Mammalian target of rapamycin complex 1 activation is required for the stimulation of human skeletal muscle protein synthesis by es... (Dickinson, 2011).pdf Traduzidio

Prévia do material em texto

4/14/2016 jn139485 856..862
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 1/6
Página 1
The Journal of Nutrition
Nutrient Fisiologia, Metabolismo e nutrientes em nutrientes Interações
Alvo da rapamicina em mamíferos Complex
1 ativação é necessária para a estimulação do
Human Síntese Skeletal Muscle Protein por
Aminoácidos essenciais 1­3
Jared M. Dickinson,4Christopher S. Fry,4Micah J. Drummond,4,6David M. Gundermann,4
Dillon K. Walker,4Erin L. Glynn, 4Kyle L. Timmerman,4,6Shaheen Dhanani,6Elena Volpi,5,6
B. Rasmussen e Blake 4,6*
4Divisão de Ciências da Reabilitação, e5Departamento de Medicina Interna, e6Centro Sealy sobre Envelhecimento, University of Texas Medical
Branch, Galveston, TX 77555
Abstrato
A relação entre o alvo mamífero do complexo rapamicina 1 (mTORC1) de sinalização e síntese de proteína muscular
durante ocorrências de excesso de aminoácidos em humanos está baseada exclusivamente em dados de correlação. Portanto, o objetivo deste estudo
era usar uma abordagem mecanicista especificamente concebido para determinar se o aumento da ativação mTORC1 é necessária
para a estimulação da síntese de proteínas do músculo seguinte de aminoácidos (EAA) a ingestão de L­essencial em seres humanos. Exame de
síntese de proteína muscular e sinalização foram realizados em vasto lateral biópsias musculares obtidas de 8 jovens (25 6 2 y)
indivíduos que foram estudados antes e após a ingestão de 10 g de CEA durante 2 ensaios separados num ensaio aleatorizado,
projeto de contrapeso. Os ensaios eram idênticos, exceto durante um julgamento, os participantes foram administrados uma única dose oral de
um inibidor potente mTORC1 (rapamicina) antes da ingestão de EAA. Em resposta à ingestão de EAA, um; aumento de 60%   no músculo
a síntese de proteínas foi observada durante o ensaio de controlo, concomitante com o aumento da fosforilação de mTOR (Sor2448),
ribossomal S6 quinase 1 (Thr389), E fator de iniciação eucariótico 4E proteína de ligação 1 (Thr37/46). Em contraste, antes
administração de rapamicina completamente bloqueado o aumento na síntese de proteínas do músculo e bloqueada ou atenuado
a activação de proteínas de sinalização mTORC1. A inibição da síntese de proteínas do músculo e a sinalização não foi devido a
diferenças em qualquer disponibilidade de aminoácidos extracelular ou intracelular, porque estas variáveis   foram semelhantes entre
ensaios. Estes dados suportam um papel fundamental para a activação mTORC1 como um regulador chave da síntese de proteínas do músculo humano
em resposta ao aumento da disponibilidade das CEA. Esta informação será útil no desenvolvimento de provas baseadas nutricional
terapias dirigidas mTORC1 para contrariar perda de massa muscular associada a numerosas condições clínicas. J. Nutr. 141:
856­862, 2011.
Introdução
O aumento da disponibilidade de aminoácidos, principalmente a aminoácidos essenciais
ácidos (EAA),7resulta numa elevação potente e rápida da taxa
da síntese de proteínas do músculo esquelético humano (1­4). Consequentemente,
o uso de intervenções nutricionais continua a ser de interessados
interesse científico, não só para aumentar a resposta adaptativa de
músculo esquelético quando acoplado com regimes de treinamento físico
(5­11), mas também como um estímulo independente para promover uma rede
balanço protéico muscular positiva (4). Os benefícios independentes de
níveis elevados de aminoácidos no metabolismo de proteína muscular pode
fornecer uma estratégia útil para ajudar a neutralizar o dramático
a redução no tamanho e da função muscular que acompanham numerosos
condições clínicas (2,12­14), especialmente aqueles que não permitem
para o exercício regular. No entanto, o desenvolvimento de evidências
baseada terapias nutricionais para contrariar a perda muscular deve
depender de uma melhor compreensão dos mecanismos celulares precisas
pelo qual um aumento da disponibilidade EAA estimula humana
síntese da proteína do músculo esquelético.
O alvo do complexo rapamicina de mamífero 1 (mTORC1)
tornou­se um ponto focal na regulação do tamanho da célula muscular
(15). Um aumento na actividade de mTORC1 leva à
2 fosforilação de efectores a jusante chave directos, ribo­
1Compatível com o NIH / National Institute of Arthritis and Musculoskeletal US
e concessão de Doenças da pele R01 AR049877, NIH / National Institute on Aging P30
AG024832, NIH T32­HD07539, e 1UL1RR029876­01 do NIH / National
Centro de Investigação Recursos.
2Autor divulgações: JM Dickinson, CS Fry, MJ Drummond, DM
Gundermann, DK Walker, EL Glynn, KL Timmerman, S. Dhanani, E. Volpi,
e BB Rasmussen, não há conflitos de interesse.
3Este estudo foi registrado na clinicaltrials.gov como NCT00891696.
* Para quem a correspondência deve ser endereçada. E­mail: blrasmus@utmb.edu.
7Abreviaturas utilizadas: EAA, aminoácido essencial; 4E­BP1, iniciação eucariótico
fator 4E proteína 1 de ligação; eEF2, eucariótica factor de alongamento 2; FSR, fracionário
taxa de síntese; mTORC1, de mamífero alvo do complexo rapamicina 1; S6K1,
ribossomal S6 quinase 1.
um 2011 Sociedade Americana de Nutrição.
856 Artigo submetido em 02 de fevereiro de 2011. Análise inicial concluída, 20 de Fevereiro de 2011. Revisão aceitou 28 de fevereiro de 2011.
