Transcrição da aula sobre microbiota - FFN 2015.1

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Influência da Microbiota sobre o Metabolismo
Adoçantes artificiais (sacarose, sacarina) poderiam causar diabetes. Artigo publicado na Nature diz que quando eles davam adoçante pros camundongos eles tinham uma tendência a ficarem diabéticos. E aprofundando o estudo eles viram que quando era dado o adoçante havia uma mudança na microbiota intestinal desse camundongo e ele tinha uma tendência maior a ter diabetes por causa disso. Eles pegaram um camundongo normal e transferiram a microbiota do que tomou adoçante pra esse que nunca tomou adoçante e ele também ficou diabético. Então só de você transferir a microbiota de um para o outro, você causa diabetes nele. Se vocês não estão convencidos, eles pegaram pessoas que tomam adoçante e as que não tomam, e viram que a microbiota delas é diferente. E se você pega a microbiota de uma pessoa que toma adoçante e transfere pro camundongo ele fica diabético.
E publicaram recentemente, um estudo parecido só que com emulsificante (lecitina de soja, eu acho). 
O que você come, eu vou mostrar aqui pra vocês, altera sua microbiota. Se você come muito doce, muita proteína, muita gordura, bactérias diferentes são mais eficientes em captar esses tipos de nutrientes. E isso pode ter impacto no seu metabolismo de modo geral, por quê? Pessoas normais vão ter 10 trilhões de células e você tem no total 100 trilhões de bactérias. Então na verdade seu corpo todo é 10% células eucarióticas e 90% células procarióticas. Então você é 90% bactéria, é bizarro. A diferença da sua microbiota tanto de fora quanto de dentro, pode ter influência no seu metabolismo.
Então quais são as funções da microbiota especificamente do sistema digestório? Vários carboidratos que você não consegue digerir, você só vai digerir com bactérias específicas. As bactérias do seu intestino vão te ajudar a digerir esse carboidrato ou outros compostos; A sua microbiota também é importante pra controlar o crescimento de MOs que sejam patógenos para você. Então se você tem uma desregulação na sua microbiota intestinal você pode ter o crescimento maior de algum patógeno, você pode ter uma infecção intestinal ou algum outro tipo de infecção.
Um pesquisador dos EUA estava fazendo um trabalho com mosquito e malária e ele foi na África. Se você vai à África é assim: se você captura o mosquito Anopheles e você procura o ponto de malária, é 1% infectado. Se você pega 100 mosquitos só 1 vai estar com malária. Embora a malária seja a doença que mais mata no mundo. A cada minuto uma criança africana morre de malária. São 500 mil mortes por ano. E só 1% dos mosquitos está infectado. O que ele foi fazer? Ele foi pegando os mosquitos e vendo a microbiota do intestino do mosquito. E ele viu que os mosquitos que não estão infectados têm uma microbiota diferente dos mosquitos que estão infectados. Ele pegou a bactéria majoritária dos mosquitos que não estão infectados e aí produziu em laboratório mosquitos com essa bactéria no sangue, e esse mosquito fica resistente à infecção por malária. Então a microbiota do mosquito depende de qual bactéria ele tem majoritária no intestino dele e se vai permitir ou não o desenvolvimento do plasmodium no mosquito. Isso abre brecha para a paratrangênese, que é você colocar uma bactéria no ambiente, espalhar essa bactéria que dá resistência, pra infectar o maior número possível de mosquitos e você bloquearia a malária. 
Uma outra coisa que vai ser importante pra gente vai ser a modulação do sistema imune. Dependendo do tipo de bactéria que você tem no seu intestino, você vai ter a ativação ou não, maior ou menor, do seu sistema imune. Fazendo de uma história longa um pouquinho mais curta, pensando em nossas aulas, se eu tiver uma modulação do meu sistema imune o que eu posso fazer com o meu metabolismo? Em qual aula a gente viu que desregulação do sistema imune pode causar alteração de metabolismo? Diabetes. Quando você tiver um quadro de inflamação crônica, você vai ter fosforilação em serina e por aí vai... então se você tiver uma desregulação do sistema imune intestinal e você tiver uma inflamação crônica você pode desencadear um processo...[não entendi]. E uma outra coisa que também está publicada sobre o metabolismo de sais biliares: quando você joga os sais biliares no seu intestino pra ele emulsificar gordura, a microbiota pode metabolizar esses sais biliares e permitir que você reabsorva ou não os sais biliares. 
