PCR em tempo real

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Protocolos – Sandro R. Valentini 
 
PCR em Tempo Real (qRT-PCR) 
 
 O termociclador de PCR em Tempo Real (“7500 Real Time PCR System” – 
Applied Biosystems) é um equipamento que deve ser calibrado corretamente, 
seguindo as instruções do fabricante. As calibrações mensais são: “Background” e 
“Optical”; já as calibrações semestrais são: “ROI” e “Pure Spectra”. 
 Todas as etapas a seguir estão descritas para utilização do kit “Power SYBR® 
Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems), cujo fluoróforo é intercalante de DNA. 
 
OTIMIZAÇÃO DOS PRIMERS 
 
1) Desenhar os primers para a reação de PCR em Tempo Real utilizando o Primer3 
ou Primer Expressv3.0. 
 
2) Fazer 4 mix (um para cada concentração), o mix é para 5 reações (triplicata + 
branco + erro). 
Após a síntese do par de primers, é necessário determinar a concentração ideal de 
uso destes. Fazer alíquotas dos primers diluídos para 10 µM. Para isto, devemos 
utilizar uma concentração fixa de cDNA (20 ng) e variar as concentrações de primers 
nas reações. 
 
Gradiente da concentração dos primers: 0,25 µM; 0,4 µM; 0,5 µM e 0,7 µM. 
 
 [primer]= 0,25 µM [primer]= 0,4 µM [primer]= 0,5 µM [primer]= 0,7 µM 
Reagente Volume Volume Volume Volume 
Power 
SYBR® 
Green PCR 
Master Mix 
(Applied 
Biosystems) 
50 µL 50 µL 50 µL 50 µL 
Primer F 
(10 µM) 
2,5 µL 4,0 µL 5,0 µL 7,0 µL 
Primer R 
(10 µM) 
2,5 µL 4,0 µL 5,0 µL 7,0 µL 
H20 Milli-Q 40 µL 37 µL 35 µL 31 µL 
 
3) Pipetar 19 µL do mix em um poço da placa de 96 well, esta será a reação de 
branco (um branco por mix). 
 
Protocolos – Sandro R. Valentini 
 
4) Ao restante do mix, adicionar 4 µL de cDNA (referente a 80 ng de RNA total 
convertido em cDNA), homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as 
triplicatas da reação (20 µL cada). Realizar este procedimento para todos os mix. 
 
5) Selar a placa com adesivo óptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4ºC. 
6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no “7500 Real Time PCR 
System”, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa. Em 
“Instrument” colocar volume final 20 µL, adicionar “Curva de dissociação” e iniciar a 
corrida. 
 
7) Após o término da reação de PCR, analisar a “Curva de dissociação” para cada 
par de primers, esta deve ter apenas um pico mostrando a especificidade do par de 
primers. Na “Amplification plot” é possível verificar qual a melhor concentração dos 
primers a ser utilizada (menor concentração de primers que gera a máxima 
amplificação). 
Caso não seja possível determinar esta concentração, ou seja, caso não 
existam pelo menos duas concentrações de primers que sejam coincidentes com 
relação à máxima amplificação obtida, realizar novamente esta etapa com outras 
concentrações. 
 
VALIDAÇÃO DOS PRIMERS 
 
1) Com a concentração dos primers fixa, deve-se variar a concentração de cDNA, 
afim de determinar os valores de “slope” e de “R2” para calcular a eficiência deste 
par de primers. 
 
Gradiente da concentração do cDNA: 100 ng; 50 ng; 25 ng; 12,5 ng e 6,25 ng. 
 
2) Fazer 5 Mix para 5 reações (triplicata + branco + erro), um para cada 
concentração de cDNA: 
Exemplo para um par de primes com concentração ideal de 0,25 µM: 
 
 
 
Protocolos – Sandro R. Valentini 
 
 [primer]= 0,25 µM 
Reagente Volume 
Power SYBR® Green 
PCR Master Mix 
(Applied Biosystems) 
50 µL 
Primer F (10 µM) 2,5 µL 
Primer R (10 µM) 2,5 µL 
H20 Milli-Q 40 µL 
 
3) Pipetar 19 µL do mix em um poço da placa de 96 well, esta será a reação de 
branco (um branco para cada um dos 5 mix diferentes). 
 
4) Ao restante do mix, adicionar 4 µL de cDNA (nas diferentes concentrações), 
homogeneizar bem, e pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reação (20 µL 
cada). Realizar este procedimento para todos os mix. 
 
5) Selar a placa com adesivo óptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4ºC. 
 
6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no “7500 Real Time PCR 
System”, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa. Em 
“Instrument” colocar volume final 20 µL, adicionar “Curva de dissociação” e iniciar a 
corrida. 
 
7) Após o término da reação de PCR, novamente analisar a “Curva de dissociação” 
para cada par de primers, a qual deve ter apenas um pico. Verificar na “Curva 
padrão de amplificação” quais os valores de “slope” e de “R2”, podendo ajustar a 
linha do Ct (manual ou auto). 
Caso não seja possível validar o par de primers com este gradiente de 
concentrações de cDNA, realizar novamente esta etapa com outras concentrações, 
de maneira que os valores de Ct estejam entre 5 e 25. Calcular a eficiência deste 
par de primers pela fórmula: 
[Eficiência = 10(-1/slope) – 1]. 
 
Uma vez que a concentração ideal dos primers (Otimização) for determinada, e 
estes estiverem validados (Validação) não é necessário repetir estas etapas. 
 
 
Protocolos – Sandro R. Valentini 
 
ANÁLISE POR PCR EM TEMPO REAL 
 
1) O RNA extraído que foi convertido em cDNA deverá ser utilizado (vide protocolos 
“Extração de RNA” e “Transcrição reversa”). Diluir sua amostra para uma quantidade 
referente a 80 ng de RNA total transcrito reversamente em cDNA. Devemos sempre 
realizar as reações com os pares de primers do gene de interesse e do controle 
endógeno na mesma placa. 
 
2) Mix para 5 reações (triplicata + branco + erro), exemplo para um par de primes 
com concentração ideal de 0,25 µM: 
 
 [primer]= 0,25 µM 
Reagente Volume 
Power SYBR® Green 
PCR Master Mix 
(Applied Biosystems) 
50 µL 
Primer F (10 µM) 2,5 µL 
Primer R (10 µM) 2,5 µL 
H20 Milli-Q 40 µL 
 
3) Pipetar 19 µL do mix em um poço da placa de 96 well, esta será a reação de 
branco (um branco para cada mix diferente). 
 
4) Ao restante do mix, adicionar 4 µL de cDNA (~20 ng/µL), homogeneizar bem, e 
pipetar na placa de 96 wells as triplicatas da reação (20 µL cada). Realizar este 
procedimento para todos os mix. 
 
5) Selar a placa com adesivo óptico, centrifugar por 1 min/1.000xg/4ºC. 
 
6) Ligar o computador e o equipamento, colocar a placa no “7500 Real Time PCR 
System”, abrir o 7500 System SDS Software v1.3, programar a placa colocando o 
tipo de análise desejada. Em “Instrument” colocar volume final 20 µL, adicionar 
“Curva de dissociação” e iniciar a corrida. 
 
7) Após o término da reação de PCR, novamente analisar a “Curva de dissociação” 
para cada par de primers, a qual deve ter apenas um pico. Realizar a análise 
desejada com os dados (valores de Ct) obtidos.