Primeiro publicado online 23 de março de 2011; doi: 10,3945 / jn.111.139485.
pelo convidado em 20 de maio de
2015
jn.nutrition.org
baixado
Página 2
Somal S6­quinase 1 (S6K1) e fator de iniciação eucariótico 4E
proteína de ligação 1 (4E­BP1) (1,16). A actividade de ambas S6K1
e 4E­BP1 contribui para a regulação da tradução iniciativa
ção, e, mais a jusante, a actividade de S6K1 também aumenta
alongamento de tradução através de sinais que, eventualmente, levar a
diminuiu o factor de alongamento 2 eucariótica (eEF2) fosforilação
ção (17). A via mTORC1 recebeu considerável
atenção como um regulador chave da síntese de proteínas após uma
aumento da disponibilidade de aminoácidos. Por exemplo, o tratamento de
marcado isotopicamenteeu­[anel­13C6] e fenilalanina eu­ [1­13C] leucinatraçadores (Isotec, Sigma­Aldrich). Ambos os marcadores foram dissolvidos em estéril
0,9% de solução salina, passados   através de um filtro de 2 mm antes da infusão, e infundido
a uma taxa constante (eu­[anel­13C6] fenilalanina, 0,05 mmol kg ×21× min21;
eu­ [1­13C] leucina, 0,08 mmol kg ×21× min21) Ao longo de cada experimental
julgamento, que foi precedida por uma dose preparatória de cada marcador (eu­[anel­13C6]fenilalanina, 2 mmol kg ×21; eu­ [1­13C] leucina, 4,8 mmol kg ×21) (4).
Durante cada ensaio experimental, um total de 5 biópsias musculares foi
obtido a partir da porção lateral do vasto lateral seguintes locais
anestesia (1% licocaine) utilizando uma agulha de Bergström 5 mm por sucção
4/14/2016 jn139485 856..862
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 2/6
As células com a rapamicina fármaco imunossupressor, um potenteinibidor mTORC1, foi mostrado para bloquear o aumento
S6K1 e 4E­BP1 fosforilação em resposta à elevada
níveis de leucina em mioblastos L6 (18). De modo semelhante, em animais, Ad­
ministração de rapamicina antes de um aumento no aminoácido
disponibilidade foi mostrado para bloquear o aumento em S6K1
fosforilação (19­22) e inibir o aumento normal
síntese de proteína muscular (20,22). Estes dados celulares e animais suge­
Gest que o aumento na síntese de proteínas em resposta à elevada
disponibilidade de aminoácidos é dependente de um mTORC1 funcional
sinal. Em contraste, a relação entre mTORC1 sinalização
e síntese de proteína muscular esquelética durante a suficiência de aminoácidos
eficiência em humanos está baseada exclusivamente em dados de correlação (1,4,23).
Assim, o papel preciso de mTORC1 na regulação do humano
síntese de proteína muscular esquelética seguinte aumentou aminoácido
níveis permanece muito menos definido devido à falta de in vivo
estudos mecanicistas.
Portanto, o objetivo desteestudo foi examinar
se o aumento na síntese de proteínas do músculo esquelético humano
taxa de seguir uma elevação na disponibilidade EAA é mTORC1
dependente. Rapamicina Especificamente, administrado, um potente
inibidor mTORC1, para jovens e sadios antes do
ingestão de uma mistura de EAA e examinadas misturado esquelético
taxa de síntese da proteína muscular, bem como proteínas­chave no
mTORC1 via de sinalização.
Materiais e métodos
Participantes. Jovens do sexo masculino (n = 3) e feminino (n = 5) participantes (25 6 2y;
171 6 4 cm; 70 6 5 kg) foram estudados durante 2 ensaios separados. Todos
participantes eram saudáveis   e considerados para fins recreativos ativo, mas não
envolvido em um programa de treinamento físico regular. Triagem
para todos os participantes foi realizada com história clínica, física
exames e testes laboratoriais, incluindo hemograma completo
com testes diferenciais, função hepática e renal, perfil de coagulação,
jejum de glucose no sangue, teste de tolerância à glucose oral, hepatite B e C
triagem, testes de HIV,­hormônio estimulante da tireóide, urinálise, e
o rastreio de drogas. Todos os participantes deram consentimento informado por escrito antes de
participação no estudo, que foi aprovado pelo Institutional
Review Board da Universidade do Texas Medical Branch (em conformidade
com a Declaração de Helsínquia revista em 1983).
Design de estudo. Os participantes foram estudados durante 2 experimental separada
ensaios, separados por 2­4 semanas, em um estudo randomizado, contrabalançadas, cruzada
sobre moda. Ambos os ensaios experimentais foram idênticas excepto que, durante 1
ensaio experimental, os participantes ingeriram 16 mg (1 mg comprimidos) de
rapamicina (Rapamune / Sirolimus; Wyeth) (trial rapamicina), enquanto
não rapamicina foi ingerido durante a outro ensaio experimental (controle
tentativas). Na noite antes de cada ensaio experimental, os participantes eram
admitidos no Instituto de Ciências­Clinical Pesquisa Translacional
Central da Universidade do Texas ramo médico e foram alimentados com uma
refeição padronizada a 1800 h e um lanche em 2200 h. Todos os participantes foram
Estudou durante o mesmo tempo do dia (isto é 0.700­1.500 h) na sequência de um
jejum durante a noite em condições basais e absteve­se de exercício para
24 h antes de cada ensaio experimental.
Na manhã de cada ensaio experimental, um polietileno de 18­medidor
cateter foi inserido numa veia do antebraço para infusão de estável,
(24). A primeira biópsia foi obtida 2 h após o início datracer infusão, marcando o início do período basal. Um segundo
biópsia, marcando o final do período basal, foi obtido a partir da mesma
incisão de 2 h após a primeira biopsia, no qual a agulha de biópsia
inclinados segundo um ângulo diferente de tal modo que a segunda biópsia foi taken5 centímetros
próximo do primeiro. Imediatamente após a segunda biópsia, parti­
ipants submetidos à prova de rapamicina foram administrados 16 mg de
rapamicina. Durante ambos os ensaios experimentais, os participantes permaneceram em
suas camas de hospital para um adicional de 2 h após a segunda biópsia,
o que permitiu a concentração de rapamicina no sangue de pico a ser atingido
(25). A biópsia do músculo 3 foi então obtido a partir da mesma incisão onde
os primeiros 2 biópsias; No entanto, a agulha de biópsia foi inclinado segundo um diferente
ângulo de modo que a biópsia foi feita 3, 5 cm de distância a partir do anterior
local da biópsia de amostragem, como anteriormente descrito (5,26). Imediatamente
após a terceira biópsia (, 2 min), a solução de CEA (ver abaixo) foi
ingerido durante ambos os ensaios experimentais, e 4 e 5 de músculo
As biópsias foram obtidas em 1 e 2 h após a ingestão de EAA. a 4ª
e 5o biópsias foram obtidas a partir de um novo local de incisão, 5 centímetros proximal
para a primeira, da maneira descrita acima para a primeira e segunda biopsia.