Como exemplo desse outro trabalho aqui, nós temos a digestão de triptofano. As bactérias do intestino podem digerir triptofano e transformar em dois compostos diferentes, isso aqui vai ser absorvido no intestino e depois vai pro fígado onde ele vai ser metabolizado de novo. O que os caras fizeram foi olhar num camundongo convencional (normal) e num camundongo germ free (GF), camundongo livre de microbiota. Como faz? Você pega a camundonga, a Minnie está grávida, você faz uma cesariana dentro do fluxo laminar (ambiente estéril) e você tira o bebê Mickey e transfere pra uma caixa isoladora e ele só vai ter contato com água autolavada, ração autoclavada, ele não tem contato com nenhum MO. Ele é totalmente livre de MOs. O útero é estéril, você faz a cirurgia em ambiente estéril, transfere pra uma caixa estéril. Tem coisas que ele não consegue fazer, algumas vitaminas e tal, mas ele é suplementado.
Por exemplo, eu trabalho com barbeiro. As pessoas antes que trabalhavam com o barbeiro deixavam o ambiente o mais limpo possível e não ia pra frente, os bichos não se desenvolviam, os barbeiros não botavam ovos. Ele tem um simbionte obrigatório que vive no intestino dele que gera umas substancias importantes pra ele sobreviver. E ele pega isso quando o bebê barbeiro nasce, ele come cocô da mãe na casca, pra se contaminar com aquilo. Então a caixa tem que ser um pouquinho suja...
 
Aqui são diferentes compostos derivados do triptofano: serotonina, por exemplo. E aí que eles mediram quanto eles conseguem ver lá no camundongo convencional ou GF a quantidade desses derivados de triptofano. A única coisa que ele não tem é bactéria no intestino. Então, triptofano ele tem mais, provavelmente porque ele não tem a bactéria pra degradar. No mesmo artigo temos as massas de outros derivados de triptofano, o convencional tem um monte de coisa que o GF não tem e quando vemos o perfil do GF ele tem o perfil bem mais simples, ele tem bem menos intermediários. E o que isso vai ter a ver com o metabolismo energético? Se eu pego esse mesmo GF: (a barra branca é o camundongo livre de patógenos, é um camundongo que não tem doença, mas ele tem microbiota; o convencional é a barra preta; a barra cinza é convencional revertido, um camundongo que eu peguei livre de germes e em determinado momento eu recoloquei os germes nele (ele nasce GF e depois introduzo bactérias nele)).
Quando eu vou olhar a quantidade de gordura o animal que é livre de germes tem menos gordura do que o camundongo convencional. Menos gordura, menos tecido adiposo. Embora ele tenha menos gordura ele come mais comida e tem menos atividade metabólica, então o organismo não digere. ele come mais, gasta menos, mas ainda assim ele é mais magro. Por quê? As bactérias são importantes pra ele fazer a digestão. Ele não absorve tudo, é tudo perdido nas fezes. E o que acontece? O camundongo GF tem menos leptina, menos insulina, a glicose dele é menor e ele é mais sensível à insulina, mais tolerante a glicose. O GF é mais saudável que o convencional. No camundongo sem microbiota, ele tem menos gordura no fígado. E os caras mediram vários gens envolvidos com a síntese de lipídeos. O camundongo convencional tem mais Acc, mais ácido graxo sintase porque ele sintetiza mais lipídeos, mais SREBP (elemento de resposta ao colesterol) e mais ChREBP (elemento de resposta ao carboidrato). 
