteína bruta;
- gordura ou extrato etéreo;
- fibra bruta;
- extrato não-nitrogenado; e
- cinza ou matéria mineral.
Esses componentes, na realidade, não são compostos quimicamente definidos, mas sim grupos de compostos químicos, como, por exemplo, o termo proteína bruta, que, realmente, inclui vários compostos químicos, sendo os mais comuns os aminoácidos. Da mesma forma, o termo extrato etéreo inclui não apenas triglicerídios, mas também outros compostos solúveis em éter.
O método de Weende não parece satisfatório para se obterem informações sobre os carboidratos, pois inclui no grupo da fibra bruta a celulose e apenas a lignina insolúvel em álcali. No grupo dos extratos não-nitrogenados encontram-se frações de naturezas diversas, como amido, hemicelulose, pectina, lignina solúvel em álcali e os carboidratos solúveis em água.
Essa divisão parece insatisfatória do ponto de vista nutricional, pois é conhecido que hemicelulose, pectina e lignina solúvel em álcali não apresentam as mesmas características nutricionais dos outros componentes englobados no termo extratos não-nitrogenados. Uma separação química dos polissacarídeos somente seria útil se se descer aos pormenores do peso molecular, à posição das ligações glicosídicas etc. Portanto, uma análise extremamente sofisticada seria necessária para separar os vários componentes do alimento quanto aos aspectos químicos e nutricionais.
Numa tentativa de resolver o problema, VAN SOEST (1967) propõe a divisão dos componentes da amostra analisada em conteúdo celular, que compreende as frações solúveis em detergente neutro, conforme preconiza o método. Engloba uma série de compostos químicos e nutricionalmente definidos, como lipídios, compostos nitrogenados, amido, pectina e outros compostos solúveis em água. A segunda parte, que compreende a parede celular, chamada de fibra em detergente neutro (FDN), inclui a proteína insolúvel, a hemicelulose e a lignocelulose, a qual engloba, principalmente, as frações de lignina e celulose. Quanto ao aspecto nutricional, o método de Van Soest separa melhor os diversos componentes da fração fibrosa. Parece, portanto, desejável a substituição da tradicional fibra bruta pela fibra em detergente ácido (FDA), do ponto de vista nutricional. No entanto, é oportuno lembrar que na determinação dos Nutrientes Digestíveis Totais (NDT) para animais não-ruminantes ainda se usa a tradicional fibra bruta.
Na realidade, os métodos de Weende e de Van Soest fornecem informações suficientes sobre a composição química de determinado alimento. Informações adicionais freqüentemente tornam-se necessárias, como minerais, vitaminas, proteína real ou verdadeira, teores de aminoácidos, individualmente, ácidos graxos específicos, carboidratos solúveis, energia, estimativa do valor nutritivo por meio de testes de digestibilidade in vitro etc.
Coleta de Amostras que se Destinam
ao Laboratório
A técnica da coleta de amostras dos alimentos concentrados e das forragens, visando à análise química, tem por finalidade obter amostra perfeitamente representativa da média do material a ser analisado. Torna-se, portanto, essencial todo cuidado na coleta destas amostras, sem o que se obtêm resultados viciados. Os erros cometidos durante a amostragem não poderão ser retificados ou compensados, por mais cuidadosas que venham a ser as futuras análises.
Do material para estudo, devem-se retirar numerosas amostras parciais, colhidas em diferentes pontos do local de interesse: campo, prado, armazém, vagão etc. Dessa amostra média, às vezes volumosa, após homogeneizada, podem ser tiradas amostras parciais antes que elas sejam enviadas ao laboratório. Após colhidas, as amostras devem ser colocadas em sacos plásticos ou de papel e transportadas imediatamente ao laboratório, a fim de não alterar a umidade do material durante o transporte, principalmente de forragem fresca, e evitar ocorrência de fermentação. A perda de alguma umidade durante o transporte não terá grande importância, desde que os resultados sejam dados apenas na base da matéria seca.
A manipulação da amostra até o momento de sua análise deverá ser tão cuidadosa quanto possível, para evitar alterações nos princípios nutritivos. Tratando-se de forragens verdes, fezes, urina etc., quando as análises não forem processadas imediatamente, é necessário que as amostras sejam conservadas em congelador, entre –5 e –10 oC.
A redução, ou confecção, de subamostras de amostras que ainda não foram moídas é freqüentemente a maior fonte de variação durante os procedimentos das análises subseqüentes e deve ser evitada sempre que possível. 
Preparo da Amostra a ser Analisada
Princípio
A preparação de uma amostra para os procedimentos analíticos é um processo que converte uma amostra em um material homogêneo, satisfatório para este procedimento, isto é, a análise. Este processo geralmente envolve secagem e, ou, moagem.
Considerações Gerais
A maioria das amostras encontra-se em uma das seguintes categorias: (1) amostras suficientemente secas para serem finamente moídas e analisadas imediatamente (amostra com mais de 90% de matéria seca); (2) amostras suficientemente secas para serem grosseiramente moídas (peneiras de 4 a 6 mm), mas ainda muito úmidas, que precisam ser pré-secas ou parcialmente secas antes de serem finamente moídas (amostra com mais ou menos 85% de matéria seca); e (3) amostras que precisam ser pré-secas antes de serem grosseiramente moídas (peneiras de 4 a 6 mm) e finamente moídas (amostra com baixo teor de matéria seca). 
Estas categorias de amostras devem ser manejadas diferentemente, isto é, necessitam de tritura prévia, moagem preliminar ou moagem final.
Tritura prévia – Na maioria dos casos, as categorias de amostras descritas exigem uma trituração grosseira antes de se proceder à moagem preliminar, ou moagem final, e, conseqüentemente, a qualquer análise. As forragens verdes, as raízes, os tubérculos etc. deverão ser cortados, inicialmente, com tesoura de poda ou picador de forragens laboratorial. Os grãos são grosseiramente triturados em moinhos adequados, enquanto as forragens ensiladas e as rações fareladas raramente necessitam de moagem ou trituração prévia.
Moagem preliminar – É feita após a trituração prévia em amostras com 85% ou mais de matéria seca ou em amostras com menos de 85% de matéria seca que foram pré-secas. Esta moagem consiste em moer as amostras em moinhos de facas dotados de peneiras de 4 a 6 mm, de modo que se obtenha uma amostra grosseiramente moída.
Moagem final – É realizada após a moagem preliminar das amostras com 85% ou mais de matéria seca ou em amostras com menos de 85% de matéria seca que foram pré-secas, ou após trituração prévia de amostras que na sua origem já se apresentam com elevado teor de matéria seca, acima de 90%, as quais quase sempre podem sofrer a moagem final diretamente. Esta moagem consiste em moer as amostras de modo que se obtenha um pó bastante fino, usando-se moinhos de faca ou ciclone dotados de peneiras de 1 mm. Certas determinações químicas, como as de nitrogênio amínico, vitamina C, caroteno etc., devem ser feitas na amostra fresca, porque estes compostos sofrem perdas ou alterações durante o processo de secagem.
Equipamentos e Materiais
- Congeladores e geladeiras.
- Espátula de lamina plana, aço inox 30 cm.- Picador de forragens de laboratório (Wiley no 1 ou equivalente).
- Moinho ciclone (Cyclotec ou equivalente).
- Moinho de facas (Wiley no 4 ou equivalente).
- Quarteador de amostras de laboratório.
- Recipientes de transporte para amostras.
- Sacos plásticos.
- Tesouras (de mão) de poda.
- Toalha de plástico, 1 x 1 m.
- Vasilhames de plástico.
Procedimento
Preparação de amostras com 85% ou mais de matéria seca para moagem
1. Remova amostra do recipiente de transporte e descarte as raízes das plantas, eliminando partículas de sujeira. Anote e relate material removido e qualquer outra manipulação da amostra.
2. Corte as amostras de plantas em pedaços de 1,5 cm, usando tesouras de poda ou o picador de forragem de laboratório.
3. Moa toda a amostra em moinho tipo Wiley no 1, usando peneira de 4 a 6 mm (ver procedimento descrito a seguir).
4. Reduza o tamanho de amostra em um quarteador de amostras de laboratório para a quantidade desejada a uma amostra de laboratório. Transfira o remanescente para um sacola plástica, vede e coloque etiqueta identificadora.
5. Se a amostra estiver muito úmida para a moagem (menos que 90% matéria seca), pré-seque a amostra reduzida em estufa com circulação forçada de ar ou forno de microondas. 
6. Moa a amostra reduzida para a finura desejada para análise em moinho apropriado – moagem com moinho tipo Wiley no 4 ou moinho ciclone Cyclotec, usando peneira de 1 mm (ver procedimentos descritos na seqüência).
7. Misture bem a amostra moída. Transfira para um recipiente limpo, feche hermeticamente e coloque etiqueta identificadora.
Preparação de amostras com menos de 85% de matéria seca para moagem
O procedimento para realização é o mesmo que para preparação de amostras com 85% ou mais de matéria seca para moagem, apenas com modificações nos passos (3), (4) e (5), assim descritos:
1. Coloque a amostra cortada em um vasilhame de plástico ou em uma toalha de plástico limpo. Misture bem.
