História e Componentes do Microscópio

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Histórico
Desde a antiguidade povos como os egípcios, gregos e romanos conheciam a arte de talhar e 
polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupas primitivas como objetos decorativos. No 
entanto, somente em meados do século XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o 
segredo e a construção da fabricação de lentes corretivas. Os primeiros estudos científicos datam do 
século XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenômenos óticos e a formação de 
imagens no olho. 
Atanásio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra microscopium, nome dado ao 
microscópio daquela época. Muitos atribuem a invenção do microscópio a Galileu, porém foi 
Antonievan Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeiçoou o instrumento e o utilizou na 
observação de seres vivos. Seu microscópio era dotado de apenas uma lente de vidro, permitindo 
um aumento de até 300 vezes. Com este instrumento Leeuwenhoek estudou os glóbulos vermelhos 
do sangue e constatou a existência dos espermatozóides. Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro 
intitulado “Micrographia”onde descreveu o microscópio e como ele havia descoberto a circulação 
do sangue nos peixes. Em seu microscópio, Robert Hooke incorporou o ajuste fino e acrescentou 
mais uma lente. Após o aprimoramento, os microscópios ficarão constituídos por 2sistemas de 
lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliações de imagem que vão em geral de 
100 a 1000 vezes.
Em 1932, surgiu o microscópio eletrônico permitindo aumentos de 5 mil a 500 mil vezes. A 
diferença básica entre os microscópios ótico e eletrônico é que neste último não é utilizada a luz, 
mas sim feixes de elétrons. No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, 
chamadas de lentes eletromagnéticas. 
Na história da microscopia, 200 anos foram necessários para que o microscópio deixasse de 
se ser um instrumento exótico e pouco acessível para ser usado em uma escala mais ampla. Então, a 
partir do séc. XIX, graças aos estudos realizados por microscopistas puderam afirmar o conceito de 
célula como verdade científica, surgindo a ciência da biologia celular.
Unidades de medida utilizada em microscopia
Em geral, podem-se dividir as unidades de estruturas biológicas em macroscópicas e 
microscópicas, sendo essa última invisível a olho humano nu. As unidades de medida em 
microscopia compreende o micrômetro, em microscopia ótica e o nanômetro e o angstrom, na 
microscopia eletrônica.
 Unidade de medida Símbolo Valor
 micrômetro 1 μm 0,001 mm
 nanômetro 1 ηm 0,000001 mm 
 angstrom 1 Å 0,0000001 mm
O aumento total do objeto observado é calculado multiplicando-se os valores do aumento da 
objetiva e da ocular. 
 
 Ocular Objetiva Aumento
 10x 10x(pequeno aumento a seco) 100x
 10x 40x(grande aumento a seco) 400x
 10x 100x(imersão em óleo) 1.000x
Componentes do microscópio 
Adicionalmente, o microscópio apresenta uma base mecânica (base,braço, revólver, platina, 
charriot, parafusos macro e micrométrico e parafuso de regulagem do condensador) e um sistema 
de iluminação (fonte luminosa,diafragmas, condensador e filtros). 
Partes constituintes do microscópio de luz, em que (A) compõem o sistema ótico e (B) o 
sistema mecânico :
 
-Partes mecânicas
> O pé ou Base – suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade; 
> Braço ou Coluna – peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes 
do microscópio; 
> Tubo ou Canhão – cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade 
superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas;
> Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a 
observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios 
luminosos concentrados pelo condensador;
>Condensador – ajuda a focar a luz sobre a amostra analisada. É particularmente útil quando 
utilizado em conjunto com as lentes objetivas mais poderosas;
>Diafragma – controla a intensidade e o tamanho do cone de luz projetado sobre o espécime. 
Como uma regra geral, quanto mais transparente o espécime, menos luz é requerida;
> Charriot – possui uma pinça que prende a lâmina e a movimenta de um lado para o outro, 
permitindo uma análise da lâmina como um todo;
> Parafuso Macrométrico – engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocação a da 
platina, indispensável para fazer a focagem;
> Parafuso Micrométrico – imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito 
reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio;
> Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de 
diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva.
-Partes ópticas e de iluminação
>Lentes oculares – contêm as lentes oculares, as quais fornecem um poder de aumento de 10x a 
15x, geralmente. É por aqui que você olha através;
>Lentes objetivas – geralmente, há três ou quatro lentes objetivas em um microscópio, consistindo 
de poderes de aumento de 4x ou 5x , 10x, 40x e 100x. A fim de obter o aumento total de uma 
imagem, você precisa multiplicar o aumento das lentes oculares pelo aumento das lentes objetivas;
>Fonte de luz – projeta luz para cima através do diafragma, lâmina e lentes.
 