Mas por que meu animal GF tem todas essas diferenças e é mais saudável? Eles mediram a atividade da lipopoteína lipase, da enzima que quebra o lipídeo da proteína pros tecidos absorverem. E os animais convencionais tem mais atividadedessa enzima que os outros. Eles fizeram um animal nocaute (que não tem essa proteína) Fiaf. Que que essa proteína é? Ela é um inibidor da lipoproteína lipase. Eles viram que se você não tem essa Fiaf o efeito da microbiota é perdido. Qual a conclusão que eles chegaram? A microbiota aumenta o tecido adiposo porque você tem um aumento da adipogênese no fígado e você tem a expressão de um inibidor da lipoproteína lipase no intestino. Então se você tem microbiota por que o cara fica mais gordo? Porque a microbiota de alguma forma inibe a expressão desse inibidor no intestino e aí você bloqueia a lipoproteína lipase e o fígado engorda.
São exemplos de como a microbiota pode alterar o sistema. 
Alterações mais sutis eu vou falar lá na frente. Dependendo do tipo de bactéria, do conjunto ecológico que você tem na sua barriga você pode ter mudanças no seu metabolismo. Mas tem uma coisa que não explica que eu falei no começo: os animais comem menos e tem uma taxa de metabolismo basal maior. O que acontece? Esse inibidor da lipoproteína lipase não explica isso. 
Aqui tá comparando animais magrinhos e animais obesos. Ob-ob é o obeso que não tem leptina. O que ele está medindo aqui no gráfico B é o quanto de energia aparece nas fezes do camundongo. Então o camundongo que é magro joga mais energia fora que o camundongo obeso. Mas teoricamente a falta de leptina não ia alterar a digestão dele. O que eles fizeram aqui foi o seguinte: eles pegaram um camundongo normal, transferiram a microbiota do camundongo normal pro controle (++) e transferiram a microbiota do camundongo ob-ob para o camundongo normal e mediram quanto o camundongo engorda. Então se você pega a microbiota do camundongo obeso, geneticamente obeso, e transfere pro normal, o normal engorda. Então se você não tem leptina você engorda e talvez por você engordar a sua microbiota mude, isso facilite que você fique mais gordo. 
Uma outra coisa que as bactérias produzem, e isso varia de bactéria pra bactéria, é o butirato (que são ácidos graxos). As bactérias produzem como metabolitos intermediários acetato e butirato. O que esse cara testou foi: o que acontece se eu colocar um montão de butirato nesses camundongos? Se eu injeto butirato eu fico com um camundongo menos insulinêmico (diminui os níveis de insulina), ele fica mais tolerante a glicose, mais sensível à insulina. O que eu to medindo aqui? Fosforilação de IRS em tirosina. Isso é bom ou ruim? Bom. O camundongo com butirato funciona melhor a sinalização de insulina que o outro. Então pode ser que a microbiota com mais butirato seja benéfica pro seu metabolismo. 
Quando você compara camundongos normais com GF eu tenho alterações energéticas até do hospedeiro dessa microbiota. O cara olhou lá em musculo e em fígado. AMP, ADP e ATP, NAD+ e NADH. Se eu tenho muito ATP eu estou energeticamente bem, se eu tenho muito NADH eu estou bem e NAD+ eu estou mal. Quando eu olho o músculo o camundongo GF tem mais AMP do que o normal, ele tem menos energia. O que vai ativar? AMPK. No fígado, os níveis de AMP estão iguais. O que o cara conseguiu ver de diferente é que os sem microbiota tem mais NAD+ do que os convencionais, também estado baixo de energia.
O que eles viram aqui foi que deram colesterol marcado radioativamente pros camundongos pra ver quanto ele absorvia de colesterol. E eles viram que os camundongos sem microbiota conseguiam recuperar mais do colesterol absorvido, então os camundongos sem microbiota consumiam mais colesterol. 
