Aula UFF 2013 Medicina - Métodos estudo da célula

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 Os seres vivos são constituídos por células e por substâncias 
por elas produzidas. 
 
 As células são as unidades estruturais e funcionais dos 
organismos. 
 
 As células mais primitivas, derivadas dos protobiontes, são as 
procarióticas. 
 
 As mais evoluídas, provavelmente derivadas daquelas por 
associações simbióticas, são as eucarióticas. 
 
 Todas as células são limitadas por uma membrana semelhante 
e contêm em si o equipamento bioquímico para executar suas 
funções básicas. 
Células: unidades estruturantes dos seres vivos 
 A identidade celular foi conseguida a partir do momento em que a 
primeira célula ganha Uma MEMBRANA PLASMÁTICA, 
PROTETORA e REGULADORA da entrada e saída de substâncias 
da célula. 
 
 
Meio intracelular torna-se diferente do ponto de vista físico-químico em 
relação ao meio externo. 
 
 
 O grande avanço adaptativo sofrido pelas células foi a formação de 
dobras a partir da membrana plasmática: 
 cisternas 
 vesículas 
 compartimentos e retículos 
REVOLUÇÃO 1: DO PROCARIONTE RUMO AO 
EUCARIONTE 
Processo lento de aumento de níveis de oxigênio na atmosfera, dando tempo para 
estratégias evolutivas 
 
O HOLOCAUSTO DO OXIGÊNIO 
Primeiras etapas na evolução da Célula Eucariota 
Parede 
Celular 
Membrana Nua 
DNA 
Dobramentos 
Vesículas 
 intracelulares 
Perda da Parede Celular - Célula resultante 
circundada apenas por uma membrana flexível 
com os ribossomas (pontos pretos) aderidos. 
Dobramento da membrana celular permitiu à 
célula crescer, aumentando a área da superfície 
de absorção de nutrientes a sua volta. Neste 
ponto, as enzimas atuavam sobre o alimento 
apenas fora da célula. 
Dobras internas da membrana permitiram a formação de compartimentos 
isolados no interior da célula. A digestão poderia então ocorrer dentro e fora 
da célula. A internalização de pedaços de membrana aos quais o DNA estava 
ancorado criou um saco com DNA anexado – um precursor do núcleo celular. 
A emergência de elementos do citoesqueleto feitos por fibras 
e microtúbulos deu suporte interno para a célula crescente e permitiu 
que ela dobrasse a membrana externa e que movesse materiais para 
dentro. A célula então se tornou capaz de envolver grandes 
partículas e de ingerí-las internamente. Eventualmente, absorvia toda 
a comida usando enzimas que liberadas de sacos digestivos na rede 
de compartimentos internos em expansão. Alguns desses 
compartimentos envolveu a quantidade crescente de DNA. 
O fagócito primitivo começou ainda a 
utilizar o flagelo para propulsão. Adquiriu 
um verdadeiro núcleo (como 
compartimento envolvendo o DNA 
fusionado) entre a crescente família de 
estruturas celulares complexas que 
evoluíram das partes internalizadas da 
membrana celular. 
Esquema retirado do artigo de Duve, 1996 – The Birth of Complex Cellsde Duve C (1996). 
Scientific American 38-45. 
 
Etapas finais da evolução da célula eucariótica – A adoção de procariotos 
como convidados permanentes dentro de grandes fagócitos marcam a etapa final da 
evolução da célula eucariota. Os precursores do peroxissomos (bege) podem ter sido 
o primeiro procarioto a se desenvolver como uma organela de eucarioto. Eles 
detoxificavam os compostos destrutivos criados pelo aumento dos níveis de oxigênio 
na atmosfera. Os precursores da mitocôndria (laranja) foram mais adequados na 
proteção das células hospedeiras contra o oxigênio oferecendo ainda a grande 
vantagem de gerar moléculas energéticas (ATP). O desenvolvimento de peroxissomos 
e de mitocôndrias permitiram a adoção de precursores de plastídeos, como os 
cloroplastos (verde), centros de fotossíntese produtores de oxigênio. 
Metabolic symbiosis at the origin of eukaryotes TIBS 24 – MARCH 1999 
 Nascimento da CÉLULA EUCARIÓTICA, com seu 
SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS: 
 
