Slides da Aula de Biologia Geral - Métodos analíticos III – Fracionamento celular

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9/25/2013
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Métodos analíticos para 
o estudo da célula –
Fracionamento celular
Importância do fracionamento
 Estudar componentes individuais;
 Separação de macromoléculas e/ou organelas;
 Caracterização estrutural, bioquímica, biofísica, etc...
Etapas do fracionamento
1. Homogenização:
 Ato de romper as células e liberar seu conteúdo;
2. Separação:
 Utiliza-se das diferentes características físico-químicas de cada 
componente celular;
3. Fracionamento:
 Coleta de cada um dos componentes em recipientes diferentes.
Ao final do processo, ocorre o ENRIQUECIMENTO 
de um componente em relação aos outros
Homogenização
 Rompimento físico ou químico das 
membranas e/ou paredes 
celulares;
 Processos físicos:
 Dilaceração, maceração, alta-
pressão, ultrassom, congelamento, 
etc.
 Processos químicos:
 Detergentes, diferença de pressão 
osmótica, enzimas, etc.
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Processos físicos de 
homogenização
Lysis Method Apparatus Description
Mechanical Waring Blender Polytron
Rotating blades grind 
and disperse cells and 
tissues
Liquid Homogenization
Dounce Homogenizer 
Potter-Elvehjem
Homogenizer
French Press
Cell or tissue suspensions 
are sheared by forcing 
them through a narrow 
space
Sonication Sonicator High frequency sound waves shear cells
Freeze-Thaw Freezer or dry ice with ethanol
Repeated cycles of 
freezing and thawing 
disrupt cells through ice 
crystal formation
Manual grinding Mortar and pestle Grinding plant tissue, frozen in liquid nitrogen
Detergentes utilizados nas 
extrações químicas
Detergent Type Agg.#
MW 
mono 
(micelle)
CMC 
mM 
(%w/v)
Cloud 
Point 
°C
Dialyzable
Triton X-100 Nonionic 140 647 (90K) 0.24 (0.0155) 64 No
Triton X-114 Nonionic – 537 ( – ) 0.21 (0.0113) 23 No
NP-40 Nonionic 149 617 (90K) 0.29 (0.0179) 80 No
Brij-35 Nonionic 40 1225 (49K) 0.09 (0.1103) >100 No
Brij-58 Nonionic 70 1120 (82K) 0.08 (0.0086) >100 No
Tween 20 Nonionic – 1228 ( – ) 0.06 (0.0074) 95 No
Tween 80 Nonionic 60 1310 (76K) 0.01 (0.0016) – No
Octyl glucoside Nonionic 27 292 (8K) 23-24 (~0.70) >100 Yes
Octyl thioglucoside Nonionic – 308 ( – ) 9 (0.2772) >100 Yes
SDS Anionic 62 288 (18K) 6-8 (0.17-0.23) >100 No
CHAPS Zwitterionic 10 615 (6K) 8-10 (0.5-0.6) >100 Yes
CHAPSO Zwitterionic 11 631 (7K) 8-10 (~0.505) 90 Yes
Homogenização Separação - Centrifugação
 Separação dos componentes celulares por 
tamanho e/ou densidade durante a 
aplicação de uma força centrífuga;
 Centrifugação analítica:
 Possibilita a determinação da massa de 
moléculas em suspensão;
 Requer taxas de velocidades diferentes;
 Centrifugação diferencial;
 Centrifugação em gradiente;
 Zonal;
 Isopícnica;
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Centrifugação diferencial
 Depende da velocidade 
de rotação;
 Componentes mais 
pesados decantam 
mesmo em velocidades 
mais baixas;
 Realizado em etapas 
separação em frações;
 Pode apresentar 
contaminantes.
Centrifugação Zonal
 Depende da massa dos 
componentes;
 Utilização de um gradiente de 
densidade (sacarose, cloreto de 
césio, etc);
 Gradiente de baixa 
concentração (5% a 20%);
 Componentes celulares são todos 
mais densos do que o gradiente;
 Em tempo suficiente, todos os 
componentes se depositam no 
fundo.
Volume a ser aplicado é 
reduzido (apenas 10% do tubo, 
o resto serve para o gradiente)
Centrifugação isopícnica (ou de 
equilíbrio)
 Depende da densidade dos 
componentes;
 Gradiente de densidade em alta 
concentração (20% a 70%);
 Mais denso que os componentes 
celulares;
 Componentes celulares migram 
até que o EMPUXO não permita 
mais;
 Mesmo com muitas horas de 
operação, os componentes de 
baixa densidade NUNCA 
chegarão ao fundo do tubo.
Sedimentação por velocidade x 
por equilíbrio
Durante o 
fracionamento, o 
tubo é furado e 
as diferentes fases 
são coletadas em 
tubos diferentes.
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Coeficiente de sedimentação (s)
 Definido pela relação entre a 
velocidade com que uma 
partícula sedimenta em uma 
dada solução e a aceleração da 
centrífuga aplicada.
 S = v/a = m {1-(d/d’)}/f
onde:
m = massa da partícula;
d = densidade da partícula;
d‘ = densidade do solvente;
f = coeficiente de fricção.
Preparação de DNA plasmidial de 
bactérias
Separação - Cromatografia
 Muito utilizado para separação de 
proteínas;
 Amostra (soluto) interage 
fisicamente com duas fases:
 Móvel (solvente, gás);
 Estacionária (matriz);
 Fase móvel arrasta a amostra pela 
fase estacionária;
 Interação entre amostra e fase 
estacionária afetará a 
mobilidade;
Tipos de cromatografia
a) Partição (papel ou camada 
delgada);
b) Coluna (troca iônica, hidrofóbica, 
filtração em gel, afinidade);
c) HPLC (high-performance liquid
chromatography).
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Cromatografia de papel
 Exemplo:
 Fase estacionária – papel 
(celulose);
 Fase móvel – Solvente orgânico;
 Amostra – pigmentos da caneta;
 Força motriz = capilaridade.
Cromatografia em coluna
Tipos de cromatografia em coluna
Cromatografia em coluna
 Purificação de uma proteína em 
três etapas consecutivas:
 A) troca iônica;
 B) Filtração em gel;
 C) Afinidade.
HPLC
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Análise - Eletroforese
Migração em uma matriz (gel), com 
porosidade regulada (concentração da 
matriz), mediada por corrente elétrica.
Proteínas estão sujeitas às cargas das 
cadeias laterais de seus aminoácidos;
Devem migrar apenas pelo seu tamanho;
SDS  detergente que desnatura a 
proteína, envolvendo-a e conferindo 
uma carga uniforme.
SDS PAGE
Focalização isoelétrica Eletroforese bi-dimensional
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Espectrometria de massas
Baseada no tempo de 
voo de uma amostra 
ionizada:
Depende da massa;
Depende da carga;
Separados pela 
trajetória dentro do 
aparelho;
Descritas por um 
detector. 
Técnicas de manipulação de 
genes
Amplificação do DNA: PCR;
Enzimas de restrição: cortam o DNA;
DNA ligase: ligação de fragmentos;
Transgênicos;
Replicação em bactérias: expressão 
heteróloga;
Maioria dos estudos de biologia 
molecular.
PCR Ctrl+C Ctrl+V
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Eletroforese