Agora um camundongo nocaute que não tem o receptor toll 5 (TLR5). Esse TLR5 é expresso especificamente no intestino. O que acontece com o bicho? Ele é muito mais gordo que o camundongo normal e, além disso, ele é dislipidêmico, ele tem mais triacilglicerol, mais colesterol e ele é hipertenso. Esse camundongo tem o que? Síndrome metabólica. E ele só não tem o receptor toll no intestino. Por que isso acontece? Ele é diabético, então ele tem glicemia de jejum maior, resistência à insulina, ele é hiperinsulinêmico e as ilhotas dele não estão muito boas. Ele tem todas as características de síndrome metabólica. O fígado dele não está muito bom e o camundongo come mais. Se você tira o TLR do intestino ele fica hiperfágico, come mais e fica mais gordo. Pra provar essa teoria eles pegaram esse camundongo e deram uma quantidade limitada de comida, não era comida a vontade. Ele dava o suficiente pro camundongo viver aquele dia. Com a dieta controlada, eles não engordam, ficam iguais ao controle. Não engordam e não ficam diabéticos. Então o problema dele é que se você tira o TLR ele fica hiperfágico. Depois eles pegaram o camundongo controle e o nocaute e tratou com antibiótico. Deu um caminhão de antibiótico e tratou o bicho. E mediu a glicemia depois de um tempo, agora nesses dois camundongos sem microbiota, ele corrigiu a glicemia do camundongo nocaute. Ou seja, quando você retira o receptor TLR 5 você causa alguma mudança na microbiota que faz com que o camundongo fique hiperfágico porque depois que ele é tratado com antibiótico ele passa a comer a mesma coisa que o controle. Pra comprovar que é a microbiota pegaram o controle e o nocaute e transferiram a microbiota do controle pro nocaute. E também corrigiram a hiperfagia. Então quando você troca as microbiotas você também corrige o problema. Por fim, ele foi medir os níveis inflamatórios e viu níveis maiores tanto de TNF-alfa e beta. Ele está mais inflamado porque não tem o TLR 5. Quais são as conclusões que ele chegou? Quando eu tiro o TLR 5 eu causo uma desregulação na balança entre sistema imune do hospedeiro e microbiota. Quando eu tiro o receptor do intestino a microbiota cresce mais do que deve e isso pode gerar um quadro inflamatório. Pouca microbiota não é bom e muita microbiota também não. 
Qual a relação entre microbiota e saciedade? Agora é com gente já, tá? Tem pessoas diabéticas e não diabéticas. As pessoas diabéticas são um pouco mais velhas, mais pesadas, tem mais gordura abdominal, a glicemia é maior, ele é dislipidêmico, quadro de síndrome metabólica. As pessoas tem mais fribinogenio livre no plasma (fator inflamatório), mais leucócitos. Ele olha a relação de DNA bacteriano que ele consegue pegar no sangue da pessoa e ele consegue ver maior quantidade de DNA bacteriano nas diabéticas. Existe uma relação entre a glicose em jejum e o nível de DNA bacteriano, entre fribinogenio e a quantidade de leucócitos. Mais DNA, mais fibrinogênio, mais leucócitos, mais inflamado.
Fizeram um estudo populacional pra relacionar a microbiota. Aqui é uma árvore filogenética que os caras fizeram pra ver as bactérias das pessoas. 
Então quanto mais juntinhas elas tão, mais parecidas elas são. Se concentra naquelas linhas lá em cima. Cada vez que eu tenho uma separação, eu tenho a separação de dois grupos. Pensa na escala evolutiva: eu tenho a bactéria primordial e aí vai passando a escala evolutiva por tempo. As bactérias vão evoluindo e se dividindo. Então as bactérias se separaram e criaram duas famílias diferentes. Ai uma delas se separou e criou mais duas. E por aí vai ate chegar nas espécies que existem hoje. Quanto mais longe as bactérias forem se encontrar na escala evolutiva, mais distantes elas são. Agora olha o colorido, elas são totalmente diferentes. Enquanto um lado é azul (esquerdo) o outro é vermelho (direito). As pessoas que tem as bactérias da direita foram tiradas de pessoas com síndrome metabólica. 
Parece que na verdade o que acontece é que você fica obeso e você tem uma mudança no seu perfil bacteriano. Tem uma bactéria especifica, vou chamar de Akk, que vou usar pra comparar o camundongo magro e o obeso (não tem leptina então teoricamente ele nasce com a mesma microbiota). E ele tem muito menos, isso aqui é escala log, quase 10mil vezes menos Akk. 