 # MAIOR CRESCIMENTO CELULAR 
 
# MAIOR ESPECIALIZAÇÃO, DIVISÃO DE TAREFAS ENTRE 
COMPONENTES CELULARES E EFICIÊNCIA METABÓLICA 
 
# MAIOR PROTEÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO 
 
# MAIOR DIVERSIDADE DE ROTAS METABÓLICAS 
 
# FACILIDADE NO CONTATO E NA AGLOMERAÇÃO 
INTERMOLECULAR 
 
A Célula Eucariótica 
Procariotos Eucariotos 
 Sem núcleo individualizado Com núcleo individualizado 
Sem sistema de membranas internas 
(organelas) 
Com sistema de organelas 
delimitadas por membranas internas 
DNA presente geralmente como um 
único cromossoma, circular, que 
contém apenas um conjunto de 
genes 
DNA presente como cromatina no 
núcleo, estruturado em diversos 
cromossomas, e, com exceção dos 
gametas, está organizado em dois 
conjuntos de genes (diplóides) 
Divisão por fissão binária Divisão por mitose ou meiose 
(gametas) 
Pequenas (1 mm) Maiores ( 2-100 mm ) 
Células mais antigas (3, 8 bilhões 
anos) 
Células mais recentes (1,5 bilhões de 
anos) 
Subdividem-se em: 
Arquebactérias (3 bilhões de 
anos) 
Eubactérias (3,8 bilhões de 
anos) 
 Subdividem-se em: 
Plantas, animais, fungos e protistas 
 Imagem de microscopia eletrônica de 
transmissão (MET) de uma bactéria 
Uma célula animal típica tem 
um diâmetro de 10 a 20 
micrômetros, o que é 
aproximadamente 5 vezes 
menor que a menor partícula 
visível a olho nu. Somente 
quando microscópios ópticos 
de boa qualidade tornaram-se 
disponíveis, no início do 
século XIX, pode-se descobrir 
que tecidos animais e vegetais 
são agregados de células 
individuais. Esta descoberta, 
proposta como a teoria celular 
por SCHLEIDEN E 
SCHWANN, em 1838, marca 
o nascimento formal da 
biologia celular. 
Métodos de estudo da CÉLULA 
Imagem de MET de uma célula eucariótica 
Mitocôndria 
Núcleo 
Complexo de 
Golgi 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 12.1 - Tomograma a partir de imagens de microscópio eletrônico de alta voltagem - 
Compartimentos celulares / reconstrução tridimensional 
Somente pra citar alguns dos marcos da história da biologia celular: 
 
1611 - Kepler sugere maneiras para a construção de um microscópio composto. 
1655 - Robert Hooke descreve as primeiras células. 
1674 - Leeuwenhoek comunica a descoberta de protozoários. Visualiza uma bactéria pela primeira vez 
nove anos mais tarde. 
1838 - Schleiden e Schwann propõem a teoria celular, afirmando que a célula nucleada é a unidade da 
estrutura e função em plantas e em animais. 
1939 - Siemens faz o primeiro microscópio eletrônico de transmissão produzido comercialmente. 
1941 - Coons usa anticorpos acoplados a corantes fluorescentes para detectar antígenos celulares. 
1957 – Ácidos nucléicos foram separados. 
1996 - A primeira ovelha foi clonada. 
História 
A história das células tem início há cerca de 400 anos 
Microscópios: 
O microscópio ilustrado na figura é um microscópio composto 
simples utilizado pelo microscopista inglês Robert Hooke em 
1660. 
Conceitos Básicos em Microscopia Óptica (Microscopia de Luz) 
 