Todas as amostras musculares foram limpos de gordura visível e sangue, lavado com gelo
solução salina fria (porções de músculo a ser analisada para a síntese de proteínas
medir apenas), e imediatamente congeladas em azoto líquido e armazenado a
2808C até à análise.
Um cateter foi também colocada na veia antecubital do braço oposto
para coleta de sangue. As amostras de sangue foram obtidas antes de se iniciar o
infusão do marcador e, periodicamente, durante o julgamento experimental para
medição de enriquecimento traçador, leucina e fenilalanina concen­
trações e concentração de rapamicina no sangue.
CEA composição da solução. A solução CEA consistiu de 10 g de
CEA nas seguintes proporções: histidina, 11%; isoleucina, 10%;
leucina, 18%; lisina, 16%; metionina, 3%; fenilalanina, 16%;
treonina, 14%; e valina, 12% (4). Para minimizar o potencial de traçador
diluição com a adição de aminoácidos, foram adicionadoseu­[anel­13C6]e fenilalanina eu­ [1­13C] leucina traçador para a solução oral a CEA
6,5% do teor total de fenilalanina e leucina, respectivamente. Todos
EAAwere dissolvido em um, bebida aromatizada noncaloric livre de cafeína (350
ml) para aumentar a palatabilidade.
Análise rapamicina. Concentrações de rapamicina no sangue foram deter­
extraído de amostras de sangue correspondentes para selecionar pontos no tempo seguintes
administração de rapamicina utilizando um kit disponível comercialmente (IMx
Ensaio de Sirolimus; Abbott Laboratories). Devido à sensibilidade do ensaio,
rapamicina (sirolimus) valores, 3 mg × L21eram indetectáveis.
Amino ácidos e enriquecimentos concentrações. Amostras do músculo foram
homogeneizada e separada em proteínas­bound e intracelular livre
aminoácidos como previamente descrito (27) para a determinação da mista
proteína ligadaeu­[anel­13C6] fenilalanina e músculo fluido intracelular
eu­[anel­13C6] e fenilalanina eu­ [1­13C] leucina através de enriquecimento CG­EM(6890 Além disso GC, 5973N MSD, 7683 amostrador automático, a Agilent Technologies).
Mixed proteínas­boundeu­[anel­13C6] enriquecimento fenilalanina foi determi­minado por GC­MS em triplicado a seguir à hidrólise de proteínas e aminoácidos
extracção do ácido (27) utilizando o m + 6: 4 m rácio + e um padrão externo
curva de conhecidos m + 6: M + 0 rácios (28,29). Muscle intracelular livre
eu­[anel­13C6] e fenilalanina eu­ [1­13C] leucina enriquecimentos foram de­determinaram por GC­MS em triplicado usando o m + 6: M + 0 e m + 1: m + 0
rácios, respectivamente. Sangueeu­[anel­13C6] e fenilalanina eu­ [1­13C]enriquecimentos de leucina foram determinadas a partir de amostras de sangue desproteinizado
em duplicado utilizando o m + 6: M + 0 e M + 1: M + 0 rácios, respectivamente. Todos
Blocos rapamicina síntese de proteína muscular humana857
pelo convidado em 20 de maio de
2015
jn.nutrition.org
baixado
página 3
enriquecimentos de traçadores foram determinados utilizando terc­butildimetilsililo deriv­
tivas do respectivo aminoácido.
As concentrações de fenilalanina e leucina foram determinadas em
sangue e fluido intracelular muscular usando enriquecimentos traçadores eeu­ [15N]
e fenilalanina eu­ [5,5,5­2H3] leucina como padrões internos para phen­ilalanina e leucina, respectivamente, como descrito anteriormente (30).
Cálculo da taxa de síntese fraccionai de proteínas musculares. o
foi determinada taxa de síntese fracional (FSR) da proteína muscular mista
examinando a taxa de eu­[anel­13C6] fenilalanina incorporadaproteína muscular mista usando o modelo do produto precursor:
FSR ¼ DDEp= CTT = deMð1Þa Mð2Þ= 2Þ × 60 × 100;
onde Epé o incremento em proteínas­boundeu­[anel­13C6] fenilalaninaenriquecimento entre 2 biópsias musculares, t é o tempo entre o 2 muscular
biópsias, e EM (1)+ EM (2)são as eu­[anel­13C6] fenilalanina enriquecimentomentos na piscina intracelular livre nas biópsias musculares 2. Os dados são
expresso como percentagem por hora.
A análise de imunotransferência. A análise de imunotransferência foi realizada como ante­
ously detalhada(27). Resumidamente, o tecido congelado foi homogeneizado, centrifugado
durante 10 min a 48C, e o sobrenadante recolhido. A proteína total
As concentrações foram determinadas utilizando o ensaio de Bradford (Smartspec
Além disso, Bio­Rad). O sobrenadante foi diluído (1: 1) num tampão de amostra 23
mistura que contém 125 mmol / L de Tris, pH 6,8, 25% de glicerol, 2,5% de SDS,
2,5% de b­mercaptoetanol e 0,002% de azul de bromofenol, em seguida, fervida
durante 3 min a 1008C. Quantidades iguais de proteína total (50 mg) foram carregados
em cada pista e as amostras foram separadas por eletroforese (150 V
durante 60 min) num gel de poliacrilamida a 7,5 ou 15% como determinado pelo tamanho
da proteína alvo (Criterion, Bio­Rad). Cada amostra foi carregada em
duplicado e cada um continha um gel de controlo interno e carregamento
escada de peso molecular (Precision Plus, Bio­Rad). Além disso, todos
amostras de um dado ensaio experimental foram carregados no mesmo gel
e cada gel continham as amostras de controlo e tanto a rapamicina
ensaios.
