Revisão Anual de Patologia de Plantas Capitulo8 ( Detecção e Quantificação de Bacterias Fitopatogenicos por PCR Quantitativo em Tempo Real

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Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 287 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE 
BACTÉRIAS FITOPATOGÊNICAS POR PCR 
QUANTITATIVO EM TEMPO REAL 
 
Antonio Carlos de Oliveira 
Professor Assistente Doutor, Departamento de Ciências Naturais, 
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Caixa Postal 95, 
45083-900 Vitória da Conquista, BA 
 
 Gustavo Henrique Goldman 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, 
 Universidade de São Paulo, 14040-903 Ribeirão Preto, SP 
 
Marcos Antônio Machado 
Centro APTA Citros ‘Sylvio Moreira’/Instituto Agronômico de Campinas, 
Caixa Postal 04, 13490-000 Cordeirópolis, SP 
 
 
RESUMO 
 
Com o advento da técnica da PCR (reação em cadeia a polimerase), 
a identificação de agentes causais de bacterioses foi incrementada ao nível 
molecular. Contudo, a PCR é uma ferramenta analítica estritamente 
qualitativa, que não informa a quantidade do número de células bacterianas 
em uma amostra. Em função disso, plataformas da PCR que exploram a 
quantificação da geração de amplicons, denominadas PCR quantitativo em 
tempo real (PCR-QTR) foram desenvolvidas. Essa revisão fornece uma visão 
geral dos diferentes métodos e aplicações da PCR-QTR na detecção e 
quantificação de bactérias responsáveis por doenças em plantas. 
 
 
SUMMARY 
 
DETECTING AND QUANTIFYING PHYTOPATHOGENIC 
BACTERIA BY REAL-TIME QUANTITATIVE PCR 
With the advent of the technique of PCR (polymerase chain 
reaction), the identification of causal agents of bacterial diseases was 
increased at the molecular level. However, PCR is an analytical tool strictly 
qualitative, it does not inform the number of bacterial cells in a sample. 
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Therefore, PCR platforms that explore the quantification of amplicons 
generation, called real-time quantitative PCR (RTQ-PCR) had been 
developed. This review will provide an overview of the different methods and 
RTQ-PCR applications in the detection and quantification of bacteria 
responsible for plant diseases. 
 
 
INTRODUÇÃO 
 
O histórico da identificação de agentes causais de bacterioses tem 
início com técnicas (i) fisiológicas, por meio da constatação da síntese e/ou 
oxidação de determinadas substâncias; (ii) microbiológicas, via isolamento da 
bactéria e (iii) fitopatológicas, através de testes de patogenicidade (Schaad et 
al., 2001). Essas técnicas, em conjunto, são reconhecidamente enfadonhas e 
de limitada resolução taxonômica ao nível de gênero. Posteriormente, técnicas 
imunodiagnósticas (Schaad, 1979) e de dot-blot de DNA (Irwin, 1987) 
abriram a possibilidade da identificação molecular de bactérias 
fitopatogênicas. Contudo, esses métodos apresentam problemas relativos ao 
grau de especificidade do anti-soro (Trigalet et al., 1978) e ao elevado custo 
das sondas de DNA. Com o advento da técnica da PCR (reação em cadeia da 
polimerase) (Saiki et al., 1985), surge um marco divisório Na identificação 
molecular de fitobactérias. Isso se deve à elevada confiabilidade, 
especificidade, sensibilidade e simplicidade da técnica, quando comparada 
com os métodos de identificação que lhe antecederam (Henson & French, 
1993). 
As primeiras bactérias fitopatogênicas diagnosticadas por PCR 
foram patovares de Pseudomonas syringae, responsáveis pelo crestamento 
bacteriano da ervilha (Rassmusen & Wulff, 1990) e o crestamento bacteriano 
de halo do feijoeiro (Prosen et al., 1991). A PCR é empregada na 
identificação de bactérias em muitas doenças de plantas (Schaad et al., 2001), 
incluindo espécies de reduzida concentração populacional em materiais 
propagativos assintomáticos, tais como Erwinia carotovora subsp. 
atroseptica, responsável pela podridão mole, em tubérculos de batata (van der 
Wolf et al., 1996) e Xylella fastidiosa, responsável pela clorose variegada dos 
citros, em borbulhas de laranjeiras contaminadas (Coletta Filho et al., 2000). 
Contudo, a técnica da PCR, que se resume à amplificação 
exponencial in vitro de uma determinada seqüência-alvo de DNA (Ferreira & 
Grattapaglia, 1996) é estritamente qualitativa (ausência ou presença), sendo 
incapaz de precisar a quantidade da seqüência-alvo na amostra. Em função 
disso, variantes da PCR, que exploram a quantificação da geração de 
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amplicons, foram desenvolvidas. Obviamente, a detecção e a quantificação de 
bactérias fitopatogênicas se beneficiaram dessas inovações. 
Os principais focos dessa revisão são o de (i) fornecer ao leitor uma 
visão geral do método PCR-QTR e de (ii) sumarizar as informações relativas 
as aplicações de PCR-QTR na detecção e quantificação de bactérias 
fitopatogênicas. 
 