• produzem imagem ampliada de um espécime 
(objeto) 
• separam detalhes de uma imagem 
O “microscópio simples” era considerado o mais elevado estado de 
perfeição em 1600. 
No século 17, o cientista Robert Hooke foi a primeira pessoa a usar a palavra “célula” para 
identificar estruturas microscópicas em uma fatia de rolha: 
 
" . . . Estes poros, ou células, não são muito profundos, mas constituem várias pequenas caixas.” 
História 
Imagem extraída do livro “Micrographia”. 
Robert Hooke 
Livro publicado pelo microscopista Inglês Robert Hooke, em 1665. 
 Em 1665, Robert Hooke publicou um livro intitulado “Micrographia”, contendo desenhos de 
praticamente tudo que podia sever com a mais nova invenção, o microscópio. 
Conceitos Básicos em Microscopia Óptica (Microscopia de Luz) 
1838 - Schleiden e Schwann propõem a teoria celular 
 (3) As células são pequenos órgãos nos quais residem as forças que dirigem a 
reabsorção e a secreção. Em todas as superfícies absorventes aparece uma camada de 
células semelhantes, cujas células constituem o epitélio, contornam as vilosidades e são 
comparáveis às células das esponjas nas raízes das plantas. 
 (4) Todas as células exercem sobre o citoblasto uma ação química a distância 
(metabolismo) que determina as secreções. 
(1) As parte elementares mais diferentes 
dos animais e das plantas se 
desenvolvem de modo comum: sua 
origem é, em todos os casos, uma célula. 
 (2) Em cada tecido só se formam células 
novas nos pontos onde penetram 
elementos nutritivos novos: daí a 
diferença entre os tecidos que contêm 
vasos e os que não os têm. 
Matthias Schleiden 
(1804-1881) 
Theodor Schwann (1810-1882) 
-Microscopistas alemães- 
Como estudamos as células em Biologia Celular? 
 Microscopia: Microscopia de Luz (Óptica) 
Evolução dos Microscópios 
Elodea - Microscopia de luz 
Corantes podem ser usados para corar células e aumentar seu contraste de maneira que elas 
possam ser mais facilmente vistas ao microscópio de campo claro. 
Coloração 
(a) Olho de Gerbil, Hematoxilina-Eosina, (b) rim de Cobra, Biebrich Scarlet, (c) Asperigilus, Grocott´s Methamine Silver (GMS), (d) pele de 
cahorro, Masson´s Trichrome, (e) Bacillus tuberculosis, Acid Fast Stain, (f) Cabeça de Truta, Giemsa. 
a b c 
d e f 
Sangue - Microscopia de luz 
1a 
1b 1d 
1c 
Trichinella spiralis 
encistado em musc. 
Esquelético de cobaio, 
corado com HE 
Esporos de mofo 
corados com safranina 
em luz verde 
(Lycopodium) 
Feixe vascular 
(xilema e floema) 
de um rizoma 
Corte de trigo com 
uredosporos, corpo 
esporulante não corado, 
montado em imersão 
Fotomicrografias (mesmo campo) de Saccharomyces cerevisiae (a) Campo claro. (b) Contraste de fase. (c) Campo escuro. 
 
 
Microscópio de campo escuro e de contraste de fase 
O microscópio de campo escuro e de contraste de fase foram desenvolvidos para melhorar as 
diferenças de contraste entre as células e o meio ao seu redor, fazendo-se possível a 
observação de células sem a necessidade da utilização de corantes. 
Imagem de células usando microscopia de interferência de contraste diferencial. (a) Cultura de células epiteliais (b) Nematodo vivo (c) 
Exoesqueleto de radiolário 
 Microscópio de Contraste de interferência diferencial – DIC (Nomarski) 
a b c 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 23.8 – Megacariócito - Contraste de fase 
Fig. 16.11 – Célula muscular cardíaca - Contraste de fase 
Fig. 23.9 – Cicatrização de feridas - Contraste de fase 
Fig. 24.4 – Célula T citotóxica - Contraste de fase 
Fig. 16.2 – “Caça” e fagocitose de bactérias por neutrófilos - Contraste de fase 
Fig. 20.1 – Células de câncer de mama - Contraste de fase 
Fig. 16.2 - Quimiotaxia de neutrófilos vs. bactérias - Contraste de fase 
Fig. 15.2 – Quimiotaxia de neutrófilos - DIC 
Fig. 19.2 – Rolagem de linfócitos - Contraste de fase 
Fig. 23.10 – Homing de linfócitos - DIC 
Fig. 21.5 – Células precursoras de de neurônios do hipocampo do cérebro de embrião 
de roedor - Contraste de fase + DIC 
Fig. 1.1 – Dança do queratócito - DIC 
 
