Slides da Aula de Biologia Geral - Métodos analíticos II – Microscopia eletrônica

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09/09/2013
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Métodos analíticos para o 
estudo da célula –
Microscopia eletrônica
Métodos analíticos para o 
estudo da célula –
Microscopia eletrônica
Introdução
 Microscópio eletrônico  utiliza um feixe de elétrons para “iluminar” a 
amostra;
 Dois tipos principais:
1. Microscópio eletrônico de transmissão (MET ou TEM em inglês);
2. Microscópio eletrônico de varredura (MEV ou SEM);
 MET  análise de imagens formadas por elétrons que atravessam a 
amostra;
 MEV  análise de imagens formadas por elétrons refletidos ou emitidos 
pela superfície da amostra.
Limites de resolução de um 
microscópio eletrônico
Sistema Comprimento 
de onda 
incidente 
(nm)
Limite de 
resolução 
(μm)
Poder de 
aumento (x)
Olho
humano
Luz visível 
(380 – 740)
200 1
Microscópio 
de luz
Luz visível 
(380 – 740)
0,2 1 x 10³
Microscópio 
eletrônico
Feixe de 
elétrons 
(0,000005)
1x10-4 (MET) 
ou 4x10-4
(MEV)
1x107 (MET) 
ou 8x106
(MEV)
MET vs MEV
HF-3300 300 kV FE-TEM SU3500 Premium VP-SEM
LR: 3 nm / Aumento: 800.000xLR: 0,1 nm / Aumento: 1.500.000x
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ML vs MET vs MEV Microscópio Eletrônico de Transmissão
 Desenvolvido em meados de 1930;
 Uso em pesquisas científicas (difundido a partir de 1950 – fim da guerra);
 Revolução do estudo de componentes celulares: 1000x melhor que um 
microscópio de luz;
 Poder de resolução  inversamente proporcional ao comprimento de 
onda (λ);
 MET: λ depende da voltagem. Tipicamente, 0,000005 nm < λ < 0,2 nm;
 Teoricamente: possibilidade de enxergar detalhes atômicos;
 Na prática: problemas na construção das lentes impossibilita;
Microscópio eletrônico de Ultra 
voltagem (3 MV)
 Especificações:
 Resolução: 0,14 nm;
 Ampliação: 200 a 1.000.000x
 Vantagem:
 Análise de espécimes mais 
espessos (maior poder de 
penetração em tecidos);
 Teoricamente, resolução ótima 
pode ser alcançada.
Partes do MET
1. Sistema de iluminação:
 Canhão eletrônico;
 Filamento de tungstênio;
 Excitação dos átomos 
liberação de elétrons;
 Elétrons são acelerados por um 
ânodo de alta voltagem 
(tipicamente de 15 a 300 keV).
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Partes do MET (cont.)
2. Lentes eletrônicas:
 Condensadora;
 Objetiva;
 Projetora;
 Mesmas funções das lentes do ML;
 Elétrons não passam por vidro ou 
quartzo;
 Lentes 
eletrostáticas/eletromagnéticas;
 Solenóides;
 Iluminação, foco e ampliação 
variações na corrente.
Papel das lentes em um MET
 Condensadora:
 Agrupa os elétrons em um feixe;
 Objetiva:
 Promovem o primeiro aumento;
 Imagem invertida;
 Projetora:
 Segundo aumento;
 Imagem corrigida;
 Projeção em uma tela (écran).
Lentes eletrônicas
 Fios enrolados em um cilindro de 
ferro doce (inerte ao campo 
magnético);
 Defeitos das lentes eletrônicas:
 Astigmatismo  assimetria do 
campo magnético;
 Corrigida por magnetos auxiliares;
 Aberração esférica  assimetria na 
deflexão de elétrons mais distantes 
do eixo  imagem desfocada;
 Minimizada por lentes especiais;
 Aberração cromática  assimetria 
na energia dos elétrons;
 Não há correção, melhora com 
processamento de amostra.
Partes do MET (cont.)
3. Porta-amostras:
 Baixo poder de penetração dos 
e-;
 Lâmina de vidro;
 Película plástica  formvar ou 
colódion;
 Extremamente delgado (20 nm);
 Rígidos e transparentes;
 Colocado sobre suporte (telinha) 
com furos de diâmetros variados.
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Partes do MET (cont.)
4. Tela (écran):
 λ do feixe de e- < capacidade 
humana...
 Não há sensibilização da retina;
 Tela coberta com substâncias 
fosforescentes (ZnSO4);
 e- ZnSO4 Fosforescência!
Partes do MET (cont.)
5. Sistema de vácuo:
 Ar tem alta resistência, impede o fluxo de e-;
 Amostras precisam ser dessecadas;
 Pressão interna = pressão externa;
6. Sistema de fotodocumentação:
 Câmera fotográfica/vídeo; computador; impressora laser;
7. Circuito eletrônico de regulagem e estabilização de corrente:
 Voltagem de aceleração e corrente das lentes  estáveis!
Formação da imagem (MET)
 Interação entre e- e átomos da 
amostra;
 Espalhamento ou “scattering” 
desvio da trajetória;
 Quanto maior o átomo, maior o 
espalhamento e maior o 
contraste;
 Átomos de amostras biológicas 
(C, H, O, e N)  leves  pouco 
contraste.
Quanto mais eletrondensa a amostra 
menor o número de elétrons transmitidos.