2. Reduza o tamanho de amostra fazendo um cone desta e divida em quatro partes. Conserve as duas opostas. Misture bem as duas partes opostas, refaça o cone e divida novamente em quatro partes até o volume ser reduzido a um tamanho apropriado. Transfira o remanescente para uma sacola plástica, vede e coloque etiqueta identificadora.
3. Pré-seque a amostra reduzida em estufa com circulação forçada de ar ou forno de microondas 
Moagem usando moinho de facas
1. Inspecione o moinho para cuidadosa limpeza.
2. Insira a peneira apropriada no moinho.
3. Feche a porta do moinho. Não aperte muito forte, para evitar que o rotor aproxime muito da porta do moinho.
4. Insira o recipiente coletor de amostra moída no lugar apropriado. Ligue o moinho no interruptor elétrico.
5. Feche a “tampa de alimentação” no topo do moinho.
6. Adicione amostra na calha de alimentação. Abra parcialmente a “tampa de alimentação” para permitir a entrada de amostra e, depois, feche-a. Se necessário, empurre a amostra para dentro da câmara do moinho com uma espátula de madeira. Pare o moinho, para prevenir o contado da espátula com as facas do moinho.
7. Após a primeira porção ter sido moída, realimente o moinho com outra porção.
8. Permita que o moinho funcione por pelo menos dois minutos após a última porção ter sido adicionada, a fim de assegurar que toda a amostra tenha passado. Desligue o interruptor elétrico do moinho. 
9. Segure o recipiente coletor de amostra moída embaixo da câmara de moagem e abra o moinho. Use uma escova ou espátula para transferir da câmara do moinho o resíduo semimoído para o recipiente coletor de amostra moída. Remova a peneira e transfira o resíduo aí contido para o recipiente coletor de amostra moída. Misture bem a amostra e transfira para um recipiente apropriado. 
10. Limpe o moinho por inteiro usando ar comprimido e, ou, uma escova. Uma espátula fina e pontuda pode ser usada para desalojar partículas que ficam aderidas por detrás das facas. O moinho deve ser lavado quando for usado para moer certos tipos de amostras. Toalha seca ou ar comprimido deve ser usado para prevenir formação de ferrugem.
A maioria das amostras é moída com peneira de 1 mm. Se houver necessidade de moer grandes amostras, isso deve ser feito usando-se inicialmente peneira de 4 a 6 mm; elas devem ser remoídas usando peneira de 1 mm. As facas precisam ser afiadas periodicamente. O alinhamento adequado das facas na reinstalação é fundamental para se assegurar uma moagem eficiente. O pó proveniente da moagem poderá se acumular no compartimento que aloja o motor, devendo este ser limpo periodicamente.
Moagem usando moinho ciclone
1. Inspecione o moinho para cuidadosa limpeza.
2. Insira a peneira apropriada no moinho.
3. Coloque a tampa apropriada. Use a tampa de forragem para qualquer amostra que foi seca em estufa.
4. Insira o recipiente coletor de amostra moída no lugar apropriado. Ligue o moinho no interruptor elétrico.
5. Alimente lentamente o moinho com amostra, tomando cuidado para não sobrecarregá-lo. Use um funil para alimentar o moinho no caso de amostras de forragens.
6. Se o recipiente coletor de amostra moída encher antes que toda a amostra tenha passado, desligue o moinho e esvazie o conteúdo do recipiente coletor de amostra moída em um vasilhame limpo e continue moendo a amostra.
7. Depois que quase toda a amostra tenha passado, pressione com a palma da mão sobre a abertura da tampa. Mantenha a abertura fechada por aproximadamente 5 segundos e então libere. Isso forma um vácuo dentro da câmara de moagem do moinho, que ajuda na limpeza de amostra residual. Desligue o interruptor elétrico do moinho.
8. Misture bem a amostra e transfira-a para recipiente apropriado.
9. Remova a tampa e peneira e limpe o moinho, usando uma escova e ar comprimido. O impulsor pode ser limpo com uma toalha.
Algumas amostras devem conter menos de 85% de matéria seca para que possam ser moídas corretamente em moinho ciclone com peneira de 1 mm. Deve-se tomar cuidado com o moinho ciclone, para não aquecer a amostra durante o processo de moagem. O aquecimento poderá mudar a análise química.
Determinação da matéria seca
Princípio
A umidade é eliminada da amostra pela secagem em estufa com circulação forçada de ar à temperatura de 55 oC por 16 a 24 horas (pré- secagem ), a 135 oC por duas horas, ou 100 oC por 24 horas, ou 105 oC por 16 horas (secagem definitiva). A matéria seca parcial (pré-secagem) ou total (secagem definitiva) é determinada gravime-tricamente com o resíduo remanescente após a secagem. No forno de microondas, a umidade é eliminada da amostra pela radiação em microondas e a matéria seca parcial (pré-secagem) ou total (secagem definitiva) é determinada gravimetricamente com o resíduo remanescente após a secagem.
Considerações Gerais
A determinação da Matéria Seca (MS) é o ponto de partida da análise dos alimentos. É de grande importância, uma vez que a preservação do alimento pode depender do teor de umidade presente no material; além disso, quando se compara o valor nutritivo de dois ou mais alimentos, é necessário levar em consideração os respectivos teores de matéria seca. No entanto, se se deseja comparar o resultado de análises realizadas em diferentes épocas, locais ou regiões, sempre se faz essa comparação em base da matéria seca, isto é, como se o alimento contivesse 100% de matéria seca.
A água contida nos alimentos encontra-se nas seguintes formas: livre, de estrutura e de constituição.
A água livre é aquela que não está ligada a nenhuma estrutura molecular dentro da célula, isto é, encontra-se em estado livre e é relativamente fácil de ser eliminada. Constitui a maior fração de água existente nos alimentos. As demais formas de águas existentes nas forrageiras e nos alimentos concentrados são denominadas estrutural e de constituição, e, apesar da importância no aspecto físico-químico, não apresentam valores no aspecto prático, em razão dos baixos teorescom que estão presentes.
A umidade pode ser determinada por dois processos: indireto e direto. No primeiro, o que se determina é a matéria seca, admitindo-se que a perda de peso corresponda ao peso da água perdida. Erros ocorrem quando a amostra é insuficientemente seca, antes de se tomar o peso final ou quando a amostra é superaquecida e substâncias voláteis, além da água, são volatilizadas, como, por exemplo, substâncias voláteis presentes nas silagens. Na realidade, estas substâncias voláteis são eliminadas junto com a água, ocasionando algum erro, o que vem a ser uma desvantagem do método. 
Os termos "como fornecido” ou "matéria natural" referem-se à forragem, ou alimento, no estado em que ela é fornecida ou consumida pelo animal. Na linguagem laboratorial, estes termos referem- se ao conteúdo de umidade do alimento no momento da análise. O conteúdo de umidade de uma forragem no momento da análise pode ser diferente daquele que lhe tenha dado origem, caso tenha ocorrido perda de umidade entre a amostragem e a análise. A “amostra seca ao ar” (ASA) refere-se a uma amostra que foi seca ao ar, sem ajuda de estufa ou outro dispositivo secante. Em meio ambiente com umidade relativa menor que 60%, a maioria das amostras seca ao ar conterá em torno de 90% de matéria seca. A amostra "pré-seca ou parcialmente seca" refere-se à matéria seca inicial de uma amostra que foi seca em estufa, normalmente a 55 a 60 oC, ou em um forno de microondas a menos da secagem total. Para fins práticos, este procedimento é considerado igual ao da amostra seca ao ar. Estas amostras, com aproximadamente 90% de matéria seca, podem ser moídas facilmente na maioria dos moinhos de laboratório, a fim de produzir uma amostra homogênea para subseqüentes análises. A "secagem definitiva ou matéria seca total" diz respeito ao conteúdo de matéria seca total de uma amostra que já foi parcialmente seca, ao ar ou em estufa. Os termos secagem definitiva, matéria seca total ou matéria seca referem-se a uma amostra que tem toda a sua umidade removida.
As análises de forragem e alimentos devem ser comparadas na base da matéria seca, porque a variação nos conteúdos de umidade das forragens ou dos alimentos pode mudar entre regiões e dificultar as comparações.
Em geral, o processo consiste em duas fases: secagem prévia, ou pré-secagem, e secagem definitiva.
Equipamentos e Materiais
- Balança analítica, com precisão de 0,0001 g.
- Dessecador.
- Estufa com circulação forçada de ar. 
A estufa deve ser equipada com prateleiras vazadas, para permitir a circulação do ar, possuir sistema de ventilação e funcionar com ventiladores abertos, além de indicador de temperatura.
- Forno de microondas.
Forno de microondas com mínimo de 600 watts e possível plataforma giratória.
- Recipientes.
Pré-secagem – ou secagem parcial, é necessária quando a amostra possui geralmente alto teor de umidade ou baixa matéria seca: gramíneas, silagens etc. Normalmente é feita em temperatura de 55 a 60 ºC, para evitar perda por volatilização de outros nutrientes, principalmente compostos nitrogenados, ou causar danos à proteína. Este procedimento tem efeito mínimo na composição química, permitindo que amostras possam ser posteriormente analisadas por seus outros componentes. A amostra a ser pré-seca deve ser equilibrada à temperatura ambiente por duas a quatro horas antes de se determinar a matéria pré-seca, com a finalidade de minimizar alterações da umidade que podem ocorrer durante o processo de moagem e de armazenamento. A secagem à temperatura baixa (menos de 60 ºC) não remove toda a água da amostra; portanto, a pré-secagem não representa a matéria seca total da amostra. 