Após a electroforese, a proteína foi transferida para um polyvinyli­
dene membrana de difluoreto de (Bio­Rad) a 50 V durante 60 min. As manchas foram então
Resultados
Curso de tempo de rapamicina no sangue. A administração de 16 mg
(; 0,23 mg × kg de peso corporal21) De rapamicina significativamente
concentrações elevadas rapamicina no sangue (trial rapamicina
apenas) (Fig. 1). Relativa a 30 min após a administração de rapamicina
ção, as concentrações de rapamicina no sangue eram mais
elevada (P, 0,05) em 1 h postadministration (correspondente a
1 h antes da ingestão CEA) e manteve­se similarmente elevada
durante toda a duração do estudo (P, 0,05).
O sangue e as concentrações intracelulares de aminoácidos. Lá
houve diferenças entre os ensaios no sangue ou intracelular
As concentrações de fenilalanina e leucina em qualquer ponto do tempo.
As concentrações de fenilalanina no sangue e leucina aumentou du­
ing ambos os ensaios, aos 30 minutos após a ingestão EAA e permaneceu
elevada ao longo do resto do estudo (P, 0,05) (Fig.
2). As concentrações intracelulares de fenilalanina e leucina eram
elevada durante ambos os ensaios em 1 h após EAA ingestão (P, 0,05).
Durante ambos os ensaios, a concentração de fenilalanina intracelular
permaneceram elevados em 2 h postingestion (P, 0,05), ao passo que o
concentração de leucina intracelular não foi elevado a 2 h
após ingestão CEA (Tabela 1).
Síntese de proteína muscular. A síntese de proteína muscular basal
taxa foi semelhante entre os tratamentos (P. 0,05). Durante o período
após a ingestão de EAA, músculo taxa de síntese de proteína foi aumentada
durante o ensaio de controlo (P, 0,05 versus basais), enquanto que o músculo
taxa de síntese de proteína não foi alterada a partir basal durante o
julgamento rapamicina (P. 0,05). Taxa de síntese de proteína muscular foi
maior no julgamento de controle do que no julgamento rapamicina durante o
período após ingestão CEA (P, 0,05) (Fig. 3).
Sinalização celular. A fosforilação de mTOR (Sor2448) tendiam a
jn.nutrition.org
baixado
4/14/2016 jn139485 856..862
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 3/6
bloqueados durante 1 h em 5% de leite em pó magro e incubaram­se em primáriaanticorpo durante a noite a 48C (ver abaixo). Na manhã seguinte, as manchas foram
incubadas em anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. As manchas foram
em seguida, incubadas numa solução quimioluminescente (ECL mais, Amersham
Biosciences) durante 5 min e medições de densidade óptica foram obtidos com um
Phosphorimager (ChemiDoc, Bio­Rad) e análise densitométrica foi
realizada utilizando Quantity One 4.5.2 software (Bio­Rad). membranas
contendo proteínas detectou­fosfo foram despojados de primário e
anticorpos secundários usando a Restauração do tampão Western Blot de descascamento (Pierce
Biotechnology) e foram subsequentemente sondado para proteína total com
o anticorpo específico de interesse. Valores fosfo e densidade total foram
normalizada para o controlo de carga interno e a fosfo: proteína total
foram determinadas proporções. Dados são expressos como imunoblot fosfo
divididas pela proteína total e ajustada para representar mudança de dobra
basal.
Anticorpos. A fosfo e anticorpos totais usado para immunoblotting
foram adquiridos a partir de Cell Signaling: fosfo­mTOR (Sor2448; 1: 250),
fosfo­S6K1 (Thr389; 1: 500), fosfo­4E­BP1 (Thr37/46; 1: 1000), e
fosfo­eEF2 (Thr 56; 1: 5000). A proteína total foi detectada utilizando um
diluição de anticorpo de 1: 1000. Anti­IgG de coelho conjugado com HRP secundário
anticorpo foi comprado de Amersham Bioscience (1: 2000).
Análise estatística. A 2­way de medidas repetidas ANOVA foi utilizada para
tempo de teste por diferenças de avaliação. Um 1­way ANOVA foi utilizado para examinar o
curso de tempo de rapamicina no sangue; No entanto, não detectável
rapamicina foi observada em amostras de sangue de linha de base de qualquer participante
(isto é, amostra de sangue obtidas antes da administração de rapamicina) e
Por conseguinte, este ponto de tempo não foi incluído na análise de dados. Um de Tukey
análise post hoc foi utilizado quando necessário determinar específica
diferenças dentro de uma Anova. Todos os dados foram analisados   utilizando SigmaStat
v.11.0 (Software Systat). Significância para todas as análises foi definido como P, 0,05.
Os dados são apresentados como média 6 SEM.
aumentar em 1 h após EAA ingestão durante o julgamento de controle (P =
0,07) e foi elevado acima de ensaio que a rapamicina em 2 h
após a ingestão de EAA (P, 0,05) (Fig. 4). Não se observou qualquer mudança
na fosforilação de mTOR após a ingestão durante o CEA
julgamento rapamicina em qualquer ponto de tempo. 4E­BP1 fosforilação
(Tre37/46) Aumentou durante ambos os ensaios em 1 h postingestion (P,
0,05); No entanto, o aumento na 4E­BP1 fosforilação tendiam
a ser maior durante o julgamento de controle (P = 0,06). fosforilação
FIGURA um curso de tempo da rapamicina no sangue após bucal
administração de 16 mg (; 0,23 mg × kg21) De rapamicina (trial rapamicina
apenas) em homens e mulheres jovens. Os números negativos representam o tempo
antes de L­EAA ingestão e números positivos representa o tempo
seguindo L­EAA ingestão. Os dados são média 6 SEM, n = 8. * Diferente
de 290 min, P, 0,05.
858 Dickinson et al.
pelo convidado em 20 de maio de
2015
page 4
de S6K1 (Thr389) Aumentou a 1 h após a ingestão durante o CEA
ensaio clínico (P, 0,05), com uma tendência para uma diferença entre
ensaios em 1 h após a CEA (P = 0,08), ao passo que a fosforilação S6K1
não aumentar a qualquer ponto de tempo durante o ensaio de rapamicina.
A fosforilação de eEF2 (Thr56) Não diferiu em nenhum momento
ou entre ensaios.