Projeção de elétrons
 Visualização na tela é proporcional ao 
número de elétrons:
 Regiões elétron densas:
 Difração total de elétrons (áreas 
escuras);
 Regiões elétron translúcidas:
 Difração parcial de elétrons (áreas 
intermediárias);
 Regiões elétron transparentes:
 Ausência de difração (áreas claras).
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Preparação de amostras (MET) Preparação de amostras (MET)
 Partículas em suspensão (vírus 
nanopartículas, etc.):
1. Metalização ou sombreamento e 
contraste negativo;
 Tecidos:
1. Fixação  glutaraldeído e 
formaldeído;
2. Pós-fixação  tetróxido de ósmio:
 Contraste de lipídios e estabilização 
de proteínas;
3. Desidratação  álcool ou 
acetona;
4. Inclusão  resinas plásticas;
Inclusão Preparação de amostras (MET)
5. Ultramicrotomia:
 Navalhas de vidro ou diamante;
 Fatias de 50 nm de espessura;
6. Contraste:
 Soluções de metais pesados:
 Acetato de uranila;
 Citrato de chumbo;
 Melhoramento do contraste.
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Preparação de facas de vidro Contraste
 Acetato de uranila / citrato de 
chumbo  átomos pesados 
aumentam o contraste 
(corantes);
 Contraste positivo:
 Amostra é corada;
 Contraste negativo:
 Sobras de corante permanecem 
em volta da amostra;
 Sombreamento:
Sombreamento
 Evaporação de metais de um fio 
de platina;
 Determinação de um ângulo de 
incisão;
 Em uma direção: pseudo 3D;
 Em todas as direções: 
visualização de ácidos nucléicos 
e proteínas.
Rotary Shadowing
 Visualização de ácidos nucléicos 
e proteínas!
  Visualização de moléculas de 
miosina!
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Montagem das telinhas
Dissecador
Exemplos de micrografias de 
transmissão
Identifiquem os 
métodos utilizados 
no contraste das 
amostras
Identifiquem os 
métodos utilizados 
no contraste das 
amostras
Immunogold (anticorpos marcados)
Anticorpos específicos 
produzidos em 
camundongos (ou 
coelhos) e marcados 
com uma partícula de 
ouro: reconhecimento 
de estruturas celulares
Anticorpos específicos 
produzidos em 
camundongos (ou 
coelhos) e marcados 
com uma partícula de 
ouro: reconhecimento 
de estruturas celulares
Microscopia Eletrônica de Varredura
 Possui menos lentes que o MET 
(portanto é menor);
 Sistema de lentes focalizam e 
solenoides movimentam o feixe 
de e-;
 Elétrons interagem com a 
amostra e são captados por 
detectores específicos;
 Imagem é gerada em uma tela 
de computador.
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Interações e- vsmatéria
 Cátodo-luminescência ou 
fluorescência  emissão de 
fótons;
 Elétrons retro-espalhados
(“backscattering”)  elétrons 
refletidos;
 Elétrons secundários  expelidos 
pela entrada de um e- em seu 
lugar;
 Raios-X  resultado da expulsão 
de elétrons secundários 
padrão específico para cada 
tipo de átomo (microanálise).
Elétrons secundários são a principal 
fonte de informações topográficas!
Elétrons secundários são a principal 
fonte de informações topográficas!
Constituição do MEV
 Canhão de elétrons: similar ao 
MET, voltagens menores (5-40 kV);
 Lentes eletrônicas: conjunto de 
solenoides para coordenar o 
feixe de e- (3 a 5 nm de 
espessura);
 Estágio para amostra: encaixe 
para colocação da amostra no 
aparelho;
 Porta amostra: disco metálico 
para afixar a amostra.
Componentes do MEV (cont.)
 Circuito de varredura:
 Solenoide pulsátil que executa um 
movimento de varredura em uma 
frequência específica;
 Coletor de elétrons secundários:
 Possui carga + para atrair os e-
liberados;
 Possui um cintilador (placa plástica 
com substância fluorescente);
 Amplificador de sinais:
 Fótons fluorescentes são 
convertidos em sinais eletrônicos. Detector encontra-seem sincronia 
com o monitor, gerando uma 
imagem completa.
Detector encontra-se em sincronia 
com o monitor, gerando uma 
imagem completa.
Preparo da amostra (MEV)
 Emissão de ES é abundante 
quando a amostra é boa 
condutora metais não 
necessitam de preparo prévio;
 Tecidos biológicos mau 
condutores  devem ser 
revestidos de um metal (ouro o 
mais comum);
 “Sputter coater”;
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Secagem ao ponto crítico (materiais 
delicados)
 Etapa necessária antes do 
revestimento para materiais 
moles;
 Água presente nos tecidos 
poderia evaporar no vácuo e 
deformar as estruturas;
 Desidratação por acetona 
CO2 líquido  evaporação 
gradual regulada pela pressão;
 Evita-se a deformação de 
amostras.
Preparo de amostra (MET)
Resultado
Créditos:
Museum of Science
Créditos:
Museum of Science
ML vs MEV
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Aplicações do MEV
 Observação de detalhes de superfície de qualquer material (dente):
Aplicações do MEV
 Útil na taxonomia de vários organismos (microestruturas):
Aplicações do MEV
 Análises de raio-x: composição de solos:
Criofratura
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MEV em cortes ultrafinos Microscopia de força atômica
Bons estudos! Links interessantes
 http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/index.html
 http://www.ammrf.org.au/myscope/
 http://www.udel.edu/biology/Wags/b617/tem/tem.htm
 http://virtual.itg.uiuc.edu/training/EM_tutorial/