A operação da pré-secagem deve ser feita de preferência em estufa com circulação forçada de ar a 55 ºC ou em forno de microondas com mínimo de 600 watts e plataforma giratória, de preferência. O seu tempo é variável: em média, 16 (durante a noite) ou 24 horas, ou em horas para o forno de microondas, dependendo da umidade e da carga que se coloca na estufa ou no forno de microondas, ou seja, o tempo suficiente para que o material apresente consistência quebradiça, permitindo moagem perfeita. A perda de água que se verifica na pré-secagem tem de ser computada no cálculo da umidade total; portanto, o material, antes de ser colocado na estufa, deve ser pesado em balança analítica adequada, com precisão de 0,1 mg (estufa) e 0,01 mg (forno de microondas). Para isso, coloca-se o material em um recipiente próprio [bandeja (22 x 16 x 6 cm) de tela bem fina ou sacos de papel perfurado ou forno de microondas (papel, vidros ou plásticos próprios para microondas, com 3,5 cm de profundidade)], suficiente para conter de 100 a 250 g de amostra grosseiramente triturada.
Procedimento
Pré-secagem utilizando estufa com circulação forçada de ar a 55 oC por 16 (durante a noite) ou 24 horas
1. Seque os recipientes (bandeja ou saco de papel) na estufa a 55 oC, por pelo menos duas (bandeja) ou oito horas (saco de papel).
2. Pese os recipientes e registre os pesos. 
3. Adicione um volume constante de amostra, grosseiramente triturada, em cada recipiente e registre os pesos dos recipientes com as amostras – baixa umidade: 70 a 130 g; alta umidade: 150 a 250 g.
4. Agite os recipientes com as amostras com suavidade, para uniformemente distribuir as amostras e expor o máximo de área à secagem.
5. Coloque os recipientes com as amostras na estufa a 55 oC e deixe secar por 16 (durante a noite) ou 24 horas.
6. Retire os recipientes com as amostras da estufa e deixe equilibrar ao meio ambiente por duas a quatro horas. Pese-os e registre os pesos.
Pré-secagem utilizando forno de microondas
1. Seque os recipientes no forno de microondas a 100% do poder total de radiação, por três minutos.
2. Pese os recipientes e registre os pesos.
3. Adicione 100 a 250 g de amostra, grosseiramente triturada, em cada recipiente e registre os pesos dos recipientes com as amostras – baixa umidade: 70 a 130 g; alta umidade: 150 a 250 g.
4. Coloque os recipientes com as amostras no forno de microondas a 100% do poder total de radiação por aproximadamente três minutos.
5. Remova os recipientes com as amostras e misture.
6. Repita os passos 4 e 5 duas vezes, para forragens com 50% de umidade, e três vezes, para forragens com 75% de umidade. 
7. Pare a secagem se estiver suficientemente seco (amostra friável, não úmida ao toque). Se não, retorne os recipientes com as amostras para o forno de microondas a 50% do poder total de radiação, por intervalos de um minuto, até a amostra não estar mais úmida ao toque. O objetivo é secar a amostra para se obter de 85 a 95% de matéria seca.
8. Deixe os recipientes com as amostras se equilibrarem à temperatura ambiente por duas horas. Pese-os e registre os pesos.
Recomenda-se colocar um béquer de 250 mL com água, no canto inferior esquerdo do microondas, para reduzir a possibilidade de as amostras serem queimadas ou danificadas.
Esse material é chamado de amostra pré-seca ou parcialmente seca, no qual se tentou imitar a secagem feita ao ar, ou seja, a amostra seca ao ar (ASA).
A seguir, fazer a moagem final, guardando a amostra em vidros próprios com tampas de polietileno, para as análises subseqüentes. Para comodidade das operações, os pesos poderão ser registrados em uma ficha, especialmente útil quando se trabalha com grande número de amostras, apresentadas no final do capítulo.
Deve-se ter em mente que para análises mais aprimoradas, como a de aminoácidos e de ácidos graxos, processos especiais de secagem são necessários, a fim de preservar a verdadeira forma química dos componentes. Dentre esses processos especiais, destacam-se a secagem a vácuo com ou sem elevação de temperatura e a secagem pelo frio (liofilização).
Substâncias voláteis, como a amônia, são encontradas em silagens e cama de galinheiro. Exigem-se cuidados especiais durante a secagem da amostra; a pré-secagem não deve ser superior a 55 ºC e, em muitoscasos, as determinações devem ser feitas no material natural.
Secagem definitiva – ou matéria seca total, é usada para amostras de forragem que foram submetidas à pré-secagem (aproximadamente 90% de matéria seca) ou com baixo conteúdo de substâncias voláteis: fenos, rações fareladas, grãos de cereais etc. 
A secagem definitiva deve ser feita de preferência em estufa com circulação forçada de ar a 135 ºC, 100 ºC ou 105 ºC, ou no forno de microondas, com o mínimo de 600 watts, com plataforma giratória de preferência. O seu tempo é variável: em média duas horas a 135 ºC, 24 horas a 100 ºC e 16 horas a 105 ºC (ou durante a noite), ou em horas para o forno de microondas, dependendo da umidade e da carga que se coloca na estufa ou no forno de microondas, ou seja, o tempo suficiente para que o material apresente peso constante. A perda de água que se verifica na secagem definitiva é a umidade total; portanto, o material, antes de ser colocado na estufa, deve ser pesado em balança analítica adequada, com precisão de 0,1 g (estufa) e 0,01 g (forno de microondas). Para isso, coloca-se o material em um recipiente próprio – latinha de alumínio (50 mm diâmetro, 40 mm de profundidade, com tampa) a 135 ºC, ou latinha de alumínio, cadinho de porcelana (forma baixa e diâmetro largo, 50 mL, com tampa), pesa-filtro (50 mL, com tampa) a 100 ºC ou 105 ºC, ou forno de microondas (papel, vidros ou plásticos próprios para microondas, com 3,5 cm de profundidade – suficiente para conter de 100 a 250 g de amostra finamente moída). As pesagens, inicial (recipiente) e final (recipiente e amostra), podem ser feitas a quente ou após esfriamento em dessecador.
Procedimento
Secagem definitiva utilizando estufa com circulação forçada de ar a 135 oC por duas horas
1. Seque os recipientes a 135 oC por pelo menos duas horas.
2. Coloque os recipientes no dessecador, feche-o e deixe a temperatura se equilibrar como a do meio ambiente até que esfriem. Não deixe que os recipientes permaneçam no dessecador por mais de três horas.
3. Pese os recipientes, removendo um de cada vez do dessecador e mantendo-o fechado entre as remoções dos recipientes.
4. Adicione aproximadamente 2 g de amostra moída aos recipientes. Registre os pesos dos recipientes com as amostras. O tamanho (peso) da amostra depende do tipo de material que se está analisando.
5. Agite os recipientes com as amostras com suavidade, para distribuir uniformemente as amostras e expor o máximo de área à secagem.
6. Coloque os recipientes com as amostras na estufa já pré-aquecida por duas horas, a 135 oC, e deixe secar por duas horas, após a estufa ter retornado à temperatura de secagem.
7. Coloque os recipientes com as amostras no dessecador, cubra-o e deixe equilibrar com o meio ambiente até que esfriem. Não deixe que os recipientes com as amostras permaneçam no dessecador por mais de três horas.
8. Pese os recipientes com as amostras e registre os pesos. 
As tampas dos recipientes devem ser pesadas juntamente com eles; os recipientes com as amostras devem permanecer abertos na estufa e fechados no dessecador.
Secagem definitiva utilizando estufa com circulação forçada de ar a 100 oC por 24 horas ou 105 oC por 16 horas
Método de pesagem a frio
O procedimento para realização é o mesmo que para a secagem definitiva utilizando estufa de ar forçado a 135 oC por duas horas, apenas com modificações nos passos 1 e 6, assim descritos:
1. Seque os recipientes a 100 oC (ou 105 oC) por pelo menos duas horas. Use a latinha de alumínio ou pesa-filtro quando estiver determinando somente umidade total da amostra ou use o cadinho de porcelana quando, após a determinação da umidade total da amostra, for também determinado o teor de cinzas no resíduo da secagem definitiva.
2. Coloque os recipientes com as amostras na a estufa já pré-aquecida por três horas a 100 oC (ou 105 oC) e deixe secar a 100 oC por 24 horas ou a 105 oC por 16 horas (durante a noite), após a estufa ter retornado à temperatura de secagem. 
As tampas dos recipientes devem ser pesadas juntamente com eles; os recipientes com as amostras devem permanecer abertos na estufa e fechados no dessecador.
Método de pesagem a quente 
O procedimento para realização é o mesmo que para a secagem definitiva utilizando estufa de ar forçado a 135 oC por duas horas, apenas com modificações nos passos 1, 2, 3 e 6, inclusão do passo 7 e exclusão do passo 8, assim descritos:
1. Seque os recipientes e mais três extras, que serão usados para esquentar a balança, a 100 ºC (ou 105 oC) por pelo menos duas horas. Use a latinha de alumínio ou pesa-filtro quando estiver determinando somente a umidade total da amostra, ou use o cadinho de porcelana quando, após a determinação da umidade total da amostra, for também determinado o teor de cinzas no resíduo da secagem definitiva.