Será que essa Akk é importante pro perfil de síndrome metabólica que o camundongo ob-ob tem? Ele recolocou a Akk no camundongo. A primeira coisa que ele mediu foi a quantidade de LPS no sangue do camundongo. O que o lipopolissacarídeofaz? Induz febre, é uma coisa que a gente usa pro nosso sistema imune reconhecer as bactérias e tomar alguma providencia em relação a elas. Então quanto mais LPS você tiver no sangue mais seu sistema imune vai estar ativado. Quando ele compara o controle com o obeso, o obeso tem mais LPS no sangue. E quando ele toma o Yakult de Akk ele reduz a quantidade de LPS. Se você tem pouca Akk na sua microbiota, por algum motivo você fica com mais sacarídeo de parede de bactéria no sangue. Isso corrige algumas coisas, por exemplo, se você toma o Yakult de Akk você engorda menos que o seu amigo que não tomou o Yakult de Akk. E tem uma correlação direta entre os níveis de LPS e a quantidade de Akk que você tem no sangue ou que você tem no intestino. Então de alguma forma você ter essa bactéria no seu intestino evita que esse LPS apareça no seu sangue. Por quê? Ele vai medir depois os parâmetros metabólicos desse carinha, tem glicemia de jejum mais alta e quando ele toma esse Yakult ele reverte a glicemia de jejum; ele tem uma expressão mais alta de glicose-6-fosfato fosfatase e depois isso reverte. O que seria essa glicose-6-fosfato fosfatase? Gliconeogênese. Se você diminui a expressão você tem menos gliconeogênese, você regula a glicemia no camundongo que tá doente. E aqui tem um monte de genes que estão envolvidos com a diferenciação de adipócitos. Inibe a diferenciação de adipócitos, você regula. Ácido graxo está mais baixo, e genes envolvidos com a oxidação ficam maiores. Você volta ao normal, regula o metabolismo só tomando Yakult de Akk. O camundongo obeso tem menos dessa bactéria e se repõe essa bactéria, reverte boa parte dos efeitos da obesidade. Isso depende da bactéria estar viva? A bactéria tem que estar viva pra funcionar. O que tem a ver essa bactéria especifica com a regulação metabólica? Ele foi olhar a espessura do muco intestinal e ele viu que o camundongo controle tem um nível de muco, quando você é obeso e tem menos Akk o muco fica menos espesso. Você perde uma parte da espessura do muco do intestino. Se você da a bactéria do Yakult você recupera isso, se você da a bactéria morta não reverte. Qual a hipótese então? Se você tem a espessura de muco maior você evita que as bactérias da sua flora intestinal entrem em contato direto com as bactérias do seu intestino e você diminui a inflamação. Isso estimula que você fique inflamado. Modula a inflamação crônica e modula a síndrome metabólica. A Akk está sub-representada no
modelo de obesidade ob/ob. E o mais interessante é que essa bactéria no ob-ob que não tem leptina, reverte parte da obesidade. Nada acontece por causa de uma coisa só.
Vamos pegar quatros genes, tem gene magro e tem gene gordo. Eles fizeram uma analise da microbiota e viram que os caras são geneticamente parecidos, tem a mesma idade, vivem na mesma casa mas tem a microbiota diferente. Pegaram a microbiota desses genes e passaram pra camundongos normais e viram o quanto o camundongo engordava. Quando transferia a microbiota das pessoas magras o camundongo não mudava de peso. Quando ele transferia a microbiota das pessoas obesas o camundongo engordava. 
