RELATÓRIO 1 BIOQUI - Carboidratos

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Prática de Bioquímica:
Monitoramento da hidrólise do amido e Identificação de açúcares redutores.
Alunas: Amanda Almeida, Caroline Reis, Gabrielle Alencar, Larissa Dessupoio e Larissa Venancio.
Professores: Fábio Cerdeira Lirio e Priscilla Henriques.
Prática realizada no dia: 06/04/2014.
Entrega do relatório: 13/04/2014.
Introdução
  Na forma de açúcar ou amido, os carboidratos representam a maior parte de ingestão calórica dos seres vivos. Os carboidratos podem estar junto com as proteínas (glicoproteínas e proteoglicanas) – importantes na superfície das células e dos sistemas de suporte extracelulares nos animais. Também são chamados de Hidratos de Carbono ou Glicídios. São compostos de função mista poliálcool-aldeído ou poliálcool-cetona, assim como todos os compostos que, por hidrólise, produzem os referidos compostos de função mista. Suas moléculas são constituídas, geralmente, por átomos de carbono, hidrogênio e oxigênio. As plantas verdes produzem açúcares na fotossíntese, a partir de CO2 e água. Os açúcares sofrem combustão, reagindo com o oxigênio e formando CO2 e água, na respiração celular. A combustão dos açúcares libera energia. Um importante exemplo de açúcar é a glicose, encontrada no interior das nossas células e no nosso sangue. Sua função básica é fornecer energia para as atividades vitais.  Os monossacarídeos são açúcares simples, cuja hidrólise não resulta em moléculas de açúcares menores. A glicose é um exemplo de monossacarídeo. Eles têm, geralmente, fórmula geral CnH2nOn, onde o valor de “n” varia entre 3 e 7.
  Os oligossacarídeos são formados pela união de 2 até 10 unidades de monossacarídeos. Os mais abundantes, na natureza, são os dissacarídeos, formados pela união de dois monossacarídeos.
Exemplo: C6H12O6 (glicose) + C6H12O6 (frutose) ===> C12H22O11 (sacarose) + H2O (água). 
A sacarose, o “açúcar de cana” ou de beterraba, é constituída por uma molécula de glicose ligada a uma frutose. A maltose é um dissacarídeo, pois é formada por duas moléculas de glicose. A lactose é encontrada somente no leite. Resulta da união de uma glicose com uma galactose. Dissacarídeos são dois monossacarídeos unidos entre si covalentemente – essa ligação que une os dois monossacarídeos é chamada de ligação glicosídica, a qual é formada pela reação entre um grupo hidroxila de um dos açúcares e o carbono anomérico do outro açúcar. As ligações glicosídicas podem ser hidrolisadas por ácidos e por fervura com ácido diluído. Os dissacarídeos mais comuns são: maltose, lactose e sacarose.
Maltose – constituída de 2 unidades de glicose. Origina-se dos polissacarídeos degradados por meio da enzima amilase. A maltose é hidrolisada no intestino pela enzima maltase.
Lactose – presente apenas no leite, quando hidrolisado libera D–galactose e D–glicose. É também um dissacarídeo redutor. A lactose é hidrolisada pela enzima lactase secretada pelas células da mucosa intestinal. Alguns grupos humanos (orientais, árabes, judeus, a maioria dos africanos, indianos e mediterrâneos), têm pouquíssima lactase intestinal, e muitos mostram intolerância à lactose. É uma diferença de natureza genética. Como a lactose não pode ser absorvida pelo intestino para a corrente sanguínea sem ser hidrolisada, permanece no trato intestinal das pessoas que tem intolerância à lactose. Assim pode causar diarréia aquosa, fluxo intestinal anormal e cólica abdominal.
Sacarose – Açúcar da cana, quando hidrolisada, forma glicose e frutose. Sintetizada por muitas plantas, não contém átomo de carbono anomérico livre, pois estão ligados entre si e desta forma é um dissacarídeo não redutor. Os animais não podem absorver a sacarose – assim ela é hidrolisada pela enzima sacarase ou invertase, existente nas células que recobrem o intestino delgado. Entre os três dissacarídeos, a sacarose apresenta o sabor mais doce. Porem, hoje existe adoçantes artificiais sem nenhum valor calórico alimentar e são muito usados por pacientes diabéticos ou obesos.
1.1 Polissacarídeo
  A maior parte dos carboidratos encontrados na natureza ocorre na forma de polissacarídeo de alto peso molecular. Alguns polissacarídeos são formas biológicas de reserva de monossacarídeos, outros são elementos estruturais de paredes celulares. Pela hidrólise, por ácido ou enzimas, são liberados na forma de monossacarídeos.
  Os polissacarídeos mais importantes de reserva são: o amido, encontrado nas células vegetais, e o glicogênio, encontrado nas células animais. As moléculas de amido e de glicogênio são altamente hidratadas, por possuírem vários grupos hidroxilas.
1.1.1 Amido
  O amido, conhecido também como amilo, é um polímero natural e é considerado um polissacarídeo pouco solúvel e de elevado peso molecular, formado por várias sequencias de dois polissacarídeos, a amilose e amilopectina, ou seja, são milhares de moléculas unidas por ligações químicas simples.
  A amilose é uma molécula formada por resíduos de glicose, que formam um polímero linear constituído de 250 a 300 resíduos de um composto químico chamado D-glicopiranose, já a amilopectina é uma macromolécula menos hidrossolúvel que a amilose, constituída por mais de 1400 resíduos de α-glicose. A amilopectina constitui aproximadamente 80% dos polissacarídeos existentes no grão de amido.