2. Esquente a balança analítica, colocando seqüencialmente os três recipientes extras por 20 segundos cada. Pese os recipientes, removendo um de cada vez da estufa, e registre os menores pesos (assim que a balança se estabilizar, normalmente 15 segundos após o recipiente ter sido removido da estufa). Sempre que a pesagem for interrompida, a balança deve ser reesquentada, de acordo com o passo 2.
3. Deixe que a balança e os recipientes esfriem, após todos os recipientes terem sido pesados.
4. Coloque os recipientes com as amostras na estufa pré-aquecida por pelo menos três horas a 100 oC (ou 105 oC) e deixe secar por 24 horas a 100 oC ou 16 horas (durante a noite) a 105 oC, após a estufa ter retornado à temperatura de secagem.
5. Retire os recipientes com as amostras da estufa e pese a quente, como descrito nos passos 2 e 3. Registre os pesos.
Secagem definitiva utilizando o forno de microondas 
O procedimento para realização é o mesmo que para a pré-secagem, apenas com modificações nos passos 7 e 8 e com a inclusão do passo 9, assim descritos:
1. Pese os recipientes com as amostras e registre os pesos.
2. Coloque os recipientes com as amostras no forno de microondas a 50% do poder total de radiação, durante um minuto, e pese novamente os recipientes e as amostras, registrando os pesos.
3. Repita os passos 7 e 8 até que não ocorra nenhuma perda de peso durante os intervalos de secagem (peso constante). Pese os recipientes com as amostras e registre os pesos. 
Recomenda-se colocar um béquer de 250 mL com água no canto inferior esquerdo do microondas para reduzir a possibilidade de as amostras serem queimadas ou danificadas.
Certas rações ricas em gordura podem aumentar seu peso quando expostas a uma secagem demorada, uma vez que poderá haver fixação do oxigênio durante o processo. Nestes casos, é necessário usar processos especiais de secagem. As silagens e outras forragens submetidas à fermentação podem sofrer perdas de determinadas substâncias durante a secagem: ácidos orgânicos, amoníaco etc. Com estes materiais, o teor exato de matéria seca pode ser obtido pela determinação desses componentes voláteis ou, o que é mais prático, por secagem a vácuo.
Matéria seca total (MS) ou secagem definitiva. Método simplificado de uso no Laboratório de Nutrição Animal do DZO-UFV
Concluída a pré-secagem para forrageiras e, ou, amostras de alto teor de umidade, moídas e armazenadas em vidros hermeticamente fechados, procede-se da seguinte maneira:
1. Use balança analítica com precisão de 0,0001 g sobre bancada especial de laboratório e em ambiente climatizado (20-25 ºC). 
2. Use pesa-filtros bem limpos e que tenham permanecido de duas a três horas na estufa a 105 ºC; coloque-os em dessecador devidamente preparado, a fim de esfriá-los. Pese e registre os pesos. O ambiente do dessecador deve ser limpo e seco – faz-se uso de sílica-gel em seu interior. 
3. Pese, nos pesa-filtros, de 2 a 5 gramas da amostra, dependendo do tipo de material analisado: forrageiras (2 a 3 g) ou concentrados (3 a 5 g). São feitas, em geral, de duas a três repetições por amostra. 
4. Leve os pesa-filtros com amostrase pesos conhecidos à estufa a 105 ºC por pelo menos quatro horas. É comum, quando se trabalha com grande número de amostras, o pesquisador fazer as pesagens durante o dia e deixá-los na estufa durante toda a noite.
5. Após a permanência na estufa (pesa-filtro + amostra), coloque-os no dessecador. Atentar para que os pesa-filtros permaneçam sempre abertos (sem tampa) quando colocados na estufa e com as tampas quando no dessecador. 
Todos os dados ou pesos são anotados em folhas próprias, como apresentadas no final do capítulo; assim, procede-se aos cálculos da matéria seca e da umidade das amostras em estudo.
Amostras líquidas são previamente distribuídas em placas de Petri, tendo-se o cuidado de pesar maior quantidade de material. Evapora-se em banho de areia ao rubro e, por fim, completa-se a secagem na estufa.
Existe também o método “direto”, o qual se baseia na secagem das amostras em estufa de ar forçado, a 70 – 80 ºC, durante ( 48 h, tendo-se o cuidado de se proceder à pesagem das amostras, em sacos de papel ou bandejas, imediatamente após ser retirada da estufa, isto é, ainda quente. Este método fornece boa aproximação da matéria seca total, sem necessidade de calcular pré-secagem e secagem definitiva. É, portanto, de extrema utilidade quando não se precisa de grande exatidão na determinação da matéria seca total e quando há também considerável número de amostras, principalmente de forrageiras. É muito comum o pesquisador ter vários canteiros (blocos), desejando apenas conhecer a produção de matéria seca por hectare.
Cálculo da pré-secagem ou da amostra seca ao ar (ASA):
a. Cálculo da pré-secagem
Peso do material verde	 227,5 g
Peso do material pré-seco (após secagem a 60 ºC) e equilíbrio
com a umidade do ar 	100,5 g
Porcentagem da matéria pré-seca (ASA) = 100,5 x 100 = 44,18
 227,5
b. Cálculo da secagem definitiva
Peso do pesa-filtro vazio 	42,3031 g
Peso do pesa-filtro + amostra 	45,4961 g
Peso da amostra 	3,1930 g
Peso do pesa-filtro + amostra seca 	45,1541 g
Peso da amostra seca 	2,8510 g
% da matéria seca definitiva 
% da matéria seca da forrageira = (0,8929 x 0,4418) 100 = 39,45
% de umidade = 100,00 – 39,45 = 60,55
Determinação da matéria seca pelo método do Tolueno
Existe ainda, para o cálculo da umidade, o processo denominado direto, que é recomendado para determinação de umidade em forragens fermentadas (silagens) que contenham altos conteúdos de substâncias voláteis. Estas substâncias voláteis têm baixo ponto de vaporização e são perdidas quando as amostras são secas na estufa. O princípio básico é de que a água é desprendida (destilada) da amostra e capturada sob camada de tolueno. Neste caso, determina-se a quantidade da água diretamente. Esse procedimento consiste na destilação da amostra com tolueno em aparelho especial, que consta de um balão, onde se coloca a amostra em contato com o tolueno, um condensador e o tubo receptor, o qual possui uma escala graduada para medição do volume de água desprendida da amostra. A amostra passa por uma trituração grosseira, no caso de forrageira, e pesam-se, aproximadamente, de 5 a 10 g, ou seja, quantidade suficiente para fornecer 4 a 8 mL de água. Adiciona-se, em seguida, uma quantidade de tolueno suficiente para cobrir a amostra dentro do balão de 250 mL (75 mL de tolueno são suficientes). Iniciam-se o aquecimento e a destilação lentamente (duas gotas/segundo), até que a maior parte de água passe para o tubo graduado através da evaporação e condensação; nesse momento, aumentam-se o aquecimento e a velocidade de destilação (quatro gotas/segundo). Depois de ter sido retirada toda a água do material, lava-se o condensador, internamente, com tolueno, e continua-se o aquecimento forte por mais alguns minutos. O tempo necessário para completar o processo é de, aproximadamente, uma hora. Deixa-se o tubo receptor esfriar até a temperatura ambiente, para depois fazer a leitura final do volume da água. O processo está sujeito a erros, uma vez que não é muito fácil distinguir a exata separação da camada de água e do tolueno, que é também evaporado e condensado dentro do tubo receptor graduado. Para melhor acurácia, a água destilada da amostra deve ser analisada para substâncias voláteis que podem ser co-destiladas junto com a água.
A seguir, será apresentado um exemplo do cálculo da determinação da umidade pelo processo direto.
Peso da amostra da forrageira	 6,0 g
Leitura no tubo receptor 	4,0 g e, ou, 4,0 mL
% de matéria seca = 100,0 – 66,7 = 33,3%
Na Figura 1.1 é mostrado o determinador de umidade pelo processo de tolueno.
Figura 1.1 - Aparelho para determinação de umidade, com tolueno.
Veja, no final do capítulo, modelo de ficha para apresentação de resultados.
Referências Bibliográficas
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COLENBRANDER, V.F.; JOHNSON, K.D.; RHYKERD, C.L.; NOLLER, C.H. Use of microwave drying to determine moisture content in forage. Agronomy and Animal Science Forage. Purdue University Cooperative Extension Service, West Lafayette, 1987. 4 p.
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FENNER, H. Methods for determining fermentation products in acid preserved feeds and forages. Massachusetts Agricultural Experimental Station. Res. Bull, n. 691, p. 144, 1984.
GOERING, H. K.; VAN SOEST, P. J. Forage fiber analysis (apparatus, reagents, procedures, and some applications). Agricultural Handbook, nº 379, Washington, D. C., p. 20, 1970.
LENKEIT, W.; BECHER, M. Inspecção e apreciação de forragens. Lisboa: Ministério da Economia de Portugal, 1956. 152 p. (Boletim Pecuário, nº 2).
MERTENS, D.R. Determining dry matter in diverse types of feeds. Proc. NFTA Forage Analysis Workshop. Denver, Co.: [s.n.], 1993. p. 1993. B1-B10, 
VAN SOEST, P. J. Development of a comprehensive sistem of feed analysis and its application to foragens. J. Anim. Sci., v. 26, n. 1, p. 119-128, 1967.
�
Universidade federal de viçosa
departamento de zootecnia – cca
laboratório de nutrição animal
determinação da pré-secagem
	
