Resumo de Métodos de estudo de células

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Karoline Zorzan – Med UFF 113
Resumo de métodos de estudo de células
Microscópio óptico
Microscópio óptico é formado por uma lente ocular, um revólver com lentes objetivas, uma lente condensadora e uma fonte de iluminação (luz).
Todos os microscópios ópticos se baseiam em uma fonte de luz que é concentrada por um sistema de lentes condensadoras sobre uma amostra montada sobre a lâmina. O feixe luminoso atravessa a amostra e é captado por uma lente objetiva que produz uma primeira imagem ampliada do objeto, que será em seguida captada pela lente ocular que projetará a imagem final na retina do observador. A imagem final pode também ser capturada por uma câmara fotográfica ou de vídeo.
O aumento final é resultado da multiplicação do aumento dado pela lente objetiva pelo aumento da lente ocular. Como existem várias lentes objetivas num mesmo microscópio, uma grande variedade de aumentos pode ser obtidas, bastando girar o revólver.
Limite de resolução trata-se da menor distancia entre dois pontos em que eles podem ser vistos como objetos distintos. O limite de resolução do olho humano é de 0,2 mm, enquanto o do microscópio óptico é de 0,2 µm, dependendo da qualidade das lentes e, principalmente do comprimento de onda utilizado. Já o limite de resolução do microscópio eletrônico é de 0,1 nm ou 1Å. Aumento (ampliação da imagem) e resolução são coisas distintas, o aumento que não traz informação nova é chamado de aumento vazio.
Diferentes tipos de microscópio óptico
Microscópio de campo claro
É o microscópio "padrão”. Por apresentar um contrate ruim, em geral requer que a imagem seja preparada antes da observação. Corantes podem ser usados para corar células, de modo que elas possam ser facilmente vistas no microscópio de campo claro. Normalmente, os corantes provocam morte celular.
Caso a amostra não seja corada: o feixe de luz passa pela amostra, onde há estruturas que dificultam a passagem da luz, a imagem fica cinza ou preta, e onde a luz passa livremente a imagem fica branca. Então, obtemos uma imagem de fundo branco, com estruturas cinzas ou pretas.
Microscópio de campo escuro
O microscópio de campo escuro e o microscópio de contraste de fase foram desenvolvidos para melhorar o contraste entre a célula e o meio ao seu redor, tornando possível a observação das células sem o uso de corantes. Sem corantes, é possível observar células vivas.
O feixe de luz atravessa a célula, onde há estruturas que dificultam a passagem de luz, a imagem fica branca, e onde a luz passa livremente, a imagem fica preta. Então, temos imagens de fundo preto com estruturas brancas (inverso das imagens obtidas com o microscópio de campo claro).
Microscópio de contraste de fase
Um sistema de filtros de luz (anéis de fase) interfere no trajeto da luz, criando o contraste claro/escuro. Esse contraste dispensa o uso de corantes, permitindo a visualização de células vivas. Se as células observadas estão muito aglomeradas, imagem se torna muito confusa, requerendo um sistema óptico mais elaborado, o microscópio de interferência diferencial (DIC).
Microscópio de interferência diferencial (DIC)
O microscópio de interferência diferencial (DIC) também utiliza filtros para criar contraste a partir de diferenças no trajeto de luz, porém é um sistema óptico mais elaborado e mais caro. 
A imagem final é mais agradável para o observador, pois além do contraste claro/escuro, há também uma sensação de relevo. Também dispensa o uso de corantes, permitindo observar a célula viva. Quando as células formam camadas, pode-se focalizar apenas um plano, obtendo-se “cortes ópticos”, sem que a amostra seja realmente cortada.
Microscópio de fluorescência
Utiliza uma fonte de luz de comprimento de onda variável e requer o uso de corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes que, em última análise, se ligam a componentes específicos das células. Esses corantes são capazes de absorver luz de um determinado comprimento de onda e emitir em outro, dentro do espectro visível. Esse microscópio contém dois filtros. O primeiro, chamado filtro de excitação, seleciona o comprimento de onda que incidirá sobre a amostra corada. O corante fluorescente se excitará, e emitirá luz em outro cumprimento de onda. Essa luz emitida passará pelo segundo filtro, chamado de filtro de emissão, e posteriormente pela lente ocular, até chegar na retina do observador.
Os componentes biológicos geralmente não são florescentes, por isso é necessária a utilização de corantes ou de anticorpos. Em algumas situações, as células podem ser observadas vivas; em outras, não.
Microscópio confocal de varredura a lazer.
