Pronto. Métodos de Analise para o Isolamento e Identificação de microorganismos
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Pronto. Métodos de Analise para o Isolamento e Identificação de microorganismos


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Ágar Levine
Teste confirmativo para coliformes totais
Incubação a 35o C / 48 horas
Caldo E.C.
Teste confirmativo para coliformes termotolerantes
Incubação a 45,5o C /48 horas
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COLIFORMES \u2013 Técnica do número mais provável
Teste presuntivo
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COLIFORMES \u2013 Técnica do número mais provável - Teste confirmativo
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COLIFORMES TERMOTOLERANTES \u2013 Técnica do número mais provável
Teste confirmativo
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Avaliação do crescimento pelo método de numero mais provável
Crescimento 
Produção de gás
Produção de ácido ou base
Alteração do potencial redox (observado pela viragem de aceptores de elétrons como a rezarzurina, azul de metileno ou cloreto de trifeniltetrazólio)
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Diluição única
Diluição múltipla:
Tripla
Quíntupla
Resultados tabelados
Numero mais provável
O numero de diluições e replicas do teste são proporcionais ao numero de organismos que se suspeita, o tipo de amostra, e a disponibilidade do laboratório.
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O procedimento é mais comumente utilizado é feito com a diluição da amostra em agua em 3 concentrações decimais. 0,1; 0,01; 0,001.
De cada alíquota é feita a inoculação em triplicata da amostra.
(pode também ser feitas tabém 5 diluições e inoculação quintupla.
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Grande variabilidade do numero de microorganismos na amostra = Grande numero de diluições
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Filtração através de Membrana
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Filtração através de Membrana
Amostra é filtrada através de membrana com porosidade adequada (0,45 m\uf06d) para reter o microrganismo.
A membrana é transferida para superfície das placas de Petri contendo meio de cultura.
Incubar
Contagem: através de contador
Limite de contagem: C. totais 20 a 80 colônias
 C. termotolerantes: 20-60 colônias
Mais utilizada para análise de agua com pouca turbidez
Permite a contagem de um numero baixo UFC
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SISTEMA DE FILTRAÇÃO
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Métodos e meios específicos para isolamento e identificação de microorganismos
Para coliformes
Para Staphylococcus aureus
Para Bacillus cereus
Para Salmonella
Para Campylobacter
Para E. coli
Para Vibrios Patogenicos
Para Yersinia enterocolica
Para Pseudomonas
Empregados em situações em que já existe a suspeita de um determinado microorganismo na amostra
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Isolamento e identificação de coliformes
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Coliformes totais
Fermentam lactose com produção de ácido e gás a 35 - 37oC.
Significado de coliformes totais em alimentos:
falhas no processamento
contaminação pós-processamento 
sem relação direta com a ocorrência de contaminação fecal nem a presença de microrganismos patogênicos
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Coliformes termotolerantes 
Fermentam lactose com produção de ácido e gás a 44,5o C.
Significado de coliformes termotolerantes em alimentos:
Possibilidade da presença de microrganismos patogênicos entéricos (Salmonella, Shigella)
Contaminação pós processamento
Em números elevados indicam falta de higiene, manipulação inadequada e estocagem imprópria
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Isolamento e identificação de coliformes
Plaqueamento por incorporação do meio de cultura \u2013 VRB (violet red bile agar)
Incubação a 32o C /24 horas
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Isolamento e identificação de Staphylococcus aureus
Agar BPA (Baird Parker Ágar) adicionado de telurito de potássio e gema de ovo. O cloreto de litio e telurito de potássio inibem o crescimento de microbiota acompanhante o piruvato de sódio e glicina favorecem o crescimento de Staphylococcus coagulase positivo. 
Os coag. Positivos formam colonias negras.
Teste de coagulase
Teste de catalase
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Isolamento e identificação de Bacillus cereus
Meio MYP
Ágar B. cereus (OXOID)
Provas Bioquímicas
Fermentação da glicose em anaerobiose
Teste de decomposição da tirosina
Redução de nitrato
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Identificação de Salmonella
De acordo com a disponibilidade do material/estrutura e tipo de amostra analisada
Meios de cultura específicos e seletivos (ágar verde brilhante, ágar xilose lisina desoxicolato, ágar bismuto sulfito)
Provas bioquimicas (oxidase, lactose, sacarose, H2S, Lisina, urease, malonato, Indol, VM, citrato, motilidade, entre outros)
Testes Sorológicos (pesquisa de antígenos capsulares, antígenos flagelares \u201cH\u201d, lipídio A, antígeno O, entre outros.)