Discussão
O achado primário e romance do presente estudo é que o
aumento da taxa de síntese de proteína muscular esquelético humano em
resposta à ingestão de CEA é completamente bloqueada por prévia
administração do inibidor potente mTORC1, rapamicina. Dentro
Adicionalmente, a administração de rapamicina bloqueados ou atenuada do
activação de componentes a jusante da chave mTORC1
via de sinalização. Tomados em conjunto, estes dados suportam um funda­
papel mental para activação mTORC1 na estimulação de humano
síntese da proteína do músculo esquelético em resposta a EAA ingestão.
Para o nosso conhecimento, esta é a primeira investigação para usar um em
vivo abordagem mecanicista em humanos destinados a determinar a
papel fundamental da mTORC1 na regulação da esquelético
a síntese de proteína muscular após EAA ingestão. Especificamente,
administrou­se 16 mg (; 0,23 mg kg ×21) De rapamicina para inibir
actividade mTORC1 2 h antes da ingestão de uma mistura de CEA.
Este período de tempo foi demonstrado tanto no estudo (Fig. 1)
e anteriormente pelo nosso laboratório (25), para coincidir com um pico
As concentrações nosangue que permaneceu elevada ao longo
a duração do inquérito em curso. Considerando observamos uma
aumento perceptível (; 60%) na síntese de proteínas do músculo esquelético
taxa após a ingestão EAA durante o julgamento de controle, antes
administração de rapamicina completamente bloqueado este aumento de
taxa de síntese de proteínas (Fig. 3). Esta conclusão é corroborada pelo
trabalho anterior no músculo esquelético dos animais (20,22). Por exemplo,
Anthony et al. (22) demonstraram que a injecção de 0,75 mg kg ×21do
rapamicina na veia da cauda de ratos impediu um aumento na
taxa de síntese de proteínas do músculo esquelético que ocorre em 1 h depois da administração oral
administração leucina. Além disso, ao passo que Anthony et al.
(22) mostrou que a taxa de síntese de proteínas do músculo foi inibida
a 1 h após a ingestão leucina (determinado utilizando um; 10 min
dose de inundação) com injeção rapamicina antes, nossos dados mostram
que a administração de rapamicina tem um efeito inibitório prolongado
sobre a taxa de esquelético humano síntese de proteínas musculares, de tal modo que um
nível basal é mantida ao longo de um período de 2 h após a CEA
ingestão.
A rapamicina é um inibidor potente da actividade mTORC1 (31),
e, por conseguinte, para obter uma visão mecanicista para o fundamentais
papel da mTORC1 sinalização nós nos concentramos em proteínas sinalizadoras chave
a jusante do mTORC1 em pontos de tempo que se sabe ser influenciada
por ingestão de EAA (4). Concomitante com a inibição do
síntese de proteína muscular esquelética, administração rapamicina prévia
ção embotada mTORC1 (Ser2448) E S6K1 (Thr 389) fosfo­
rylation após a ingestão EAA. Além disso, embora o
fosforilação de 4E­BP1 (Thr 37/46) Foi aumentada em 1 h
durante ambos os ensaios, foi observado um aumento maior durante o
julgamento de controle (P = 0,06). O bloqueio incompleto de 4E­BP1
fosforilação com a administração prévia de rapamicina tem também
foi observado após a alimentação em roedores (21); Além disso,
vários estudos em células têm destacado que tratamento rapamicina
O mento não inibem completamente a fosforilação de 4E­BP1
em níveis que fazem inibir a fosforilação S6K1 (32,33). Estes
dados sugerem que a rapamicina não pode fornecer inibição completa
ção de fosforilação dependente de mTORC1 de 4E­BP1 que ou
uma via suplementar pode estar envolvida no aumento de 4E­BP1
fosforilação seguinte aumento da disponibilidade de aminoácidos.
Não obstante, os dados de sinalização da investigação em curso
sugerem que a dose de rapamicina usado no presente estudo
provavelmente fez mTORC1 inibir a actividade, o que não foi superada pela
um aumento na disponibilidade de CEA, e que a via mTORC1
é um mecanismo fundamental através do qual o aumento em humanos
síntese da proteína do músculo esquelético é regulado EAA seguinte
ingestão.
No seguimento de um aumento nos níveis de aminoácidos, tanto extracelular
(34,35) e intracelular (4,36) disponibilidade de aminoácidos têm
foram propostos para regular o aumento no músculo esquelético humano
síntese proteíca. Além disso, embora o mecanis­ preciso
A FIGURA 2 curso de tempo da fenilalanina no sangue (A) e leucina (B)
concentrações após a ingestão de 10 g de L­CEA em homens jovens e
mulheres durante os ensaios de controlo e rapamicina. Os dados são média 6
SEM, n = 8. * Diferente de 2120 (basal), P, 0,05.
TABELA 1 As concentrações intracelulares de fenilalanina e leucina
em condições basais e após a ingestão de 10 g
de L­EAA em homens e mulheres jovens1
Tentativas Basal 1 h após a CEA2 h após a CEA
A fenilalanina, L mmol ×21
pelo convidado em 20 de maio de
2015
jn.nutrition.org
baixado
4/14/2016 jn139485 856..862
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 4/6
mos ainda estão sob investigação, a disponibilidade de aminoácidosdentro destas piscinas tem sido associada com a actividade mTORC1 (37,38).
Portanto, medimos extracelular (sangue) e intracelular
disponibilidade de aminoácidos através de fenilalanina e leucina concen­
tração para determinar se os potenciais diferenças de aminoácido
disponibilidade como um resultado de administração de rapamicina poderia
explicar a sinalização mTORC1 embotada e inibição de
Ao controle 45.5 6 5.4 70,0 6 5,9 * 53.2 6 4.4 *rapamicina 46.5 6 9.8 73,8 6 8,4 * 54,9 6 7,0 *
Leucina, L mmol ×21
Ao controle 115 6 14.9 168 6 17.9 * 138 6 13.8
rapamicina 106 6 18.3 165 6 21,0 * 136 6 13.4
1Os dados são média 6 SEM, n = 8. * Diferente do basal, P, 0,05.