1.1.2 Açúcares Redutores
Um açúcar redutor é qualquer açúcar que, em solução básica, forma algum aldeído. Disto segue que o açúcar atua como um agente redutor, por exemplo, na reação de Maillard e reação de Benedict. Os principais açúcares redutores são frutose, glicose, maltose e lactose. A sacarose, sendo formada por glicose e frutose, pode tornar-se um açúcar redutor se sofrer ação enzimática ou hidrólise ácida. São açúcares redutores por possuírem grupo carbonílico e cetônico livres, capazes de se oxidarem na presença de agentes oxidantes em soluções alcalinas. Os dissacarídeos que não possuem essa característica sem sofrerem hidrólise da ligação glicosídica são denominados de açúcares não redutores. A análise desses açúcares é uma atividade rotineira nos laboratórios das indústrias alimentícias, nas quais pode-se observar uma certa carência, no que se refere a técnicas padronizadas para análises. Diversos reativos são utilizados para demonstrar a presença de grupos redutores, em açúcares. De fato, os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves tais como os íons férricos (Fe3+) e cúprico (Cu 2+). 
 Para se estimar o teor de açúcares redutores e açúcares redutores totais em alimentos, existem vários métodos químicos não seletivos que fornecem resultados, com elevado grau de confiabilidade, quando utilizados corretamente após eliminação de interferentes.
1.2 Teste com reagente de Fehling
  A solução de Fehling é um teste químico usado para diferenciar carboidratos solúveis em água de cetonas, sendo também um teste para monossacáridos. O teste fora desenvolvido pelo químico alemão Hermann Von Fehling, em 1849. Esta solução é sempre preparada de fresco em laboratório, composta inicialmente por duas soluções separadas, solução A e solução B de Fehling. O Fehling A é uma solução aquosa de sulfato de cobre (II), enquanto o Fehling B é uma solução aquosa incolor de tartarato de sódio e potássio (também conhecido como sal de Rochelle) e uma base forte. Iguais quantidades das duas soluções são adicionadas para originar a solução final de Fehling, que possui uma cor azul escura.  
  Este teste é usado para determinar se um composto com grupos funcionais “carbonila” se trata de um aldeído ou de uma cetona. O complexo de bistartarocuprato (II), presente na solução final, é um agente oxidante. O composto a testar é adicionado à solução de Fehling e a mistura é aquecida. Aldeídos são oxidados, dando um resultado positivo, mas as cetonas não o são (à exceção das α-hidroxicetonas). O bistartarocuprato oxida o aldeído a um ânion carboxilato, durante este processo, os cátions Cu2+ do complexo são reduzidos a cátions de Cu1+, que precipitam sob aforma de óxido de cobre (I), um sal insolúvel em água com cor vermelha, indicando um resultado positivo. Um resultado negativo corresponde à ausência do precipitado vermelho.
  O teste de Fehling pode ser usado como teste genérico para a presença de monossacáridos. Este dá um resultado positivo tanto para aldoses (devido ao grupo aldeído oxidável) como para cetoses (dado que estas se convertem para aldoses pela base do reagente).
  O teste de Fehling pode ser usado para monitorizar glicose na urina, como teste para Diabetes. Também é usado na degradação do amido para obtenção de xarope de glicose e maltodextrinas, como forma de medição das quantidades de açúcares redutores para a determinação do valor de equivalentes de dextrose (DE) do amido.
Teste com Lugol
  O lugol ou solução de Lugol é uma solução de I2 (1%) em equilíbrio com KI(2%) em água destilada. O iodeto de potássio é adicionado para aumentar a solubilidade do iodo por formação do ânion triatômico I3. O amido quando tratado com Lugol, modifica sua coloração, pois o amido reage com o iodo na presença de iodeto, formando um complexo de cor azul intensa, sendo visivel em concentrações mínimas de iodo. O amido é uma mistura de dois polissacarídeos estruturalmente diferentes: amilose e amilopectina.  A composição do amido é α-amilose, uma cadeia linear de resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas α-1,4 (que conferem a molécula uma estrutura helicoidal) e de amilopectina (proteína menos hidrossolúvel que a amilose), de cadeia principal idêntica a amilose, além disso, contém ramificações formadas, como no glicogênio, por ligações glicosídicas α-1,6. Na amilopectina estas ramificações ocorrem a cada 30 ou 20 resíduos de glicose, enquanto no glicogênio , a frequência é, em média, de uma ramificação a cada 10 resíduos.
2. Objetivos
Realizar o monitoramento da hidrólise do amido, identificar a presença de açúcares redutores em soluções de glicose, sacarose e Maltose e identificar a presença de açúcares redutores e amido em soluções diluídas de leite, mel e suco.
3. Materiais e métodos
Amido;
Ácido clorídrico 3N;
Lugol;
Água destilada;
Soluções à 4% de Glicose, Sacarose e Maltose;
Estante para tubos de ensaio;
1 tubo de ensaio 15x190mm;
13 tubos de ensaio de 10x150mm;
3 pipetas de 1 ml;