A conjugação da ciência da computação aos microscópios de fluorescência trouxe uma nova dimensão para a microscopia óptica. O microscópio confocal de varredura a lazer produz imagens tridimensionais de componentes celulares, obtidos a partir da junção de “cortes ópticos” da amostra, capturados e analisados no computador. Uma luz lazer incide sobre a amostra corada ou “marcada” com anticorpos, estimulando a fluorescência, sendo, então, captada por um receptor. 
Microscópio óptico multifotônico
O microscópio multifotônico utiliza dois fótons de luz que incidem sobre a amostra, possibilitando a captação de sinais e imagens que outros não conseguem captar, como por exemplo, sinais químicos de proteínas.
Microscópio óptico de força atômica
O microscópio de força atômica fornece imagens tridimensionais pela interação do ‘tip’ (ponta) com a amostra. É uma abordagem em nível molecular, cuja resolução se aproxima do microscópio eletrônico.
Preparo de amostras para o microscópio óptico
Além de pequenas, as células são, em geral, transparentes, muito hidratadas e frágeis, e precisam ser cortadas em lâminas finas que permitem a passagem de luz. Essas características tornam difícil a observação das células. Por isso, foram desenvolvidas técnicas de preparo de células que lhe conferissem maior resistência e contraste.
Observação vital ou exame a fresco: o material biológico vivo é colocado sobre uma lâmina de vidro e coberto por uma lamínula de vidro. Permite distinguir poucas estruturas intracelulares. Em exames a fresco, também podem ser utilizados corantes especiais, os corantes vitais, que penetram na célula sem mata-la.
Ou:
Fixação: consiste em matar rapidamente as células, preservando ao máximo sua estrutura original. As células são mergulhadas em líquido fixador (formol, ácido acético, álcool, etc), que tem propriedade de coagular proteínas da amostra.
Desidratação: é a substituição da água dentro e fora da célula por um solvente orgânico, como o etanol ou metanol. A desidratação ocorre de maneira gradual. Esse solvente pode ser tanto removido, deixando a lamina secar, quanto pode ser substituído por parafina ou outra resina que torne a amostra rígida, permitindo que seja fatiada. 
Secagem: remoção do solvente orgânico que substitui a água no processo de desidratação.
Inclusão: mergulha-se o material previamente fixado em parafina derretida (ou outra resina líquida) e espera-se que ela penetre na célula, esfrie e solidifique. A amostra fica, então, inserida num bloco de parafina solidificada.
Microtomia: um aparelho chamado micrótomo faz cortes extremante finos na amostra solidificada com parafina. Esses cortes finos permitem a passagem da luz, facilitando a observação do tecido no microscópio óptico.
Após os cortes com o micrótomo, a parafina é dissolvida por um solvente orgânico. As amostras são colocadas em uma lâmina de vidro, podendo ser, enfim, colorizadas com corantes.
Coloração: consiste em mergulhar preparações de células previamente fixadas em soluções de substâncias corantes. Certos corantes tem afinidade apenas por determinadas estruturas da célula, associando-se preferencialmente a elas. Assim, depois que a preparação é retirada do corante, lavada e observada no microscópio, essas estruturas tornam-se coloridas e destacam-se das demais.
Algumas técnicas de microscopia óptica:
Os anticorpos são proteínas produzidas pelosistema imune contra uma infecção. A precisa especificidade dos anticorpos pelo antígeno faz deles ferramentas importantes para o biólogo celular. Quando marcados com corantes fluorescentes, eles têm um valor inestimável para localizar moléculas especificas nas células por meio da microscopia de fluorescência ou confocal a lazer. 
Imunocitoquímica direta: um corante florescente é ligado diretamente a um anticorpo utilizado para reconhecimento específico da estrutura celular que se quer analisar (anticorpo primário).
Imunocitoquimica indireta: um sinal mais forte é alcançado utilizando-se um anticorpo primário não marcado, e depois, destacando com um grupo de anticorpos secundários marcados que se ligam a ele. 
A tecnologia do processamento de imagens no computador ou devonculação de imagens permitiu que algumas imperfeições do microscópio óptico fossem superadas, possibilitando alcançar o limite teórico de resolução. Assim, para aumentar nossa capacidade de observar células em condições de baixa luminosidade, podemos acoplar uma câmera digital sensível (câmera CDD) a um microscópio. Como as imagens produzidas por câmeras CDD estão na forma eletrônica, elas podem ser prontamente digitalizadas, transferidas a um computador e processadas de varias maneiras para extrair informação latente. Em outras palavras, a devonculação de imagens permite aumentar o contraste das mesmas.
Microscópios eletrônicos
Microscópios eletrônicos são instrumentos que utilizam um feixe de elétrons para produzir uma imagem ampliada de um objeto. Possuem um grande poder de resolução, isto é, não é apenas uma questão de aumentar as células e sim de permitir que sejam observadas estruturas menores dentro delas.