Amostra
	Tara
(g)
	Tara + Amostra verde (g)
	Tara + ASA
(g)
	Amostra verde
(g)
	ASA (g)
	ASA (%)
	ASA1 X
	1
	101,5
	335,1
	174,3
	233,6
	72,8
	31,16
	
	2
	97,5
	385,4
	186,7
	287,9
	89,2
	30,98
	31,07
1 ASA – Amostra seca ao ar (55 ºC) – Pré-secagem.
determinação da Secagem DEFINITIVA
	Amostra
	Nº 
PF
	Peso 
pesa-filtro
(g)
	PF +
ASA
(g)
	PF +
ASE
(g)
	ASA
(g)
	MS
(g)
	ASE
(%)
	ASA
(%)
	MS
(%)
	MS1 
	1
	a
	39,9714
	42,4826
	42,3446
	2,5112
	2,3732
	94,50
	
	29,4
	
	2
	b
	40,3023
	43,3832
	43,2151
	3,0809
	2,9128
	94,54
	31,07
	29,4
	
	3
	c
	38,3958
	40,7358
	40,6068
	2,3400
	2,2110
	94,49
	
	29,4
	
	
	
	
	
	
	
	
	=94,51
	
	
	29,4
PF = Pesa-filtro; ASE = Amostra seca na estufa (105 ºC)1.
�
�
Capítulo 2
Determinação de Gordura Bruta ou do Extrato Etéreo
Princípio
Este método é aplicável na determinação de gordura bruta de forragens secas ou mistura de alimentos, mas não é adequado para sementes oleaginosas, rações líquidas ou alimentos que contêm produtos lácteos.
Gorduras, óleos, pigmentos e outras substâncias gordurosas solúveis contidas em uma amostra seca serão dissolvidos através da extração com éter, o qual é, então,evaporado desta solução gordurosa. O resíduo resultante é pesado, sendo chamado de extrato etéreo ou gordura bruta. O éter e as amostras devem estar livres de umidade, para evitar a co-extração de componentes solúveis em água presentes na amostra, como carboidratos, uréia, ácido láctico, glicerol etc. Se componentes solúveis em água estiverem presentes em grande quantidade na amostra, eles deverão ser eliminados da amostra antes da secagem. Baixas temperaturas são usadas na evaporação do éter e remoção da umidade residual, a fim de prevenir a oxidação da gordura. O éter usado no processo é aquecido até se tornar volátil e, ao condensar-se, circula sobre a amostra em análise, arrastando toda a fração gordurosa e demais substâncias solúveis em éter. Este é recuperado em outro recipiente, enquanto a gordura extraída é calculada por diferença de pesagem. 
Considerações Gerais
As gorduras ou lipídios são substâncias insolúveis em água, mas solúveis no éter, clorofórmio, benzeno e em outros solventes orgânicos chamados de extratores. O grupo inclui as gorduras e muitos outros compostos intimamente ligados ou associados, como fosfatídeos, esteróis (colesterol), clorofila, óleos voláteis, resina, pigmentos etc.
A gordura constitui a fração mais energética dos alimentos e, como os carboidratos, é composta de carbono (C), hidrogênio (H) e oxigênio (O). Entretanto, a proporção dos dois primeiros (C e H) é bem maior nas gorduras que nos carboidratos, como indica o Quadro 1.2.
Quadro 1.2 - Porcentagens de carbono, hidrogênio e oxigênio nas gorduras e nos carboidratos (amido)1
	
	Carbono
	Hidrogênio
	Oxigênio
	Gordura
	77
	12
	11
	Amido
	44
	6
	50
1 Maynard e Loosli (1984).
O valor alimentar do extrato etéreo não é constante. Considera-se que um grama de gordura produz 9,35 kcal de energia bruta, quando medida na bomba calorimétrica, o que corresponde, aproximadamente, a 9 kcal de energia metabolizável. Os alimentos com maior teor de gordura têm valores mais altos de NDT, pelo fato de a gordura fornecer 2,25 vezes mais energia que os carboidratos.
A riqueza em gordura pode influenciar o armazenamento de alguns produtos, uma vez que a gordura dos alimentos constitui uma fração bastante instável, pois alimentos ricos em tal substância rancificam-se facilmente. Os alimentos rancificados perdem grande quantidade de certos nutrientes essenciais, como as pró-vitaminas A e D, o caroteno, o complexo B etc., e alguns ácidos graxos podem sofrer destruição oxidativa. O processo de rancificação poderá chegar a ponto de grande aquecimento e à combustão do material.
Equipamentos e Materiais 
- Aparelho para extração de gordura tipo Goldfisch, unidade com seis extratores, equipado com suporte para cartucho de vidro e tubos coletores de éter ou Soxhlet.
- Aparelho banho-maria, com temperatura controlada (opcional).
- Balança analítica, com precisão de 0,0001g.
- Béqueres, próprios para extração de gordura, com bordas, numerados, 50 x 85 mm.
- Cartucho extrator de cerâmica ou celulose, porosidade grossa.
- Dessecador.
- Estufa de secagem por convecção a 105 ºC.
- Papel-filtro Whatman nº 1, 11 cm, ou equivalente.
Reagentes (usar reagentes puros para análise – p. a.)
1. Método a quente – É assim chamado porque a extração é feita com a temperatura mais elevada, usando, no caso, um éter de petróleo cujo ponto de ebulição esteja entre 40 e 60 ºC. A extração é realizada em 4 ou 16 horas no extrator tipo Goldfisch, dependendo da taxa de condensação. 
2. Método a frio – Faz-se a extração no extrator Soxhlet e usa-se o éter sulfúrico como solvente, cujo ponto de ebulição é de cerca de 35 ºC. É feita em 24 horas, aproximadamente.
Cuidados com os solventes – Em qualquer método, deve-se ter o máximo de cuidado com os reagentes. Freqüentemente, certas impurezas ocorrem nos solventes: água, álcool e oxidantes (peróxidos), que acarretam erros nas análises. Assim, devem ser usados apenas reagentes p.a. O éter de petróleo deve ser substituído pelo éter dietílico anidro na extração de gordura de forragens, pois este não dissolve todas as substâncias lipídicas presentes nas forrageiras.
Procedimento
Secagem da amostra
1. Pese de 1,5 a 2 g de amostra em cartucho extrator ou em cartucho extrator preparado com filtro de papel. Amostras que contenham grande quantidade de carboidratos, uréia, glicerol, acido lático ou componentes solúveis em água exigem modificações, como se segue: pese 2 gramas de amostra, coloque em filtro de papel Whatman nº 1, 11 cm, ou equivalente. Lave com 100 mL de água destilada (20 mL, por vez), embrulhe em papel-filtro a amostra em forma de cartucho. 
2. Seque em estufa a 100 ºC, durante cinco horas. 
3. Seque os béqueres numerados, próprios para determinação de gordura, por pelo menos uma hora a 100 ºC. Esfrie em dessecador, pese e registre o peso. 
4. Remova as amostras da estufa para o dessecador após o período de secagem.
Extração
1. Alinhe os béqueres em frente dos extratores e combine os cartuchos de vidro com os cartuchos extratores contendo as amostras com os béqueres correspondentes.
2. Coloque os cartuchos de vidro e os cartuchos extratores contendo as amostras no suporte de cartuchos de vidro do extrator.
3. Adicione cerca de 40 mL de éter dietílico anidro a cada béquer.
4. Usando luvas, coloque o béquer na braçadeira de rosca do extrator e aperte. 
5. Posicione os aquecedores. Deixe espaço, em torno de 0,5 cm, entre o béqueres e os aquecedores.
6. Ligue os interruptores elétricos dos aquecedores, do poder central e o do condensador de água. 
7. Após ter começado a ebulição do éter, verifique se não há vazamento dele durante sua ebulição e condensação. 
8. Extraia por no mínimo 4 horas, com os aquecedores ajustados para a máxima temperatura (velocidade de condensação de 5 a 6 gotas por segundo) ou por 16 horas em temperatura baixa (velocidade de condensação de 2 a 3 gotas por segundo).
9. Após a extração, abaixe os aquecedores, desligue os interruptores elétricos dos aquecedores e do condensador de água e permita que o éter escoe para fora dos dedais de vidro (cerca de 30 minutos).
Destilação do éter e pesagem do resíduo de gordura
1. Remova os dedais de vidro e enxágüe o suporte com uma pequena porção de éter dietílico de uma pisseta. Prenda os tubos coletores de éter no suporte e recoloque os béqueres na braçadeira com rosca e aperte. 
2. Reposicione os aquecedores e ligue o interruptor-chave dos aquecedores e do condensador de água. Destile, usando os aquecedores à temperatura máxima. Observe de perto.
3. Destile até que uma camada fina de éter permaneça no fundo do béquer e abaixe a temperatura. Não permita que os béqueres entrem em ebulição a seco; o superaquecimento irá oxidar a gordura. Quando terminar o último béquer, desligue a chave dos aquecedores e do condensador de água.
4. Enxugue o exterior dos béqueres com uma toalha de náilon à medida que eles são removidos do extrator.
5. Esvazie os tubos coletores de éter em recipientes de éter dietílico usado.
6. Coloque os béqueres em capela operacional, para terminar a evaporação do éter. O banho-maria poderá ser usado para agilizar o processo. Os béqueres devem permanecer na capela operacional até que todo o éter tenha sido evaporado.
7. Coloque os béqueres em estufa de secagem por convecção a 105 ºC. Cuidado, se um béquer for colocado na estufa ainda com éter, poderá ocorrer explosão.
8. Seque por 30 minutos, não mais. Secagem excessiva pode oxidar a gordura e fornecer resultados elevados.
9. Esfrie à temperatura ambiente em dessecador e pese, registrando o peso. A diferença entre este último peso e o do béquer vazio corresponde ao peso da gordura extraída.
Os resíduos que ficarem nos cartuchos, ou recipientes, de papel podem ser usados para analisar a fibra bruta. 
Veja, no final do capítulo, modelo de ficha para apresentação de resultados.
Referências Bibliográficas
ASSOCIATION OF OFFICIALANALYTICAL CHEMISTS - AOAC. Official methods of analysis. 15.ed. Washington D. C., 1990. 1141 p.
HARROS, L.E. Os métodos químicos e biológicos empregados na análise de alimentos. Gainesville, Flórida, USA: Univ. da Flórida, 1970. Paginação descontínua.
MAYNARD, L. A.; LOOSLI, J. K.; HINTZ, H. F.; WARNER, R. G. Nutrição animal. 3.ed. Tradução para o Português de Antônio B. N. Figueiredo F.º Rio de Janeiro: Livraria Freitas Bastos, 1984. 736 p.
�
DETERMINAÇÃO DA GORDURA BRUTA OU EXTRATO ETÉREO
	Amostra
	Tara
	Tara
	