 
-Formação da imagem em um microscópio óptico 
O microscópio composto é um instrumento óptico que permite obter imagens virtuais de 
pequenos objetos com bastante ampliação, superando os aumentos fornecidos pelas lupas. Os 
componentes básicos de um microscópio composto são duas lentes convergentes: a objetiva, 
dirigida para os objetos, e a ocular, orientada para o olho do observador.
 
 
A objetiva, posicionada diante do objeto, forma uma imagem real, invertida e ampliada do 
mesmo. A ocular funciona como uma lupa que amplia a imagem não do objeto inicial mas de uma 
imagem intermédia formada pelo sistema de lentes da objetiva, formando uma imagem virtual e 
ampliada da imagem formada pela objetiva. A imagem observada pelo olho humano quando 
olhamos através da ocular do microscópio óptico, resulta assim numa imagem ampliada, virtual e 
invertida (em ambos os sentidos) em relação ao objeto. 
-Tipo de microscópio 
> Microscopia de campo claro 
O microscópio de campo claro é o mais comum microscópio de luz. Nesse microscópio, o 
campo de visão aparece iluminado e os objetos que estão sendo observados apresentam-se mais 
escuros. Segundo Weiss et al., a microscopia de campo claro apresenta algumas vantagens como 
menor toxicidade por necessitar de menores concentrações de corantes; baixo contraste, devido ao 
uso de baixas concentrações de cromóforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser 
grandemente aumentados; observações feitas no comprimento de onda de máxima absorção 
aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas limitações como objetos de fase exibem 
mínimo contraste em foco e mostra contraste oposto por cima e abaixo do foco.
 Em aplicações biológicas, a observação de campo claro é amplamente usada para espécimes 
manchados, naturalmente pigmentados ou altamente contrastados montados em uma lâmina de 
microscópio de vidro. O espécime é iluminado por baixo e observado por cima . A luz viaja ao 
longo do eixo óptico, através da objetiva em direção à amostra que está sendo observada. A amostra 
então é vista pela luz que ela reflete. Filtros especiais são utilizados para abrandar a luz e aumentaro contraste. 
 Esta técnica é muito usada na patologia para visualizar seções de tecido fixas ou 
filmes/sujeiras de células. O processamento de imagem de campo claro não é muito útil para células 
vivas não manchadas ou seções de tecido não manchados, pois na maioria dos casos, a luz passa 
através de amostras transparentes ou translúcidas com pouca ou nenhuma definição de estrutura.
> Microscopia de campo escuro 
Microscópio utilizado para visualizar materiais muito pequenos como plâncton, bactérias e 
cristais. É um tipo de microscopia utilizada na observação de microorganismos não corados, 
suspensos em líquidos, preparações a fresco e em gota pendente. As imagens obtidas no campo 
escuro apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vídeo. Baseia-se 
no princípio de que a luz é dispersa pela superfície dos materiais que possuem diferentes índices de 
refração. A luz dispersada entra na objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo 
escuro. Tal consegue-se pela utilização de um tipo especial de condensador que ilumina o objeto 
obliquamente. A luz atinge o espécime a ser analisado e somente os feixes desviados pelo objeto 
percorrem o resto do sistema, isto é,objetivas e oculares, formando a imagem. 
A luz é direcionada para o exterior do cone que a objetiva compreende para iluminar a 
lâmina obliquamente. Somente a luz que é refletida ou difratada pelas características da amostra 
entra na objetiva. Assim, a amostra aparece como um fundo preto com as características refletidas 
ou difratadas aparecendo com brilho. A iluminação de campo escuro aumenta a visibilidade de 
detalhes que são freqüentemente ignorados pela iluminação de campo claro. Mesmo detalhes 
estruturais pequenos, que se encontram abaixo do limite de resolução da objetiva, são visíveis com 
campo escuro (esta maior visibilidade, que é mais parecida com a observação das estrelas mais 
distantes à noite, não é um aumento na resolução).
A microscopia de campo escuro é uma técnica excelente para uma varredura rápida, com um 