Microscópio de fluorescência 
Sondas de fluorescência 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 17.7 – Fuso mitótico / divisão de célula animal – Fluorescência 
 
 
 
 
 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 13.5– Fagocitose – Fluorescência 
Fig. 13.6– Exocitose – Fluorescência 
Fig. 15.1– Sinalização de cálcio / Gap junction – Fluorescência 
Fig. 17.4 – Fuso mitótico / divisão de célula animal – DIC 
Fig. 17.6– Fuso mitótico / divisão de células de embrião de mosca – Fluorescência 
Fig. 18.1– Apoptose / blebbing de membrana e fragmentação do núcleo - Contraste de 
fase e fluorescência 
 
 
 
 
 
 
Microscópio óptico confocal de varredura a laser 
(a) Sperm triple-labeled with FITC-Pisum sativum lectin (acrosome - green); TOTO-3 iodide for 
DNA (blue) and Nile red for membrane lipid (red). (b) Complete loss of the acrosome following 
spermicidal treatment. Staining as in the image above. (c) Cultured epithelial cells triple 
stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired 
with a 20X objective (c) and a 100X objective (d). 
Microscopia Confocal de Varredura a Laser 
a b 
c 
d 
Imagem Tridimensional 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 25.6– Sinapse imunológica / apresentação de antígeno – Fluorescência e 
processamento de imagem 
 
 
 
 
 
 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 24.3 – Listeria ínvadindo célula hospedeira – Contraste de fase e fluorescência com 
marcação de GFP 
Fig. 16.5 – Dinâmica de microtúbulos in vivo - Fluorescência com marcação de GFP 
Fig. 23.14 – Células-tronco embrionárias – Contraste de fase e fluorescência com 
marcação de GFP 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 10.6– FRAP / marcação com GFP de proteínas de membrana de retículo 
endoplasmático e de proteínas ancoradas na membrana nuclear interna 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 21.3– Ondas de Ca2+ após fertilização de ovos de ouriço do mar - Fluorescência 
 
 
 
 
 
 
 
 
Como estudamos as células em Biologia Celular? 
Micromanipulação celular 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 9.1 – Laser tweezer – Esquema 
Fig. 10.1 – Laser tweezer / Fluidez de membrana 
Fig. 23.2 – Laser tweezer / estereocílios 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Microscópio eletrônico de transmissão 
Microscópio eletrônico de varredura 
Microscopia Eletrônica 
1- Microscopia Eletrônica de Transmissão 
Microscópios eletrônicos são amplamente utilizados para o estudo de estruturas detalhadas da célula. 
Para o estudo de estruturas internas da célula, o microscópio eletrônico de transmissão (MET) é 
essencial. 
 ULTRAMICROTOMIA 
Microscopia Eletrônica 
Hexagonal 75 “mesh” 

  
Quadrada 200 “mesh” 
Contrastação 
Acetato de uranila e 
citrato de chumbo 
CONTRASTAÇÃO POSITIVA 
Objetivo: 
 Impregnar o material biológico com metais pesados, 
para aumentar o contraste da imagem. 
Cell Biology interactive 
 