	
	
	
	Peso
	Copo
	Peso
	Gordura
	Gordura
	
	
	+
	ASA
	ASE
	MS
	Copo
	copo
	+
	gordura
	MS
	M. natural1
	
	
	ASA
	(g)
	(%)
	(g)
	Nº
	(g)
	Gordura
	(g)
	(%)
	(%)
	
	
	(g)
	
	
	
	
	
	(g)
	
	
	
	1
	0,7280
	3,2958
	2,5678
	94,51
	2,4268
	1
	58,2705
	58,3101
	0,0396
	1,63
	0,48
	2
	0,7152
	3,007
	2,2925
	94,51
	2,1666
	2
	58,9086
	58,9408
	0,0322
	1,49
	0,44
	3
	0,7526
	3,0238
	2,2712
	94,51
	2,1465
	3
	63,0616
	63,0616
	0,0350
	1,63
	0,48
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
1 A matéria seca no material natural é de 29,4%.
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Capítulo 3
Determinação da Fibra Bruta
Princípio
A amostra seca e desengordurada é submetida às digestões ácida (H2S04 – 1,25%) e básica (Na0H – 1,25%) durante 30 minutos em cada digestão. O resíduo orgânico é recebido em cadinho de vidro. Calcula-se a fibra bruta pela diferença de peso do cadinho antes e após a queima do resíduo em mufla, a 500 ºC.
Considerações Gerais
Sob o termo fibra bruta encontram-se as frações de celulose e lignina insolúvel.
Fibra bruta é a parte dos carboidratos resistente ao tratamento sucessivo com ácido e base diluídos, representando a grande parte da fração fibrosa dos alimentos.
A maior fração da fibra bruta, a celulose, é bem aproveitada pelos ruminantes, uma vez que os microrganismos do rúmen são capazes de desdobrá-la, formando ácidos graxos voláteis, que são fonte de energia para esses animais. Além dos ruminantes, outras espécies também aproveitam a fibra bruta com maior ou menor eficiência. Ela é também responsável pelo bom funcionamento dos intestinos, estimulando seus movimentos peristálticos.
Equipamentos e Materiais
- Aparelho digestor para determinação de fibra bruta.
- Balança analítica, com precisão de 0,0001 g.
- Béquer de 600 mL, forma alta.
- Cadinho filtrante, forma alta, porosidade grossa, 50 mL.
- Estufa com circulação forçada de ar, com temperatura controlada.
- Forno mufla, com temperatura controlada.
- Funil de porcelana Buchner, com diâmetro médio de ( 12 cm.
- Papel de tornassol azul.
- Sistema de vácuo.
Reagentes (usar reagentes analíticos, não necessariamente p.a.)
1. Acetona (C3H6O).
2. Ácido sulfúrico (H2 SO4) [96 – 98%].
3. Álcool etílico (C2H5OH).
4. Álcool octílico (C8H18O) ou amílico (C5H12O) ou solução antiespumante (silicone).
5. Hidróxido de sódio (NaOH).
Soluções 
Solução de ácido sulfúrico 1,25% (0,255 N)
- Em um balão volumétrico de 1.000 mL, contendo aproximadamente 500 mL de água destilada, adicione 7 mL de H2SO4. Deixe esfriar, complete o volume e homogenize. Padronize a normalidade utilizando uma base-padrão de NaOH 0,2 N para 0,255 N ± 0,003.
Solução de hidróxido de sódio 1,25% (0,313 N)
- Em um béquer com água destilada solubilize 12,5 gramas de NaOH, transfira quantitativamente para um balão volumétrico de 1.000 mL. Deixe esfriar, complete o volume e homogenize. Padronize a normalidade utilizando um ácido-padrão de H2SO4 0,2 N para 0,313 N ± 0,003
Procedimento 
1. Pese de 2 a 3 g de amostra seca ao ar e previamente desengordurada ou não, dependendo do seu teor de gordura (>1%). A prática ensina que, para forrageiras, de modo geral, não há necessidade de desengordurar a amostra.
Digestão ácida
1. Coloque a amostra em béquer de 600 mL. Adicione 200 mL de H2S04 a 1,25%, fervente, e algumas gotas de antiespumante e coloque o béquer no aparelho digestor.
2. Digira em refluxo por 30 minutos, exatamente, após o início da ebulição.
3. Filtre quantitativamente, sob vácuo, em funil Buchner com tela de náilon (ou aço inox ou poliéster), fazendo-se lavagens sucessivas com água destilada quente sobre o resíduo até a neutralização do material, o que é verificado com o papel de tornassol azul. 
Digestão básica
1. Transfira quantitativamente o resíduo retido na tela de náilon para o béquer de 600 mL, usando-se para isso 200 mL da solução de NaOH a 1,25%, fervente, e algumas gotas de antiespumante. Coloque o béquer no aparelho digestor.
2. Digira em refluxo por 30 minutos, exatamente, após o início da ebulição.
3. Filtre quantitativamente, sob vácuo, em cadinho filtrante, [previamente seco a 105 ºC por duas horas, pesado a quente ou esfriado em dessecador até equilibrar com o ambiente], fazendo-se lavagens sucessivas com água destilada quente sobre o resíduo até a neutralização do material - use papel de tornassol azul.
4. Lave o resíduo com álcool (20 mL) e, posteriormente, com acetona (20 mL), a fim de facilitar a secagem e eliminar compostos provenientes das digestões.
5. Seque os cadinhos filtrantes com os resíduos em estufa a 105 ºC (4 a 6 horas ou durante a noite). Retire e pese a quente ou leve-os ao dessecador para esfriar e equilibrar com o ambiente. Pese e registre os pesos. 
6. Coloque os cadinhos filtrantes com os resíduos na mufla a 500 ºC, durante duas horas. Desligue a mufla, deixando a temperatura baixar para 250 ºC, retire os cadinhos filtrantes com os resíduos para estufa a 105 ºC, deixe equilibrar a temperatura da estufa e pese a quente ou leve-os ao dessecador para esfriar até equilíbrio com o ambiente. Pese e registre os pesos. A diferença de peso, antes e após a queima, fornece o peso da fibra bruta das amostras.
Recomendações
- Use as soluções de H2S04 e Na0H com título exato (H2S04 0,255 N e Na0H 0,313 N).
- Observe o tempo de digestão, que deve ser exatamente de 30 minutos, iniciando a fervura um minuto após as amostras entrarem em contato com o ácido e, ou, com a base.
- As filtrações sob vácuo devem ser efetuadas o mais rápido possível, sem deixar o material esfriar, e as lavagens devem ser feitas com água quente.
- Material rico em gordura deve ser previamente desengordurado, para evitar excesso de saponificação da gordura durante a hidrólise básica e, conseqüentemente, prevenir a formação de espuma.
Veja, no final do capítulo, modelo de ficha para apresentação de resultados.
Referências Bibliográficas
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC. Official methods of analysis. 15.ed. Washington D. C., 1990. 1141 p.
HARRIS, L. E. Os métodos químicos e biológicos empregados na análise de alimentos. Gainesville, Flórida, USA: Univ. da Flórida, 1970. Paginação descontínua.
VAN SOEST, P. J. Development of a comprehensive system of feed analysis and its application to forage. J. anim. Sci., v. 26, n. 1, p. 119-128, 1967.
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DETERMINAÇÃO DA FIBRA BRUTA
	Amostra
	Tara
	Tara
	
