ferramentas da engenharia genetica

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Ferramentas da Engenharia Genética 
 
Para a realização da TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE podemos contar 
com diversas ferramentas que nos auxiliam em cada uma das etapas do processo. 
Entre essas ferramentas temos: 
 
a) Enzimas: Temos um conjunto de enzimas que nos proporcionam tal evento; 
entre elas vamos destacar as ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO e as DNA 
LIGASES. As endonucleases de restrição (também conhecidas como 
enzimas de restrição) são enzimas encontradas naturalmente em bactérias, 
utilizadas para realizar cortes nas cadeias de nucleotídeos (tanto do RNA 
quanto do DNA). Cada enzima de restrição corta o material genético. São 
partes palíndromas (que apresentam a mesma leitura de trás para frente e de 
frente para trás). As extremidades das partes cortadas recebem o nome de 
extremidades de ligação, pois graças ao processo “palíndromo” são 
antiparalelas e se encaixam perfeitamente, conforme podemos observar na 
figura abaixo: 
 
Enzimas Organismo fonte Sítio de restrição de DNA bifilamentar 
Estrutura dos produtos 
cortados 
(a) 
EcoRI 
Escherichia coli 
 ↓ 
5'-G-A-A-T-T-C- 
 -C-T-T-A-A-G-5' 
 ↑ 
-G 5' A-A-T-T-C- 
-C-T-T-A-A 5' G- 
PstI Providencia stuartii 
 ↓ 
5'-C-T-G-C-A-G- 
 -G-A-C-T-C-5' 
 ↑ 
-C-T-G-C-A 3' g- 
-G 3' A-C-G-T-C- 
 
 
 
 
 
 
 
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Essas enzimas reconhecem e clivam o DNA em sequencias de DNA específicas, 
chamadas de sequencias de reconhecimento ou sítios de restrição, para gerar 
um conjunto de fragmentos menores. Enquanto que as DNA ligases fazem a 
união entre o fragmento de DNA a ser clonado e o vetor de clonagem, falaremos 
mais adiante dos vetores. 
 
b) Vetores de clonagem: Uma molécula de ADN deve dispor de várias 
características de modo a ser capaz de agir como um veículo para a 
clonagem de genes. A característica mais importante é que deve ser capaz 
de se replicar dentro da célula hospedeira, de modo a que se possam 
produzir numerosas cópias de ADN recombinante, sendo estes capazes de 
SmaI Serratia marcescens 
 ↓ 
5'-C-C-C-G-G-G- 
 -G-G-G-C-C-C 5' 
 ↑ 
-C-C-C G-G-G- 
-G-G-G C-C-C- 
(b) 
HaeIII 
Haemophilus aegyptius 
 ↓ 
5'-G-G-C-C 
 -C-C-G-G- 5' 
 ↑ 
-G-G 5' G-G 
-G-G '5 G-G- 
HpaII 
Haemophilus 
parainfluenzae 
 ↓ 
5' -C-C-G-G- 
 -G-G-C-C 5' 
 ↑ 
-C C-G-G- 
-G-G-C C- 
 
 
 
 
 
 
 
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passar para as células filhas. Um veículo de clonagem também precisa ser 
relativamente pequeno. 
 
c) Plasmídeos: Eles podem ser introduzidos nas células bacterianas 
(geralmente uma Escherichia coli) por um processo denominado 
transformação. Algumas células são naturalmente permeáveis para a 
captação do DNA e não requerem tratamento com cloreto de sódio, contudo a 
maioria requer um tratamento prévio para que a membrana se torne 
permeável. Como nem todas as células são capazes de capturar o DNA do 
plasmídeo, torna-se necessário um método para selecionar aquelas que o 
fazem. A estratégia usual é usar um plasmídeo que, além do gene de 
interesse, tenha também um gene que as células hospedeiras também 
requeiram para o crescimento sob condições específicas, como um gene que 
confere resistência a um determinado antibiótico. Assim, apenas as células 
transformadas pelo plasmídeo recombinante podem crescer na presença 
daquele antibiótico, selecionando, dessa forma, as células de interesse. O 
gene que confere resistência ao antibiótico é chamado de um marcador de 
seleção. Um plasmídeo para ser um bom vetor de clonagem deve conter as 
seguintes propriedades: 
1. Possuir uma origem de replicação (O), ou seja, uma sequência de 
DNA que permita que o vetor seja replicado na célula hospedeira. 
2. Apresentar dois ou mais sítios únicos de clivagem para endonucleases 
de restrição. O conjunto desses sítios, denominado de Múltiplos Sítios 
de Clonagem (MSC), é o local onde o inserto é incorporado ao vetor 
de clonagem. 
3. Possuir um gene que codifica um produto que distingue a célula 
transformada da célula não transformada. Por exemplo, muitos vetores 
de clonagem carregam o gene que confere resistência à ampicilina 
(AmpR). As células transformadas com tais vetores são capazes de 
 