Existem muitos meios para a identificação de salmonella, a escolha do melhor método pode ser analizada de acordo com a disponibilidade do material/estrutura e tipo de amostra analisada
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Outros métodos de análise (não quantitativos)
Tudo visto até aqui permite a quantificação dos microorganismos analisados. Os itens subsequentes em sua grande parte permitem apenas a identificação do microorganismo na amostra.
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Vantagens
Uso de quantidades pequenas de amostras e meios de cultura
Praticidade
Redução da mão de obra
Desvantagens
Custo
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API 20E:. Usado para identificação de Enterobacteriaceae e outras bactérias G-)
Métodos miniaturizados de análise 
Enterotube II:. Usado para a identificação de Enterobactérias
Micro-ID: Usado para diferenciação de bactérias da família Enterobacteriaceae
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Métodos rápidos de análise
MÉTODOS ALTERNATIVOS DE CONTAGEM DE CÉLULAS VIÁVEIS:
Semeadura em espiral
Filtração em membrana com retículo hidrófobo
Petrifilm
Simplate
MÉTODOS PARA AVALIAR POPULAÇÕES MICROBIANAS E BIOMASSA:
Bioluminescência e análise de ATP
Impedância e condutância
Colorimetria de reflectância
Substratos fluorogênicos 
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SEMEADURA EM ESPIRAL
Possui dispositivo mecânico que distribui o inoculo líquido sobre a superfície do meio de cultura sólido
Única placa: 3 ciclos logarítmicos
Seringa especial em volumes continuamente decrescentes
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FILTRAÇÃO EM MEMBRANA COM RETÍCULO HIDRÓFOBO (HGMF)
Utiliza filtro especial, dividido em 1600 compartimentos, delimitados por linhas de material hidrófobo (cera)
Após filtração: deposição da membrana na superfície de meio de cultura adequado
São contadas unidades de crescimento (UC): uma colônia pode ser resultante de mais de uma célula viável
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PETRIFILM (3M)
CONTAGEM TOTAL 
Modificação da contagem de células viáveis em placas
Composto por dois filmes estéreis, reidratáveis, impregnados pelo meio de cultura e por substâncias solúveis em água fria
OBS: existe um kit especifico para coliformes e E. coli
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SIMPLATE - Contagem Padrão 
PRINCÍPIO
Correlaciona atividade enzimática com a presença de bactérias viáveis no alimento
O substrato enzimático é hidrolisado por enzimas microbianas produzindo um composto azul fluorescente, o 4-MU (4-metilumbeliferina)
OBS: existem kits especificos para coliformes e E.coli
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Processo em que uma molécula (enzima ou outro material biológico), estando no estado excitado, emite fótons de luz
Ocorre a detecção dos fótons emitidos durante o retorno da molécula ao seu estado normal, por um luminômetro ou um contador de cintilações
A Quantidade de luz formada: proporcional à quantidade de ATP presente na amostra
Tem sido bastante aplicado no controle da higienização e limpeza de superfícies: ATP pode ser proveniente de microrganismos, resíduos de alimentos ou de contato humano
BIOLUMINESCÊNCIA E ANÁLISE DE ATP
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MÉTODOS FLUOROGÊNICOS
Princípio:
 O caldo verde bile brilhante lactosado- Fluorocult contém uma substãnia que ao ser hidrolisada por bactérias como E. coli produz luminescencia quando em presença UV
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COLILERT
Formulação padronizada. Consiste em um sal que ao ser inserido na amostra e incubado apresenta coloração. A presença de coliformes é visualizada pelo aparecimento de coloração amarela no meio de cultura incolor. A presença de E. coli é detectada pela observação de fluorescência azul sob luz U.V.
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ÁGAR CHROMOCULT (MERCK)
Meio de cultura seletivo e diferencial utilizado para contagem de coliformes totais e E. coli em água e alimentos.
Lauril inibe o crescimento de bactérias Gram positivas
Colonias de coloração vermelha: Coliformes
Colonias de coloração azul: E. coli
Colonias incolores: Outras enterobactérias
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Perguntas:
1- Explique o procedimento