Blocos rapamicina síntese de proteína muscular humana859
page 5
síntese da proteína do músculo esquelético. Observou­se que um semelhante
aumentar em ambos fenilalanina extracelular e intracelular
e disponibilidade leucina ocorreu durante a ambos os ensaios, e que
concentrações semelhantes foram mantidas ao longo de cada ensaio,
sugerindo administração rapamicina não prejudicou aminoácido
absorção em circulação ou o transporte no músculo. Lá­
tona, o embotamento da sinalização mTORC1 e no músculo esquelético
a síntese de proteína com o tratamento com rapamicina não pode ser previamente
explicadas pelas diferenças nos quer extracelular ou intracelular
disponibilidade aminoácido.
Após a ingestão de aminoácidos, a proteína do músculo esquelético
as taxas de síntese não deixou cair abaixo dos valores basais durante a
julgamento rapamicina. Além disso, trabalhar no músculo esquelético de animais
tem demonstrado que a rapamicina não altera proteína basal
as taxas de síntese (19,20). Estes dados sugerem que qualquer um
via não identificado é capaz de manter pro­ translacional
processos em taxas basais (potencialmente envolvendo 4E­BP1) ou que
O rapamicina não interferir com a activação basal de mTORC1
e sua influência sobre a síntese de proteínas. No que diz respeito a esta última,
Dados recentes têm demonstrado que a activação de mTORC1
provavelmente envolve a sua translocação dentro da célula, um processo de
facilitada por proteínas que se ligam Rag mTORC1 via raptor
(39,40). A rapamicina administração, por conseguinte, podem ter pouco
influência na activação mTORC1 basal, porque mTORC1
translocação já ocorreu. Por outro lado, o
efeito inibitório que é observada na sequência de um estímulo (isto é,
amino ácido ingestão) podem ser devido a uma rapamicina­dependente
inibição do aumento da translocação mTORC1, possivelmente através
associação mTORC1­raptor diminuída (31). No entanto, uma tal
Trata­se fora do âmbito do inquérito em curso e, portanto,
mais pesquisa é necessário definir mais claramente o mecanismo
pelo que a rapamicina inibe amino mTORC1 induzida por ácido
ativação.
As características de rapamicina fornecer uma pesquisa única
estratégia que é comumente utilizado para investigar a relevância da
mTORC1 a via de sinalização em resposta a um dado estímulo.
No entanto, em adição à sua utilização para a investigação mecanicista,
rapamicina tem sido documentada como tendo benefícios clínicos quanto
bem. Por exemplo, a rapamicina tem sido usado como tratamento para a
várias condições clínicas (41­43) e é comumente prescritos
para pacientes após transplantes de órgãos (44,45). embora a nossa
propósito não foi examinar a aplicabilidade clínica
tratamento de rapamicina (ou inibição mTORC1), os resultados de
o nosso estudo, bem como os dados anteriores de nosso laboratório mostrando
rapamicina blocos de resistência aumentos induzidos pelo exercício em mus­
síntese de proteínas cle (25), poderia ter implicações importantes para
várias populações clínicas que são tratados com rapamicina (ou
vários outros inibidores mTORC1), especificamente no que se refere aos
a manutenção e / ou restauração da massa muscular desses
indivíduos. No entanto, se uma inibição da proteína muscular
síntese é observada a doses variáveis   de prescrição (44) É evidente
merece uma investigação mais aprofundada.
Em resumo, a administração de rapamicina, antes da
ingestãode blocos de EAA o aumento na proteína muscular esquelética
a síntese e inibe ou atenua a activação da tecla
componentes a jusante da via de sinalização mTORC1
em indivíduos jovens e saudáveis. Estes dados sugerem que o
a estimulação da síntese de proteínas do músculo esquelético humano em
resposta a níveis elevados de CEA funcional requer uma mTORC1
sinal. Além disso, os resultados desta investigação fornecem
percepção de que pode ser utilizada de um modo para desenvolver melhores evidências
terapias nutricionais base para combater a perda muscular e
diminuição da função muscular que está associado com numerosas
debilitante condições clínicas.
FIGURA FSR da proteína 3 muscular mista no início do estudo e após
ingestão de 10 g de L­CEA no músculo esquelético de homens jovens e
mulheres durante os ensaios de controlo e rapamicina. Os dados são média 6
SEM, n = 8. * Diferente do basal, P, 0,05; #diferente de
julgamento rapamicina, P, 0,05.
Figura 4 Fosforilação da mTOR em
Ser2448(A), 4E­BP1 em Thr37/46(B), em S6K1
Thr389(C), e em Thr eEF256(D) seguinte
ingestão de 10 g de L­CEA no músculo esquelético
homens e mulheres de jovens durante o controle
e ensaios de rapamicina. Os dados são expressos como
dobre mudança do basal (média de 6 SEM), n = 8.
* Diferente do basal, P, 0,05; #diferente
de rapamicina julgamento, P, 0,05;†P = 0,06, vs.
julgamento rapamicina.
860 Dickinson et al.
pelo convidado em 20 de maio de
2015
jn.nutrition.org
baixado
page 6
Agradecimentos
Agradecemos Shelley Medina, Ming­Qian Zheng, e Junfung Hao
para assistência técnica. BBR, EV, e JMD projetado
a pesquisa; JMD, CSF, MJD, DMG, DKW, ELG,
KLT e SD realizou uma pesquisa e avaliação do cante
roteiro; JMD, CSF, MJD, EV, e BBR analisaram dados;
e JMD e BBR escreveu o manuscrito e tinha primária
responsabilidade pelo conteúdo final. Todos os autores leram e aprovaram
o manuscrito final.
é um regulador fundamental da hipertrofia do músculo esquelético e pode impedir
atrofia muscular in vivo. Nat Cell Biol. 2001; 3: 1014­9.
16. Laplante M, Sabatini DM. mTOR sinalização de relance. J. Cell Sci.
2009; 122: 3589­94.
17. Wang X, Li W, Williams M, Terada N, Alessi DR, CG orgulhoso.
Regulação do factor de alongamento 2 por quinase p90 (RSK1) e p70 S6
quinase. EMBO J. 2001; 20: 4370­9.
18. Kimball SR, Shantz LM, Horetsky RL, Jefferson LS. regula leucina
a tradução de mRNAs específicos em mioblastos L6 através mTOR­
alterações mediadas na disponibilidade de eIF4E e fosforilação de
S6 proteína ribossómica. J Biol Chem. 1999; 274: 11647­52.