 
 
 
 
 
 
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crescer num meio contendo o antibiótico, enquanto que as células não 
tranformadas acabam morrendo. 
 
d) Bacteriófagos: Um dos fagos mais utilizados nos processos de clonagem 
molecular é o denominado bacteriófago λ. O fago λ é um parasita 
obrigatório da E.coli que necessariamente deve injetar o seu DNA na bactéria 
hospedeira para a sua multiplicação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Representação esquemática fago λ (Cabeça e cauda) 
 
e) Cosmídeos: Podem ser usados como veículos de clonagem molecular 
empregando o sistema de empacotamento in vitro que reconstitui a estrutura 
do fago (cabeça e cauda) e assim é usado para infectar a célula hospedeira. 
O DNA genômico de interesse é clivado com uma enzima de restrição que 
produz grandes fragmentos de DNA que serão ligados ao cosmídeo, também 
clivado com a mesma enzima. O DNA do cosmídeo é injetado no interior da 
célula hospedeira, circulariza igual ao DNA do fago e replica como um 
plasmídeo normal, sem expressão de qualquer função do fago. As células 
infectadas serão selecionadas com base na resistência adquirida a um 
determinado antibiótico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Nas figuras a seguir, você poderá observar a sequência de eventos necessários 
para a produção de um organismo recombinante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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A expressão de genes clonados produz grandes quantidades de proteína 
Frequentemente, é o produto do gene clonado o interesse primário – principalmente 
quando a proteína possui valor comercial, terapêutico ou de pesquisa. 
Em alguns casos, os genes clonados são tão eficientemente expressos que seu 
produto proteico representa 10% ou mais das proteínas celulares. Eles são ditos 
superespressos. 
Os vetores de clonagem com sinais de transcrição e tradução são frequentemente 
chamados de vetores de expressão. 
Os genes podem também ser expressos nas células eucarióticas, com várias 
espécies de levedura como hospedeiras usuais. Dependendo da proteína a ser 
obtida, faz-se necessário utilizar esse tipo de hospedeira eucariótica, pois muitas 
proteínas precisam ser processadas após a síntese e serem modificadas para que 
possam exercer suas funções primárias. 
Os produtos da tecnologia do DNA recombinante variam desde proteínas até 
organismos construídos. Podemos, através dessa tecnologia, produzir grandes 
quantidades de proteínas comercialmente úteis, planejar microrganismos para 
tarefas especiais construir plantas ou animais com características úteis na 
agricultura e medicina. A engenharia genética transformou-se, em poucos anos, de 
uma nova tecnologia promissora a uma indústria de muitos bilhões de dólares, com 
muito do seu crescimento ocorrendo na indústria farmacêutica, conforme pode ser 
visto na tabela abaixo. 
 
Lista de produtos (Proteínas Recombinantes) gerados usando 
Tecnologia de DNA Recombinante 
Produto (proteina) Gene expresso em Applicação 
 
 
 
 
 
 
 
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(hospedeiro) 
Currently in TherapeuticUse 
Human growth horomone (HGH) 
Mouse mammary tumour cell 
line 
Dwarfism 
Tissue plasminogen avtivator (TPA) 
Chenese hamster ovary 
(CHO)cell line 
Thrombolysis 
Erythropoietin * (CHO)cell line Anaemia 
Blood clotting factor VIII* (CHO)cell line HaemophiliaF 
In Advanced Stages of Development 
Antithrombin VIII (CHO)cell line Anticoagulant 
Blood factor VIII BHK-21 cell line Haemophilia 
Blood factor IX CHO cell line Haemophilia-B 
Interleukin-2 (11-2) - Cancer therapy 
Human recombinant antibodies 
CHO cell line and Mouse 
myeloma lines 
Infections, various cancers 
Hepatitis-B surface antigen (HBSAg) CHO cell line and C-127 cell line As vaccine Hepatitis-B 
Interferons (IFN) - Tumours 
Plasminogen activator (including chimeric and modified) 
CHO cell line and Spodoptera 
frugiperda 
Thrombolysis 
CD4 Protein Mammalian cell line AIDS vaccine 
gp 160 protein Mammalian cell line AIDS vaccine 
p24 protein Mammalian cell line AIDS vaccine 
Interleukin-l receptor antagonist Mammalian cell line Severe sepsis 
Atrial natriuretic Mammalian cell line Kidney failure 
Ciliary neurotropic factor Mammalian cell line Amyotrophic sclerosis 
DNase Mammalian cell line Cystic fibrosis