1 pêra;
1 bastão de vidro;
1 Frasco de Fehling A;
1 Frasco de Fehling B;
Lugol;
3.2 Métodos
3.2.1. Monitoramento da Hidrólise do Amido
 Em vidro de relógio, pesou-se 0,49 de amido e, em seguida, colocou-se amido em tubo de ensaio contendo 15 ml de HCl 3N. Foi retirado uma alíquota de 1 ml e dividiu o volume, 0,5 ml em um tubo e 0,5 ml em outro tudo. Este tubo foi marcado como tempo 0 da hidrólise. O restante da suspensão do amido foi colocado em aquecimento em banho Maria por 1 hora. Foram retiradas outras alíquotas nos tempos, 10, 20, 40 e 60 minutos, seguindo o mesmo procedimento do primeiro tubo. A cada retirada da suspensão, foram feitos o Teste de lugol e o Teste de Fehling, em tubos diferenciados e marcados devidamente.
No tubo para realização do Teste de Fehling, foram acrescentados 0,5 ml de água destilada e 0,5 ml de suspensão do amido. Adicionou-se a solução 1 ml do Fehling A, e 1 ml do Fehling B. E os tubos foram levados a banho maria a 80 ºC por 5 minutos. Esse procedimento foi feito individualmente a cada alíquota de suspensão do amido retirada. Observou-se a coloração.
No tubo para realização do Teste de lugol, adicionou-se 0,5 ml de suspensão de amido e 1 gota de lugol. Observou-se a coloração.
3.2.2. Identificação de Açúcares Redutores.
 Adicionou-se 1 ml de cada solução (Glicose, Sacarose e maltose) em tubos de ensaios diferentes. Após, adicionou-se a cada um dos tubos, 1 ml de Fehling A e 1 ml de Fehling B. Os tubos foram em banho maria por 5 minutos. Observou-se a coloração.
3.2.3. Pesquisa de amido e açúcares redutores no leite em pó, mel, e suco.
 Foi retirado uma alíquota de 1 ml de soluções recém-preparadas de leite em pó, mel e suco. E transferiu-se para 3 tubos diferentes. Repetiu-se o procedimento, tendo 2 tubos para cada solução. No primeiro tubo de todas as soluções, foi feito o teste de lugol, adicionando 1 gota de lugol nos tubos correspondentes. No segundo tubo foi acrescentado 1 ml de Fehling A e 1 ml de Fehling B. O segundo tubo foi levado a banho Maria por 5 minutos.
4. Resultados e Discussão.
Para o monitoramento da hidrólise de amido foram feitos dois testes. Um teste 1 utilizando o reagente de Fehling e um teste 2 utilizando o lugol.
O teste 1 realizado com o reagente de Fehling A e o reagente de Fehling B, são utilizados para identificar açúcares redutores. Esse teste faz uma oxidação seletiva de aldeídos e também uma oxidação dos carboidratos, em meio alcalino Cu2+ é reduzido a Cu1+. O íon Cu2+ produz o composto Cu2O, que tem uma coloração avermelhada. O Fehling A é uma solução aquosa de Sulfato de cobre (II) e o Fehling B é uma solução incolor de tartarato e hidróxido de sódio. O tartarato tem a função de quelar o cobre livre em solução, impedindo a formação do hidróxido de cobre e o NAOH serve para alcalinizar o meio para que a reação ocorra. Ao ser adicionado o Fehling A e, em seguida, o Fehling B, é observada a mudança de coloração do frasco de azul piscina (conforme figura 1) para azul escuro (conforme figura 2).Açúcar redutor + Cu2+ Cu2O
Vermelho tijolo (figura 3)
 Azul
Figura 3: solução após o aquecimento, mostrando o precipitado vermelho tijolo.
Figura 1: Solução + Feling A
Figura 2: Solução + Fehling B
O teste 2 utilizando Lugol, serve para identificar ramificações. Caso haja amido no alimento a coloração irá sofrer uma variação do azul escuro ao preto, isso acontece devido ao aprisionamento do iodo no interior da cadeia de amilose.
Após realizar os dois testes na solução de amido com HCl 3N, com a variação de tempo de 0, 10, 20, 40 e 60 minutos foi obtido os resultados expressos na tabela 1 e demonstrados na figura 4.
TABELA 1 – Resultados do teste de monitoramento da hidrólise do amido.
	Tempo de aquecimento 
	Teste de Fehling
	Teste de lugol
	0 min
	Azul
	Preto
	10 min
	Precipitado de cor vermelha tijolo
	Roxo escuro
	20 min
	Precipitado de coloração vermelha tijolo em maior quantidade
	Coloração verde escuro tendendo a preto
	40 min
	Precipitado de coloração vermelha tijolo
	Coloração marrom tendendo a preto
	60 min
	Precipitado vermelho
	Amarelo
Figura 4: foto dos tubos na ordem de tempo da tabela 1.
É importante ressaltar que após a adição dos reagentes Fehling A e Fehling B a solução de amido e HCl, foi deixado em um banho de aquecimento por mais cinco minutos.
Após o aquecimento foi identificado no teste 1 um precipitado de coloração vermelho tijolo, comprovando assim a presença de açúcares redutores. 
Para o teste 2 foi percebido que nos primeiros minutos de aquecimento a coloração da solução ao adicionar o Lugol era bem escura tendendo a preto, comprovando a presença do amido, porém após aquecer por uma hora foi notado que a coloração variou para amarelo, isso acontece porque o amido sofre hidrólise por aquecimento com ácido.
Para a identificação de açúcares redutores foi feito novamente o teste 1, utilizando o Fehling A e o Fehling B, porem desta vez foi utilizado soluções de Glicose, Sacarose e Maltose, ambas inicialmente incolores.
Foram observados os resultados expressos na tabela 2 e demonstrados na figura 5.
TABELA 2 – Resultados da Identificação de açúcares redutores em glicose, maltose e sacarose.
	