Figs. 4.4 / 4.5 – Estrutura do núcleo – Microscopia eletrônica de transmissão 
Figs. 9.2 / 9.3 / 9.4 / 12.8 – Célula do fígado – Microscopia eletrônica de transmissão 
Figs. 13.7 / 13.8 – Células do pâncreas - Microscopia eletrônica de transmissão 
Fig. 12.9 – Célula secretora pancreática - Microscopia eletrônica de transmissão 
Fig. 16.12 – Tecido cardíaco - Microscopia eletrônica de transmissão 
Fig. 16.13 – Célula muscular cardíaca- Microscopia eletrônica de transmissão 
Fig. 19.3 – Junções entre céulas musculares - Microscopia eletrônica de transmissão 
Fig. 23.11 – Epitélio da traquéia - Microscopia eletrônica de transmissão 
Figs. 23.12 / 23.13 – Células endoteliais do fígado - Microscopia eletrônica de transmissão 
Figs. 23.4 / 23.5 / 23.6 – Epitélio do intestino - Microscopia eletrônica de transmissão 
Fig. 17.8– Cromossomos mitóticos - Microscopia eletrônica de transmissão 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CORTES SERIADOS 
Imunocitoquímica ultra-estrutural(e) métodos imunocitoquímicos, com a utilização de 
anticorpos policlonais e monoclonais 
Mic 
RA 
GD 
GA 
PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA 
Microscopia Eletrônica de Varredura 
Microscopia Eletrônica 
Formiga de fogo Lorryia formosa 
Embrião de camundongo Diatomácea Pata de Centopéia 
Microscopia Eletrônica de Varredura 
Microscopia Eletrônica 
Bactérias aderidas ao arenito por estruturas semelhantes 
a pedúnculos (a) e envolvidas por substância amorfa - 
possivelmente matriz extracelular (a e b, seta). 
Poço Produtor (Marlim) 
a 
b 
Bactéria 
Pedúnculo 
Matriz extracelular Testemunho 02 (arenito) 
CRIOFRATURA 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 12.7– Criofratura de fungo - Microscopia eletrônica de transmissão 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CRIOFRATURA 
CRIOFRATURA 
CRIOFRATURA 
Contrastante 
 
PTA-ÁCIDO FOSFOTUNGÍSTICO 
CONTRASTAÇÃO NEGATIVA 
Consiste no envolvimento 
de partículas por metais 
pesados e de fina 
granulação, fornecendo 
imagens de fundo escuro e 
o objeto claro. 
 
 Ideal para análise de 
suspensão viral, bactérias 
e pureza de fracionamento 
celular. 
 
a) Bacteriófago; b) Vírus da batata; 
c) Adenovírus; d) Vírus da influença 
CONTRASTAÇÃO NEGATIVA 
Ultra-estrutura de macromoléculas 
Macromoléculas podem ser 
observadas por microscopia 
eletrônica de transmissão 
através da técnica de 
contrastação negativa, 
depositadas diretamente nas 
grades. 
 
Sua visualização depende da 
preparação de grades 
recobertas com uma fina 
camada de carbono para 
posterior adsorção das 
moléculas a serem 
analisadas. 
 Adsorção das macromoléculas à superfície das 
grades revestidas, contrastação negativa e 
observação ao Microscópio Eletrônico de 
Transmissão 
Moléculas de 2M (nativa, quimiotripsina, plasmina e metilamina. Contrastação por 
acetato de uranila. Aumentos - 200.000-600.000x. Delain et al. 1989. 
Ultra-estrutura de macromoléculas 
Cell Biology interactive 
 
Fig. 12.1 - Tomograma a partir de imagens de microscópio eletrônico de alta voltagem - 
Compartimentos celulares / reconstrução tridimensional 
Fig. 13.9 – Vesícula sináptica – Tomograma de imagens de microscopia eletrônica de 
transmissão 
Fig. 14.1– Mitocôdria – Tomograma de imagens de microscopia eletrônica de transmissão 
 
 
Bactéria endocitada por um macrófago 
Bacteriófago T4 Músculo estriado de água-viva. 
Microscopia Eletrônica