	
	Cadinho
	Cadinho
	Peso
	Fibra
	ASE
%
	Fibra
	Fibra
M. natural1
%
	
	
	+
	ASA
	Nº do
	+
	+
	fibra
	ASA
	
	MS
	
	
	
	ASA
	(g)
	cadinho
	Resíduo
	Cinza
	(g)
	%
	
	%
	
	
	
	(g)
	
	
	(g)
	(g)
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	1
	0,2830
	1,3009
	1,0179
	1
	25,8682
	26,2265
	0,3583
	35,20
	
	37,05
	10,56
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	2
	0,2782
	1,2885
	1,2885
	2
	23,5045
	23,8547
	0,3502
	34,66
	95,9
	36,48
	10,40
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	3
	0,2800
	1,3144
	1,0344
	3
	27,9348
	28,2970
	0,3622
	35,02
	
	36,86
	10,51
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
1 A matéria seca no material natural é de 28,5%.
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Capítulo4
Determinação da Celulose
Princípio
O método baseia-se na dissolução de todos os componentes da amostra, com exceção da celulose e dos minerais, por meio de um reagente ácido específico.
Considerações Gerais
Na realidade, o termo fibra bruta é empírico e engloba a fração da celulose e da lignina. Sabe-se que parte da fração da lignina é dissolvida nas hidrólises ácida e básica durante o processo de determinação da fibra bruta, indo essa fração fazer parte do extrato não-nitrogenado (ENN), que se calcula por diferença. Sabe-se, também, que aproximadamente 97% da fibra bruta é composta de celulose e lignina, sendo a maior fração a da celulose. Assim, uma informação mais exata sobre o teor de celulose e de lignina dos alimentos seria obtida pela determinação direta de cada uma dessas frações.
Na determinação do teor de celulose e de lignina das forrageiras, observa-se que sua soma é sempre maior que o teor de fibra, isso porque, como dito, na determinação da fibra bruta, parte da celulose e da lignina é dissolvida durante as hidrólises ácida e básica.
Sabe-se que os ruminantes desdobram a celulose, por meio de sua flora bacteriana, até os ácidos graxos voláteis (AGVs), principalmente ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico. A fermentação da celulose se processa no rúmen-retículo por intermédio de bactérias e protozoários ali existentes.
Em termos de aproveitamento pelos ruminantes, a celulose é igual ao amido. Durante muito tempo, os AGVs foram considerados subprodutos, sem maior importância. Em 1952, descobriu-se que eles são a maior fonte de energia para os ruminantes, quando alimentados à base de forragem. Os três principais AGVs estão assim constituídos, em termos do total de ácidos graxos produzidos no rúmen: ácido acético, de 54 a 74%; ácido propiônico, de 16 a 27%; e ácido butírico, de 6 a 15%.
Equipamentos e Materiais 
- Aparelho banho-maria, com temperatura controlada.
- Balança analítica, com precisão de 0,0001g.
- Cadinho filtrante, porosidade grossa, com capacidade de 50 mL.
- Estufa com circulação forçada de ar, com temperatura controlada.
- Forno mufla, com temperatura controlada.
- Sistema de vácuo.
Reagentes (usar reagentes analíticos, não necessariamente p.a.)
1. Ácido acético glacial (C2H3N).
2. Ácido nítrico (HNO3) [90%].
3. Álcool etílico (C2H10O) [96 – 98%].
4. Benzeno (C6H6).
5. Éter sulfúrico (etílico).
Soluções
- Solução reagente ácido
Em um balão de 1.000 mL, adicione 800 mL de ácido acético glacial, 200 mL de água destilada e 100 mL de ácido nítrico concentrado.
Procedimento
1. Pese aproximadamente 1 g da amostra seca ao ar em tubo de ensaio (usam-se 3 cm ( e 16 cm de altura).
2. Adicione 16,5 mL de solução reagente ácido ao tubo de ensaio com a amostra, tampe com bola de vidro e o leve ao banho-maria, em ebulição, durante 30 minutos. Esta fase é chamada de digestão das proteínas e dos carboidratos (ácidos digeríveis).
3. Retire os tubos do banho-maria após a digestão, adicione 20 mL de etanol (álcool etílico) e deixe-os esfriar.
4. Filtre quantitativamente, sob vácuo, em cadinho filtrante [previamente seco a 105 ºC por duas horas, pesado a quente ou esfriado em dessecador até equilibrar com o ambiente]. O uso de uma pisseta contendo álcool ajuda a transferir o resíduo quantitativamente para cadinho filtrante.
5. Lave os resíduos com 20 mL de etanol quente, a seguir, com 20 mL de benzeno quente e, finalmente, com 20 mL de éter sulfúrico.
6. Seque os cadinhos filtrantes com os resíduos em estufa a 105 ºC (4 a 6 horas ou durante a noite). Retire e pese a quente ou esfrie em dessecador até equilibrar com o ambiente. Pese e registre os pesos.
7. Coloque os cadinhos filtrantes com os resíduos na mufla e ligue-a, até atingir 500 ºC, permanecendo nesta temperatura durante duas horas. Desligue a mufla e deixe a temperatura baixar para 250 ºC, retire os cadinhos filtrantes com os resíduos para estufa a 105 ºC, deixe equilibrar a temperatura da estufa e pese a quente ou leve-os ao dessecador para esfriar ate equilíbrio com o ambiente. Pese e registre os pesos. A diferença de peso, antes e após a queima, fornece o peso da celulose das amostras.
Veja, no final do capítulo, modelo de ficha para apresentação de resultado.
Referências Bibliográficas
ANNISON, E. F.; LEWIS, D. Metabolism in the rumen. London: Methuen Co. Ltd., 1959. 184 p.
CRAMPTON, E. W.; MAYNARD, L. A. The relation of cellulose and lignin content to the nutritive value of animal feeds. J. Nutrition, v. 15, n. 4, p. 383-395, 1938.
HARRIS, L. E. Os métodos químicos e biológicos empregados na análise de alimentos. Gainesville, Flórida, USA: Univ. da Flórida, 1970. Paginação descontínua.
PHILLIPSON, A. T. Physiology of digestion and metabolism in the ruminant. England: Oriel Press Ltd., 1970. 636 p.
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DETERMINAÇÃO DA CELULOSE
	Amostra
	Tubo
N
	Tara
(g)
	Tara
+
ASA
(g)
	ASA
(g)
	Cadinho
	Celulose
(g)
	Celulose
ASA
(%)
	ASE
(%)
	Celulose
MS
%
	Celulose
M. natural1
%
	
	
	
	
	
	Nº
	Resí-duo
(g)
	Cinza
(g)
	
	
	
	
	