4/14/2016 jn139485 856..862
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 5/6
Literatura citada
1. Fujita S, Dreyer HC, Drummond MJ, Glynn EL, Cadenas JG,
Yoshizawa F, Volpi E, Rasmussen BB. Sinalização nutriente no
regulação da síntese de proteína muscular humana. J Physiol. 2007; 582:
813­23.
2. Paddon­Jones D, Sheffield­Moore M, Zhang XJ, Volpi E, Wolf SE,
Aarsland A, Ferrando AA, Wolfe RR. Ingestão de aminoácidos melhora
síntese de proteína muscular em jovens e idosos. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 2004; 286: E321­8.
3. Volpi E, Kobayashi H, Sheffield­Moore M, Mittendorfer B, Wolfe RR.
Os aminoácidos essenciais são os principais responsáveis   para o aminoácido
estimulação do anabolismo proteico muscular em adultos idosos saudáveis. Am J
Clin Nutr. 2003; 78: 250­8.
4. Glynn EL, Fry CS, Drummond MJ, Timmerman KL, Dhanani S, Volpi
E, Rasmussen BB. Ingestão de leucina excesso aumenta anabolizante muscular
sinalização, mas não o anabolismo proteico líquido em homens e mulheres jovens.
J Nutr. 2010; 140: 1970­6.
5. Dreyer HC, Drummond MJ, Pennings B, Fujita S, Glynn EL, Chinkes
DL, Dhanani S, Volpi E, Rasmussen BB. Essencial enriquecido­Leucina
aminoácidos e ingestão de carboidratos após exercícios de resistência
melhora a sinalização mTOR e síntese de proteínas no músculo humano. Am J
Physiol Endocrinol Metab. 2008; 294: E392­400.
6. Harber MP, Konopka AR, Jemiolo B, Trappe SW, Trappe TA, Reidy PT.
síntese de proteína muscular e expressão gênica durante a recuperação da
exercício aeróbico nos estados em jejum e alimentados. Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol. 2010; 299: R1254­62.
7. Drummond MJ, Dreyer HC, Pennings B, Fry CS, Dhanani S, Dillon EL,
Sheffield­Moore M, Volpi E, Rasmussen BB. proteína do músculo esquelético
resposta anabólica ao exercício de resistência e aminoácidos essenciais é
atrasado com o envelhecimento. J Appl Physiol. 2008; 104: 1452­1461.
8. Moore DR, Robinson MJ, Fry JL, Tang JE, Glover EI, Wilkinson SB,
Antes T, Tarnopolsky MA, Phillips SM. resposta dose de proteína ingerida
de músculo e a síntese de proteína albumina após exercícios de resistência em
homens jovens. Am J Clin Nutr. 2009; 89: 161­8.
9. Fujita S, Dreyer HC, Drummond MJ, Glynn EL, Volpi E, Rasmussen
BB. aminoácido essencial e ingestão de carboidratos antes de resistência
O exercício não aumenta a síntese de proteína muscular pós­exercício. J Appl
Physiol. 2009; 106: 1730­9.
10. Koopman R, Wagenmakers AJ, RJ Manders, Zorenc AH, Senden JM,
Gorselink M, Keizer HA, van Loon LJ. a ingestão combinada de proteínas
e leucina livre com carboidratos aumenta muscular pós­exercício
síntese de proteínas in vivo em indivíduos do sexo masculino. Am J Physiol Endocrinol
Metab. 2005; 288: E645­53.
11. Koopman R, Pannemans DL, Jeukendrup AE, Gijsen AP, Senden JM,
Halliday D, Saris WH, van Loon LJ, Wagenmakers AJ. Combinado
ingestão de proteína e carboidrato melhora o equilíbrio de proteínas durante
exercícios de ultra­resistência. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004; 287:
E712­20.
12. Volpi E, Ferrando AA, Yeckel CW, Tipton KD, Wolfe RR. exógena
aminoácidos estimular a síntese líquida de proteínas do músculo nos idosos. J Clin
Investir. 1998; 101: 2000­7.
13. Biolo G, De Cicco M, Dal Mas V, Lorenzon S, Antonione R, Ciocchi B,
Barazzoni R, Zanetti H, Dore M, et al. Resposta de proteínas musculares e
cinética de glutamina para aminoácidos enriquecido de cadeia ramificada em intenção
pacientes de cuidados sive após a cirurgia radical de câncer. Nutrição. 2006; 22: 475­
82.
14. Eley HL, Russell ST, Tisdale MJ. Efeito de aminoácidos de cadeia ramificada
sobre a atrofia muscular em caquexia do cancro. Biochem J. 2007; 407: 113­20.
15. Bodine SC, Stitt TN, Gonzalez M, Kline WO, Stover GL, Bauerlein R,
Zlotchenko E, Scrimgeour A, Lawrence JC, et ai. Akt / mTOR
19. Kimball SR, Jefferson LS, Nguyen HV, Suryawan A, Bush, JA, Davis TA.Alimentação estimula a síntese de proteínas no músculo e no fígado dos porcos neonatais
por meio de um processo dependente de mTOR. Am J Physiol Endocrinol Metab.
2000; 279: E1080­7.
20. Suryawan A, Jeyapalan AS, Orellana RA, Wilson FA, Nguyen HV,
Davis TA. Leucina estimula a síntese de proteínas no músculo esquelético de
porcos neonatais, reforçando a activação mTORC1. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 2008; 295: E868­75.
21. Vary TC, Anthony JC, Jefferson LS, Kimball SR, Lynch CJ. rapamicina
embota a estimulação de nutrientes de eIF4G, mas não PKCepsilon phosphoryl­
ção, no músculo esquelético. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2007; 293:
E188­96.
22. Anthony JC, Yoshizawa F, Anthony TG, Vary TC, Jefferson LS, Kimball
SR. Leucina estimula a iniciação da tradução no músculo esquelético de
ratos pós­absortivo através de uma via sensível à rapamicina. J Nutr.
2000; 130: 2413­9.
23. Cuthbertson D, Smith, K, J Babraj, Leese L, Waddell t, Atherton P,
Wackerhage H, Taylor PM, Rennie MJ. défices de sinalização anabolizantes
subjacentes a resistência de aminoácidos de desperdício, músculo envelhecimento. FASEB J.
2005; 19: 422­4.