Vamos ver a microbiota na inflamação? Eu falei que o LPS passa do intestino pro sangue. Eles colocaram umas bactérias que foram crescidas no meio com um substrato qualitativo que marca a parede da bactéria, então ele consegue acompanhar aonde está radioativo é onde essas bactérias foram parar. O que está pontilhado aqui é a radioatividade nas fezes. Então a radioatividade nas fezes diminui, embora as bactérias continuem lá. E depois ele foi procurar o quanto de radioatividade ele conseguia ver no sangue e o quanto ele via na medula óssea. E ele conseguiu observar atividade nesses dois pontos. Ou seja, a parede das bactérias do seu intestino está passando de alguma forma pro sangue e pra medula óssea. Ai ele foi medir o nível de ativação de NF-κB que é um fator de transcrição que é induzido por citocinas inflamatórias em um camundongo tratado com antibiótico (não tem microbiota) e um camundongo não tratado (tem microbiota). O tratado tem menos ativação de NF-κB do que o não tratado. Peptideoglicanas da microbiota passam para a o sangue e medula óssea, levando a ativação de NF-κB.
Uma outra coisa que os caras viram em outro trabalho é que tem um camundongo que tem uma doença hepática, normalmente esteatose hepática (ele desenvolve a doença naturalmente). E os caras foram ver a relação da microbiota com isso. Olha aqui no g: eu tenho o selvagem e o mutante. O camundondo Asc é mais gordinho que o selvagem. Se eu os trato com antibiótico você tem uma redução do peso dos dois e os dois ficam iguais. Esse camundongo mutante tem alguma desregulação na microbiota parecido com aquele nocaute pra TLR 5. Ele tinha mais glicose no sangue, mais insulina, e se você trata com antibiótico você reverte essas duas coisas. Por que ele tem esse quadro de esteatose hepática? Será que a microbiota tem alguma coisa a ver com isso? Aqui ele tá medindo dano hepático, é um teste clássico das enzimas no sangue. Aí ele fez o seguinte: ele tem um camundongo TNF nocaute (ou seja, ele não tem TNF), ele tem menos inflamação. E ai se você pega um camundongo normal e coloca a microbiota do gordo, o camundongo fica com dano hepático, mas se você dá a microbiota do camundongo pro nocaute TNF ele não tem dano hepático. Isso se reverte numa esteatose menor e num dano menor no fígado também. 
O quadro de doença gordurosa do fígado depende de inflamação mediada por TNFα, isso depende da bactéria que você tem no seu intestino.
Resumindo, se você tem uma microbiota normal você tem uma espessura de muco saudável, você tem produção de ácidos graxos curtos e essas duas coisas vão evitar que você tenha um extravasamento de fatores pró-inflamatórios. Além disso, as bactérias da microbiota vão agir no metabolismo de sais biliares que vão regular o quanto você vai reabsorver de sais biliares dependendo do metabolismo que elas fizerem. 
Agora se você tem alguma alteração da microbiota que pode ser causada por genética, se você come alguma coisa diferente (dieta diferente), se você tomou por muito tempo antibióticos... o que pode acontecer? Você pode ter uma alteração da espessura do muco, você pode ter uma alteração na quantidade de produtos que essas bactérias produzem e isso vai permitir um extravasamento maior de fatores pró-inflamatórios que podem causar uma inflamação crônica. Além disso, se você tiver uma redução no metabolismo de sais biliares, você aumenta a captação de volta de colesterol, na verdade diminui a quantidade de colesterol que você excreta. 
Então, no quadro geral, a gente tem no TGI uma conversa entre três coisas essenciais: os nutrientes que você come e como isso interfere na sua microbiota, o quanto essa microbiota interfere no muco, o quanto a microbiota interfere no quanto de sais biliares você vai reabsorver. Isso vai ter efeito no tecido do intestino e relação direta na regulação do metabolismo. 
Aqui ele tá vendo um cara que fez cirurgia bariátrica. Antes da cirurgia, três meses depois e seis meses depois. A diversidade de bactérias que ele consegue ver. Quanto maior o numero maior a diversidade de bactérias que esse cara consegue ter. Por que esse número aumenta? Não sei, mas pode ter relação com a correção da diabetes do cara. 
Tem bactérias que diminuem e bactérias que aumentam depois da cirurgia. Isso combina muito bem com o seguinte: peso corporal menor, a leptina menor, glicemia em jejum menor, insulinemia menor, perfil lipídico menor. 
Depois falou sobre diferença estatística ser significativa ou não comparando com o efeito biológico e FIM!