amplo campo de visão, para partículas, ranhuras ou resíduos químicos . 
> Microscopia de contraste de fase 
Esse tipo de microscopia foi desenvolvida pelo holandês Zerniké, na década de 50, baseada 
nos princípios de difração da luz, isto é, o caminho do feixe luminoso, na formação da imagem por 
esse tipo de microscópio, sofre um retardo óptico, permitindo assim que se possa observar materiais 
biológicos sema coloração. Portanto, o microscópio de contraste de fase dispõe de certos recursos 
específicos para estudar células vivas e não coradas, particularmente útil para o estudo da mitose em 
células cultivadas in vitro, e exames rápidos de culturas de células, sangue, bactérias, algas, 
protozoários de ambientes aquáticos, conteúdo estomacal de animais, análise de materiais 
cerâmicos, têxteis e minerais. Então, grande parte dos detalhes de células vivas não são detectados 
no microscópio de campo luminoso devido ao fato de as estruturas celulares serem transparentes e 
incolores, não apresentando contraste suficiente.
Contudo, o microscópio de contraste de fase tem um sistema óptico especial que torna 
possível a distinção de materiais biológicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus 
índices de refração. A luz que passa através de materiais com densidades ligeiramente diferentes é 
refratada ou desviada do seu trajeto original. Variações mínimas de fase, devidas às diferenças de 
índice de refração dentro do objeto, são ampliada se transformadas em mudanças de amplitude 
(intensidade) as quais são visualizadas como diferenças de contraste na imagem.
O microscópio de contraste de fase apresenta sistemas de anéis metálicos postos no caminho 
da luz. Um na lente condensadora e outro nas objetivas. Uma singular particularidade é que as 
objetivas de fase apresentam a designação “Ph”,oriunda da palavras phase, diferenciando-a das 
demais. Esses anéis, após centralizados, promovem o retardo óptico, permitindo assim a 
visualização do espécime sem coloração.
> Microscopia de contraste interferencial 
A microscopia interferencial mais conhecida é a chamada de microscopia de Normarski. A 
geração do contraste a uma alta abertura de trabalho é limitada em uma profundidade de campo 
raso, resultando na habilidade de tornar a seção com alto contraste de 200 a 300 nm de espessura. 
Esse tipo de contraste interferencial trabalha com a defasagem dos comprimentos de ondas. Assim, 
a defasagem gera uma deformação na imagem, permitindo o contraste interferencial, aumentando a 
superfície do material analisado. A aplicação dessa microscopia permite a observação de materiais 
biológicos sem coloração, sendo útil no monitoramento de culturas celulares, estudo de morfologia, 
taxonomia de pequenas larvas e ácaros e outros ectoparasitos.
 Esse tipo de microscopia utiliza-se de prismas ópticos posicionados na passagem da luz. 
Esses prismas modificam as fases luminosas que contrastarão com o meio em que se encontra o 
material a ser observado. Esse microscópio requer uma construção específica, apesar de não utilizar 
lentes objetivas especiais, ele necessita de um revólver com ranhuras para alojar os prismas de 
interferência, então as cores de interferência promoverão a visualização da imagem.
>Microscopia de fluorescência
A microscopia de fluorescência é, provavelmente, a mais versátil e poderosa técnica para 
localizar proteínas dentro da célula pela microscopia de luz. Fluorescência é a propriedade de 
algumas substâncias para, após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, 
emitirem radiação de maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a energia da 
radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz visível. Microorganismos 
corados por um corante fluorescente aparecem como objetos luminosos quando observados com luz 
ultravioleta. É com os recursos desta técnica que se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando 
associados a anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de 
fluorometria os objetos de estudo da citoquímica normal e patológica.
O mais fluorescente corante é chamado de fluorocromo, capaz de emitir luz visível. Dois 
exemplos de fluorocromo é o corante alaranjado de acridina que se liga aos ácidos nucléicos 