24. Bergstrom J. Muscle eletrólitos no homem. Scand J Clin Invest Lab. 1962;
Suppl 68: 1­110.
25. Drummond MJ, Fry CS, Glynn EL, Dreyer HC, Dhanani S, Timmerman
KL, Volpi E, Rasmussen BB. administração de rapamicina em humanos
bloqueia o aumento induzido por contração em proteínasdo músculo esquelético
síntese. J Physiol. 2009; 587: 1535­1546.
26. Volpi E, Chinkes DL, Rasmussen BB. biópsias musculares sequenciais durante
um traçador infusão de 6 horas não afectam proteína muscular humana mista
síntese e fenilalanina muscular cinética. Am J Physiol Endocrinol
Metab. 2008; 295: E959­63.
27. Dreyer HC, Fujita S, Cadenas JG, Chinkes DL, Volpi E, Rasmussen BB.
Os exercícios de resistência aumenta a atividade da AMPK e reduz 4E­BP1
síntese e fosforilação de proteínas no músculo esquelético humano.
J Physiol. 2006; 576: 613­24.
28. Calder AG, Anderson SE, Grant I, McNurlan MA, Garlick PJ. o
determinação do enriquecimento baixo d5­fenilalanina (,002­0,09
por cento átomo de excesso), após a conversão para feniletilamina, em
relação aos estudos volume de negócios de proteína por cromatografia gasosa / elétron
espectrometria de massa de ionização. Rápido Commun Mass Spectrom.
1992; 6: 421­4.
29. Patterson BW, Zhang XJ, Chen Y, Klein S, Wolfe RR. medição de
muito baixos enriquecimentos isótopos estáveis   por cromatografia gasosa / massa
espectrometria: aplicativo para medição da síntese de proteína muscular.
Metabolismo. 1997; 46: 943­8.
30. Wolfe RR, Chinkes DL. traçadores isotópicos em pesquisa metabólica:
princípios e prática da análise cinética. 2nd ed. Hoboken, NJ: John
Wiley & amp; Sons, Inc .; De 2005.
31. Oshiro N, Yoshino K, S Hidayat, Tokunaga C, Hara K, Eguchi S,
Avruch J, Yonezawa K. A dissociação de rapina de mTOR é um
mecanismo de inibição induzida pela rapamicina de função de mTOR. genes
Células. 2004; 9: 359­66.
32. Thoreen CC, Kang SA, Chang JW, Liu Q, Zhang J, Gao Y, Reichling LJ,
Sim T, Sabatini DM, et al. Um alvo de mamíferos ATP­competitiva de
inibidor de rapamicina revela funções de rapamicina­resistente de mTORC1.
J Biol Chem. 2009; 284: 8023­32.
33. Feldman ME, Apsel B, Uotila A, Loewith R, Knight ZA, Ruggero D,
Shokat KM. inibidores ativa do local de mTOR rapamycin­ alvo
saídas de mTORC1 resistentes e mTORC2. PLoS Biol. 2009; 7:
e38.
34. Bohe J, Low A, Wolfe RR, Rennie MJ. síntese de proteína muscular humana
é modulada pela disponibilidade de aminoácido extracelular, não intramuscular:
um estudo de dose­resposta. J Physiol. 2003; 552: 315­24.
blocos rapamicina síntese de proteína muscular humana861
pelo convidado em 20 de maio de
2015
jn.nutrition.org
baixado
page 7
35. Borsheim E, Kobayashi H, Traber DL, Wolfe RR. compartimental
distribuição de aminoácidos durante hypoaminoa­ induzida por hemodiálise
cidemia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2006; 290: E643­52.
36. Christie GR, Hajduch E, Hundal HS, CG orgulhoso, Taylor PM. intracelular
detecção lular de aminoácidos em oócitos de Xenopus laevis estimula p70 S6
quinase num alvo de modo dependente da rapamicina. J Biol Chem.
2002; 277: 9952­7.
37. Hundal HS, Taylor PM. transceptores de aminoácidos: guardiões de
troca de nutrientes e reguladores de sinalização de nutrientes. Am J Physiol
Endocrinol Metab. 2009; 296: E603­13.
38. Goberdhan DC, Ogmundsdottir MH, Kazi S, Reynolds B, Visvalingam
SM, Wilson C, Boyd CA. detecção de aminoácidos e regulação mTOR:
dentro ou fora? Biochem Soc Trans. 2009; 37: 248­52.
39. Sancak Y, Peterson TR, Shaul YD, Lindquist RA, Thoreen CC, Bar­
Peled L, Sabatini DM. As GTPases Rag ligar raptor e mediar amino
ácido sinalizando para mTORC1. Ciência. 2008; 320: 1496­501.
40. Kim E, Goraksha­Hicks P, Li L, Neufeld TP, Guan KL. Regulamento do TORC1
por GTPases Rag em resposta nutrientes. Nat Cell Biol. 2008; 10: 935­45.
41. Massey DC, Bredin F, Parkes M. Uso do sirolimus (rapamicina) para tratar
doença de Crohn refractário. Intestino. 2008; 57: 1294­6.
42. Stallone G, Schena A, B Infante, Di Paolo S, Loverre A, Maggio G,
Ranieri E, Gesualdo L, Schena FP, et al. Sirolimus para o sarcoma de Kaposi
em receptores de transplante renal. N Engl J Med. 2005; 352: 1317­1323.
43. Paghdal KV, Schwartz RA. Sirolimus (rapamicina): a partir do solo da Páscoa
Island para um futuro brilhante. J Am Acad Dermatol. 2007; 57: 1046­1050.
44. Webster AC, Lee VW, Chapman JR, Craig JC. ­Alvo da rapamicina
inibidores (sirolimus e everolimus) para a imunossupressão primária
de receptores de transplante renal: uma revisão sistemática e meta­análise de
estudos randomizados. Transplantação. 2006; 81: 1234­1248.
45. Aranda­Dios A, Lage E, Sobrino JM, Mogollon MV, Guisado A,
Cabezon S, Hinojosa R, Hernandez A, experiência Ordonez A. Sirolimus
no transplante do coração. Transplant Proc. 2006; 38: 2547­9.
pelo convidado em 20 de maio de
jn.nutrition.org
baixado
4/14/2016 jn139485 856..862
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 6/6
862 Dickinson et al.
2015