	1
	1
	0,1775
	1,1163
	0,9388
	1
	22,8000
	22,5001
	0,2999
	31,94
	94,51
	33,79
	9,93
	2
	2
	0,1778
	1,7264
	1,5486
	2
	24,1073
	23,5937
	0,5136
	33,17
	94,51
	33,09
	10,31
	3
	3
	0,1780
	1,2871
	1,1091
	3
	28,3994
	28,0470
	0,3524
	31,77
	94,51
	33,61
	9,88
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
1 A matéria seca no material natural é de 29,4%.
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Capítulo 5
Determinação do Nitrogênio Total e da Proteína Bruta 
Princípio
O método Kjeldahl é o método-padrão de determinação de nitrogênio (N), principalmente em forragens. Ele consiste em três passos básicos: 1) digestão da amostra em ácido sulfúrico com um catalisador, que resulta em conversão do nitrogênio em amônia; 2) destilação da amônia em uma solução receptora; e 3) quantificação da amônia por titulação com uma solução-padrão.
As proteínas e outros compostos nitrogenados são decompostos na presença do ácido sulfúrico concentrado, a quente, com produção de sulfato de amônio. O sulfato de potássio ou de sódio é adicionado, a fim de aumentar o ponto de ebulição do ácido sulfúrico, apressando a digestão. Outros compostos, como sulfato de cobre, selênio etc., também ajudam na digestão da matéria orgânica.
O sulfato de amônio resultante, na presença da solução concentrada de hidróxido de sódio, libera amônia, que é recebida na solução de ácido bórico, titulada com ácido sulfúrico ou clorídrico de título conhecido; assim, determina-se o teor de nitrogênio da amostra. Para o cálculo da proteína bruta, basta multiplicar o resultado pelo fator 6,25.
O método de determinação de nitrogênio por combustão baseia-se na liberação do nitrogênio por combustão em alta temperatura em oxigênio puro, sendo este medido por condutividade térmica e convertido em equivalente de proteína por fator numérico apropriado.
Considerações Gerais
O termo proteína bruta envolve grande grupo de substâncias com estruturas semelhantes, porém com funções fisiológicas muito diferentes. Com base no fato de as proteínas terem porcentagem de nitrogênio quase constante, em torno de 16%, o que se faz é determinar o nitrogênio e, por meio de um fator de conversão, transformar o resultado em proteína bruta. No método Kjeldahl, que é o mais usado, determina-se o nitrogênio contido na matéria orgânica, incluindo o nitrogênio protéico propriamente dito e outros compostos nitrogenados não-protéicos, como aminas, amidas, lecitinas, nitrilas e aminoácidos. Neste caso, o resultado será dado como proteína bruta.
Quando se quer determinar o nitrogênio total, incluindo os nitratos e nitritos, tem-se que reduzi-los com redutores mais fortes e depois seguir algum método específico para aqueles compostos (NELSON et al., 1954; WOOLLEY et al., 1960).
Quando se deseja determinaro nitrogênio contido na amostra, que se apresenta em forma de proteína verdadeira, precipita-se a proteína com reagentes específicos, como ácido wolfrâmico, cloreto de estanho II, mistura de CuSO4 + NaOH 1,25% etc. A proteína precipitada é então separada por filtração. Normalmente, determina-se o nitrogênio não-protéico no filtrado, determinando-se, indiretamente, a proteína verdadeira (RENA e MASCIOTTI, 1976). Para os casos mais específicos, faz-se o exame qualitativo e quantitativo dos aminoácidos contidos na fração nitrogenada.
A maior parte do nitrogênio na planta está em forma de aminoácidos, formando proteína, a qual é parte do protoplasma. Análises de gramíneas e leguminosas mostram que a proporção de nitrogênio-amínio varia de 52 a 83% do nitrogênio total, e os valores maiores foram obtidos em leguminosas. A proporção do nitrogênio total, presente na forma de nitrogênio não-protéico, varia de 23 a 30%. Do nitrogênio não-protéico, cerca de 47 a 64% está na forma de peptídeos e aminoácidos livres. O nitrogênio não-protéico, bem como os outros compostos nitrogenados da planta, varia com o estádio de crescimento, nível de fertilização, variedade etc.
As amidas são amplamente distribuídas nas plantas, sendo as mais comuns a asparagina e a glutamina. Análises de gramíneas leguminosas revelaram que 4,5 a 13% do nitrogênio não-protéico está na forma de amida. Algumas aminas, como metilamina e etanolamina, foram também encontradas em plantas.
As bases nucléicas são também encontradas nas plantas e correspondem a cerca de 6% do total de nitrogênio das gramíneas. Outros compostos orgânicos nitrogenados das plantas são betaínas, (-mercaptoaminas, colinas fosfoliídeos e alcalóides.
Inúmeros compostos nitrogenados inorgânicos estão também presentes na planta, dentre eles o nitrogênio não-protéico, na forma de nitrato a 4-9% do nitrogênio não-protéico. Naturalmente, estes teores dependem do nível de fertilização, do estádio de crescimento, da estação do ano etc.
O total do nitrogênio sob as formas de aminoácidos livres, peptídeos, amidas, amônia, nitrato, purinas, betaína e colina corresponde de 78 a 88% do nitrogênio não-protéico das plantas gramíneas e leguminosas.
Determinação do Nitrogênio Total
Existem vários métodos para dosar o nitrogênio, sendo o método clássico, inicialmente descrito em 1837, o de Dumas. Neste processo, o nitrogênio contido no material era transformado em nitrogênio gasoso e a medição deste era feita por meio de nitrômetro. Este método tem sido melhorado recentemente, com o aparecimento da cromatografia gás-líquida.
O método Kjeldahl (AOAC, 1984), descrito inicialmente há quase um século, tem passado por modificações e, desde então, é o mais amplamente adotado e o mais indicado para amostras de origem biológica. Neste método, por meio de uma digestão ácida, o nitrogênio da amostra é transformado em amônio (NH4+), o qual é posteriormente separado por destilação e, finalmente, dividido em três etapas:
Digestão – O nitrogênio é transformado em amônia e os compostos orgânicos são convertidos em CO2, H2O etc.
Destilação – A amônia é separada e recolhida em uma solução receptora.
Titulação – Determinação quantitativa da amônia contida na solução receptora. Dependendo da técnica, a separação da amônia é omitida, fazendo-se a sua determinação diretamente no material após a digestão.
A digestão pode ser feita em tubos fechados ou abertos. A principal vantagem dos tubos fechados é a dispensa de catalisadores ou de qualquer outro aditivo além do H2SO4, e a temperatura de digestão é de 450 ºC. O tubo aberto é o mais comumente usado, e a temperatura é de 400 ºC, aproximadamente.
A decomposição de material orgânico nitrogenado em amônia e outros componentes requer uma quantidade variável de ácido sulfúrico, o que está na dependência da quantidade e estrutura da amostra. A quantidade total de ácido depende, ainda, de sua perda por volatilização, a qual, por sua vez, varia com a taxa de aquecimento da temperatura e com o tempo de digestão. A perda de ácido também depende da proporção entre o ácido sulfúrico e os sais da mistura digestora, ou seja, do índice ácido. O índice ácido regula a perda do nitrogênio; portanto, se o material frio, após a digestão, estiver sólido ou quase sólido, é provável que tenha ocorrido perda de nitrogênio, motivada pela quantidade insuficiente de ácido presente. Então, uma quantidade específica de ácido deve estar presente durante a digestão, para não haver perda de nitrogênio.
Em face das diferentes temperaturas exigidas para a decomposição das substâncias orgânicas, uma vez que algumas não se decompõem à temperatura normal de ebulição do ácido sulfúrico, torna-se necessário aumentar a severidade da reação pela adição de determinados sais, sendo o mais comum o sulfato de potássio ou de sódio. Mesmo assim, a oxidação da matéria orgânica ainda é relativamente lenta. Entretanto, poderá ser acelerada pela adição de catalisadores ou agentes oxidantes. Os sais de cobre (CuSO4 . 5H2O) e selênio metálico (S) são os mais comumente usados. O mercúrio tem sido considerado o melhor dos catalisadores, relativamente ao fato de não-ocorrência de perda de nitrogênio; todavia, ele forma um complexo mercúrio-amoniacal que necessita ser decomposto antes de se determinar o nitrogênio. O selênio tem dado resultados variáveis, tendo sido relatada perda de nitrogênio quando se usa este elemento; porém, do ponto de vista de aumentar a velocidade do tempo da digestão, ele é superior ao mercúrio. O cobre também pode acarretar alguma perda de nitrogênio.
O uso de uma combinação de catalisadores é benéfico, porque causa melhor efeito associativo do que cada um dos catalisadores separadamente. O uso da mistura mercúrio–cobre ou cobre–selênio não acarreta perda de nitrogênio, desde que a concentração do sulfato seja alta; no entanto, quando a concentração do sulfato for baixa, o uso da mistura poderá, mesmo assim, acarretar perda de nitrogênio. No caso de se usar mercúrio, o complexo mercúrio–amônia pode ser decomposto com tiossulfato de sódio ou zinco em pó, sendo este o preferido.
O uso de agentes oxidantes tem sido pouco aconselhado, por causa dos perigos de perda do nitrogênio. Ácido perclórico, por exemplo, pode causar perda de nitrogênio. Em alguns casos, a água oxigenada (H2O2) tem dado bons resultados, especialmente em material que contém grande quantidade de carbono, na forma de gordura ou de carboidrato, e, além disso, evita a formação de excesso de espuma.
Quando se usa aparelho tipo micro Kjeldahl, em ebulição lenta, 30 minutos são suficientes para assegurar uma digestão adequada, após tornar-se claro o material que está sendo digerido, enquanto para o macro Kjeldahl uma hora de ebulição é o mínimo aconselhado. Finalmente, um ponto importante durante a digestão é que o ácido deve estar sob refluxo e não em evaporação; portanto, o ângulo formado pelo balão Kjeldahl no aparelho digestor não deve ser maior do que 45º. Deve-se observar, durante a digestão, um anel formado pelo material condensado a cerca de 1/3 do pescoço do balão digestor. A não-observação deste anel indica perda de ácido e, conseqüentemente, de nitrogênio.
A amônia pode ser separada por meio da destilação, aeração e difusão, sendo o processo de destilação, com arraste por vapor, preferido ao do aquecimento direto. A determinação da amônia pode ser por titulação simples, método iodométrico e método colorimétrico.
A titulação simples, comumente usada nos processos tradicionais de determinação de nitrogênio total, só pode ser utilizada com a separação da amônia após a digestão, o que não é necessário com os outros métodos. O método iodométrico ou semelhante tem inúmeras desvantagens e não é popular. Os métodos colorimétricos são relativamente novos e de pouca aplicação. Entretanto, eles parecem a melhor solução para os processos automáticos dos auto-analisadores. Existem três métodos colorimétricos mais utilizados: ninhidrina, nessler e hipocloreto de fenol ou reação