conferindo uma fluorescência amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina, que 
apesar de não ser um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a fluorescência natural da 
elastina. Os fluorocromos, quando conjugados com anticorpos, torna possível a identificação de 
células individuais que reagem com o anticorpo (aplicação designada de imunofluorescência). Os 
fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares, tornando-as fluorescentes, tornando-as 
passíveis de identificação e localização, como proteínas ou estruturas celulares.
O microscópio de fluorescência utiliza um sistema óptico que interage pouco com a luz. 
Utiliza-se uma luz de mercúrio de alta pressão, cujos picos variam entre 312 e 579 nm. Nessa 
microscopia também há filtros especiais chamados de filtros de excitação e filtros de barragem. Os 
filtros de excitação localizam-se logo após a saída de luz antes do condensador, selecionando o 
comprimento de onda desejado. Já, os filtros de barragem localizam-se entre a objetiva e a ocular, 
após o objeto, deixando passar somente a luz fluorescente, então o material fluoresce contra um 
fundo escuro.
>Microscopia de varredura confocal 
A microscopia de varredura confocal representa um dos mais importantes avanços da 
microscopia de luz já desenvolvida, principalmente, porque é uma técnica capaz de visualizar em 
profundidade células e tecidos vivos e fixados. O espécime é escaneado com uma série de muitos 
estreitos campos de visão, as imagens destes campos são recuperadas individualmente, e depois deestocadas, a imagem completa é construída como um mosaico de partes combinadas. O microscópio 
de varredura confocal é indicado para estudos de materiais espessos, sem coloração prévia, vivos ou 
pré-fixados. 
Essa microscopia permite o detalhamento de estruturas subcelulares que não apresentam 
limite de resolução compatível ao da microscopia de luz fluorescente convencional, como 
microtúbulos, elementos fibrilares do citoesqueleto e elementos finos da matriz celular. Nesse 
microscópio, a imagem pode ser obtida de planos focais específicos ou cortes ópticos. Os cortes 
ópticos são transferidos para um computador e são reconstruídos tridimensionalmente deforma a 
obter uma imagem no total. Logo, os microscópios tradicionais trabalham com imagem analógica, e 
os confocal a laser trabalham com imagens digitais. 
O microscópio de varredura confocal utiliza como fonte de luz o laser,sendo seu 
funcionamento complexo. Seu sistema óptico é o mesmo da de fluorescência tradicional, com 
exceção de que a iluminação se dá somente em pequenos pontos iluminados pelo laser. Acima da 
objetiva existe um orifício chamado pinhole ou íris que elimina a luz proveniente de objetos que 
estejam fora do plano focal.
>Microscopia de polarização 
Esse microscópio apresenta dois prismas, ou filtros, chamados depolarizador e analisador. 
Esses filtros se posicionam entre a fonte de luz e o condensador (filtro polarizador) e entre a 
objetiva e a ocular (filtro analisador. Os filtros polarizadores promovem a seleção de apenas um 
plano de direção de vibração de ondas luminosas, conhecido por plano da luz polarizada(PPL). Sob 
o efeito do PPL, os componentes macromoleculares birrefringentes(anisotrópicos) apresentam 
brilho colorido ou não, promovendo um realce destes materiais em detrimento a outros não 
birrefringentes (isotrópicos), que se distinguem em fundo escuro.
Os materiais biológicos mais estudados na microscopia de polarização citam-se células 
musculares estriadas, espermatozóides, paredes celulares, amido, colágenos e DNA. Em estudos 
com o colágeno, pode-se aumentar sua birrefringência utilizando-se de corantes como, Xylidine 
Ponceaus ou Picrossírus. Um outro corante, que se presta a estudos anisotrópicos, é o azul de 
toluidina, permitindo estudos de ordem e agregação molecular da cromatina,da matriz extracelular e 
outros componentes.
- Comparativo das estruturas dos tipos de microscopias
 
microscópio de campo escuro microscópio de contraste de fase 
 
 
 microscópio de contraste de fase interferencial microscópio de fluorescência 
 
 
microscópio de varredura confocal microscópio de luz polarizada