	Glicose
	Maltose 
	Sacarose
	Teste de Fehling
	Coloração vermelha tijolo
	Coloração vermelha tijolo
	Sobrenadante de coloração azul caneta e precipitado de coloração vermelha tijolo.
 Figura 5: Tubos contendo maltose, sacarose e glicose, respectivamente, após a realização do teste de Fehling.
Como ocorreu mudança de coloraçãodo azul caneta para o vermelho tijolo após o aquecimento, pode-se afirmar a presença de açúcares redutores nas soluções.
Pesquisa de amido e açúcares redutores em alimentos
Foram realizados teste de Fehling para a comprovação da existência de açúcares redutores (1ml de amostra + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + aquecimento em banho Maria à 80°C por 5 min) e o teste de verificação da presença de amido usando a solução do lugol ( 1ml de amostra + 1 gota de lugol) nas três seguintes amostras diluídas de mel, suco de goiaba e leite, conforme figuras 6, 7 e 8.
Figura 6: Mel
Figura 8: Leite em pó
Figura 7: Suco de Goiaba
Após a realização dos testes, foram obtidos os seguintes resultados expressos na tabela 3 e nas figuras abaixo.
TABELA 3 – Resultados do teste com leite, suco de goiaba e mel.
	
Amostra
	Teste de Fehling
(açúcares redutores)
	Teste do lugol
(presença de amido)
	
Leite
	
Permaneceu azul escuro. 
	