O feixe de elétrons é gerado pelo aquecimento de um filamento de tungstênio. O vácuo, dentro do microscópio eletrônico é necessário não apenas para impedir a combustão do filamento na presença de oxigênio, como também para impedir a colisão do feixe de elétrons com moléculas de ar. Por outro lado esse é um dos fatores que impossibilita a visualização de células vivas no microscópio eletrônico.
As lentes magnéticas orientam e desviam o feixe de elétrons da mesma forma que as lentes de vidro orientam e desviam o feixe de luz no microscópio óptico.
A amostra precisa ser cortada em fatias muito finas para ser atravessada por elétrons. Mesmo a lâmina de vidro mais fina barraria os feixes de elétrons. Por esse motivo são usadas telas de cobre para servir de suporte para os corte ultrafinos.
Tipos de microscópio eletrônico:
Microscópio eletrônico de transmissão:
Os microscópios eletrônicos de transmissão se baseiam na capacidade do feixe de elétrons de atravessar a imagem. Os elétrons barrados ou desviados serão excluídos da imagem final, resultando em pontos escuros, enquanto os elétrons que atravessam a amostra irão colidir com uma tela fluorescente, dando origem a pontos brancos. Então, teremos uma imagem de fundo branco, com estruturas escuras.
Para o estudo de estruturas internas da célula, esse microscópio é essencial.
Microscópio eletrônico de varredura:
No microscópio eletrônico de varredura, o feixe de elétrons percorre a superfície da amostra gerando um sinal que será visualizado por um monitor. Gera uma imagem tridimensional. Ideal para estudar a forma externa das amostras.
Preparo de amostras para o microscópio eletrônico
O ambiente no interior do microscópio (vácuo, feixe de elétrons) não é nem um pouco favorável à preservação da estrutura celular. Além disso, a composição química das células (basicamente átomos leves) também não é propícia à formação de imagens. Por isso, foram desenvolvidas várias técnicas para a visualização da célula.
Preparo de amostra para microscópio eletrônico de transmissão
Fixação: em geral é feita matando a célula rapidamente, mergulhando a amostra em soluções de fixadores que estabilizam a membrana e os constituintes celulares. Os mais utilizados são os formaldeídos (formol) e glutaraldeído.
Pós-fixação e constratação: como os seres vivos são compostos basicamente por átomos leves que desviam pouco ou nada a passagem do feixe de elétrons, são utilizados soluções de sais de metais pesados (Fe, Os, Ur, Pb), que além de melhorem a preservação da célula (pós-fixação), aumentam o contraste das amostras quando observadas no microscópio eletrônico de transmissão. Esses sais irão se impregnam seletivamente por determinadas estruturas celulares, o ósmio, por exemplo, se impregna preferencialmente com as membranas. 
Desidratação: substituição da agua nas células por um solvente orgânico, como álcool etílico ou acetona.
Inclusão: substituição do solvente orgânico por uma resina, que inicialmente é liquida, mas depois endurece. 
Ultramicrotomia: a amostra solidificada pela resina sólida permite que um aparelho chamado ultramicrótomo realize cortes ultrafinos. Esses cortes são finos o suficiente para o elétron atravessar a amostra em áreas que não foram impregnadas com metais pesados.
Obs: contratasção positiva (fundo branco com estruturas escuras) e contratasção negativa (fundo escuro com estruturas brancas)
Preparo de amostra para microscópio eletrônico de varredura 
Basicamente o mesmo preparo da amostra para o microscópio eletrônico de transmissão, mas com algumas alterações. Primeiro, a amostra não é cortada por um ultramicrotómo, já que o objetivo do pesquisador é estudar a forma externa, a superfície. Segundo, a amostra é revestida por ouro, ou algum outro metal condutor, para a geração do sinal.
Algumas técnicas de observação do microscópio eletrônico
Imulocalização com ouro coloidal: uma secção fina é incubada com um anticorpo primário especifico, e depois com um anticorpo secundário ao qual foi acoplada uma partícula de ouro coloidal. A partícula de ouro é eletrodensa e pode ser vista como um ponto preto no microscópio eletrônico.
Criofratura: a mostra é congelada. Com um aparelho é criado uma pequena fratura na amostra. Depois, o material é descongelado e recebe um banho com uma substancia condutora (platina, carbono, etc). Retira-se o material orgânico por ataque ácido, restando apenas o molde de substância condutora. A amostra é, então, levada ao microscópio óptico de transmissão. A criofratura gera uma imagem mais ‘vítrea’.
Obs: geralmente, a fratura ocorre na área de menor resistência da amostra. Assim, essa é a única técnica que possibilita a observação do interior da bicamada lipídica, pois a fratura ocorre normalmente entre os fosfolipídeos. 
Freeze etch: congelamento profundo ?