Amarelo leitoso
	
Suco de goiaba
	Formação de precipitado vermelho tijolo e sobrenadante azul intenso.
	
Incolor apresentando turvação.
	
Mel
	
Coloração vermelho tijolo com precipitado.
	
Amarelo forte.
Figura 9: Teste de Fehling
Figura 10: Teste do lugol
No teste de Fehling, a mudança de coloração de azul intenso para vermelho tijolo ou a formação de precipitado vermelho tijolo indica a presença de açúcares redutores, com resultado positivo no suco e no mel e negativo no leite.
Já no teste do lugol, a mudança da coloração da amostra para preto/marrom escuro após a adição de uma gota de lugol indica a presença de amido, com resultado negativo nas três amostras analisadas.
5. Conclusões.
Mediante o teste com lugol para identificação de amido e o teste com reagentes Fehling A e B para identificação de açúcares redutores, pode-se concluir que foi possível realizar com eficácia o monitoramento da hidrólise do amido e subsequente formação de glicose através das análises realizadas nos intervalos de tempo requisitados. Concluiu-se ainda que quanto maior o tempo de exposição da solução de amido ao calor do banho Maria, maior foi sua hidrólise, fato evidenciado pela mudança de coloração dos tubos (figura 4), onde quanto maior o tempo no banho, mais intensa foi a coloração vermelha com precipitado cor de tijolo. Conclui-se também que a identificação de açúcares redutores nas amostras (maltose, glicose e sacarose) e a apuração de amido e açúcares redutores em amostras de suco de goiaba, leite e mel foram atingidas, obtendo resultados positivos para a presença de açúcares redutores na glicose, maltose, mel e no suco de goiaba e ausência na sacarose e no leite. Verificou-se também a presença de amido através do teste com lugol, onde foi negativo no leite, suco e mel. Portanto, através dos testes realizados e dos resultados obtidos, conclui-se por fim que os testes em questão são de total eficácia e por meio deles foi possível obter resultados com veracidade e precisão sobre a presença do amido e de açúcares redutores nas amostras em questão.
6. Referências Bibliográficas.
ASQUIERI, E. R. et. al. Comparação de métodos para a determinação de açúcares redutores e totais em mel. Ciên. Tecnol. Aliment. nº 23(3): 337-341, 2003. 
BRUNO, A.N. Biotecnologia 1: princípios e métodos. 1 ed. Porto Alegre: Artheneu, 2014.
BURKET, C. A. V., “Separação de glicose, frutose, oligossacarídeos e dextranas utilizando zeólitas”. São Paulo, 2003. Tese de Doutorado - Faculdade de Engenharia de Alimentos, Unicamp, 2003.
CISTERNAS, J. R. et al. Fundamentos de bioquímica experimental. 2 ed. São Paulo: Atheneu, 2001.
COELHO, P. Reagente de Fehling. ENGQUIMICASANTOSSP. Disponível em <http://www.engquimicasantossp.com.br/2012/10/reagente-de-fehling.html>. Acesso em 12/04/2016.
CORSINO, J. Bioquímica. 1 ed. Campo Grande, MS: UFMS, 2009.
DESCONHECIDO, Autor. Carboidratos. Biomania. Disponível em <http://www.biomania.com.br/bio/conteudo.asp?cod=1772> . Acesso em 11/04/2016. 
FOGAÇA, J. Verificação de presença de amido em alimentos. Brasil Escola. Disponível em <http://educador.brasilescola.uol.com.br/estrategias-ensino/verificacao-presenca-amido-alimentos.htm> . Acesso em 11/04/2016.
NOGUEIRA, T. Amido. InfoEscola – Navegando e Aprendendo. Disponível em <http://www.infoescola.com/bioquimica/amido/>. Acesso em 11/04/2016.
RODRIGUES, J. Teste de Fehling – Laboratório Online. fCiências. Disponível em <http://www.fciencias.com/2014/10/16/teste-de-fehling-laboratorio-online/> . Acesso em 11/04/2016.