 
AS PRIMEIRAS TÉCNICAS DE PCR QUANTITATIVO 
 
As primeiras estratégias de quantificação de seqüência-alvo de 
DNA por PCR, denominadas genericamente de PCR quantitativo (PCRq) 
eram notoriamente trabalhosas. Os principais métodos convencionais de PCRq 
são: 
 
PCR SEMI-QUANTITATIVO 
 
O fundamento dessa estratégia de PCRq é a quantificação do 
amplicon feita, amostrando alíquotas da mistura da reação durante os ciclos da 
PCR (Orlando et al., 1998). Essas alíquotas da reação são carregadas em géis 
e os amplicons gerados na PCR são mensurados com a adição de dyes 
fluorescentes (Walker, 2001). 
 
PCR COMPETITIVO 
 
Nessa estratégia de PCRq, a seqüência-alvo de DNA é quantificada 
por meio da amplificação simultânea de uma seqüência oligonucleotídica 
similar à seqüência-alvo („DNA competidor‟), que difere do mesmo somente 
pela adição ou deleção de 20-30 nucleotídeos entre os sítios de anelamento 
dos primers. O „DNA competidor‟ é adicionado à mistura da reação como 
parte integrante da estrutura de plasmídeos em quantidades conhecidas. A 
mensuração da seqüência-alvo é determinada a partir da taxa de polimerização 
desses dois amplicons em uma série de reações com concentrações crescentes 
do „DNA competidor‟ (Raeymaekers, 1993). 
À semelhança da PCR semi-quantitativa, a estratégia da PCR 
competitiva requer que alíquotas da mistura da reação sejam analisadas por 
eletroforese. Além disso, a PCR competitiva apresenta desvantagens que 
decorrem das naturais diferenças de cinética da PCR entre as reações que 
compõem a série da PCR competitiva. Ocorre, ainda, a formação de 
amplicons heteroduplex, constituídos de moléculas dos dois tipos de 
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amplicons, acarretando uma imprecisão na leitura densitométrica de cada um 
desses amplicons (Wiseman, 2002). 
Os exemplos do emprego dessa técnica são os trabalhos de 
quantificação de Xanthomomas citri pv. citri, responsável pelo cancro cítrico 
(Cubero et al., 2001) e da Erwinia carotovora subsp. atroseptica, causadora 
da podridão mole e canela preta da batata (Hyman et al., 2000). 
 
 
A ESTRATÉGIA DA PCR QUANTITATIVA EM 
TEMPO REAL 
 
As primeiras abordagens de quantificação de seqüências-alvo de 
DNA apresentam imprecisões advindas da (i) quantificação de amplicons na 
fase final da PCR e da (ii) necessidade da remoção de alíquota da mistura da 
PCR para análise eletroforética, que resultam em erros de leitura e elevado 
risco de contaminação de amostras (Zimmerman & Mannhalter, 1996). 
Adicionalmente, essas abordagens de PCRq apresentam baixa resolução, i.e., 
a partir de dois logs de concentração do DNA template, entre um par de 
amostras que está sendo analisado (Schaad et al., 2001). 
 
A ERA DOPCR-QTR VIA BROMETO DE ETÍDEO 
 
Esses inconvenientes foram superados com a descrição de técnicas 
da PCR quantitativa em tempo-real (PCR-QTR) (Higuchi et al., 1992; 1993) 
que não requer procedimentos com eletroforese pós-PCR. Resumidamente, 
uma PCR-QTR é uma PCR convencional sobre a qual é estabelecida alguma 
estratégia para estimar a quantidade de seqüências-alvo de DNA presente na 
reação, via monitoramento da emissão de fluorescência combinada à geração 
de amplicons durante os ciclos da fase exponencial da PCR. 
O acúmulo do amplicon gerado é monitorado pela fluorescência 
emitida por moléculas de brometo de etídeo intercaladas à estrutura da dupla 
fita do DNA (DNA-fd) do amplicon, quando excitadas via laser (Higuchi et 
al., 1992) ou luz ultravioleta (Higuchi et al., 1993). 
A principal desvantagem da estratégia PCR-QTR via brometo de 
etídeo é o fato de não se distinguir a emissão de sinal de fluorescência de 
brometo de etídio intercalado ao amplicon específico daquela da emissão 
fluorescente decorrente da sua intercalação a produtos da PCR inespecíficos, o 
que superestima a quantidade da seqüência-alvo de DNA presente na amostra. 
 
A ERA DO PCR-QTR VIA OLIGOS FLUOROGÊNICOS 
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A plataforma PCR-QTR, originalmente proposta por Higuchi et al. 
(1992), foi aprimorada, substituindo-se a adição de brometo de etídeo pela 
síntese de sondas fluorogênicas (Heid et al., 1996; Tyagi & Kramer, 1996). A 
estratégia PCR-QTR, baseada nos oligonucleotídeos fluorogênicos, contorna o 
problema de emissão de fluorescência não-específica, típica de sistemas PCR-
QTR baseado em brometo de etídeo (Higuchi et al., 1992, 1993), uma vez que 
a hibridização específica do oligo fluorogênico à sua seqüência-alvo de DNA 
é requerida para a geração do sinal da fluorescência. Esse princípio geral é 
explorado em todas as outras diferentes estratégias químicas de PCR-QTR 
(Leutenegger, 2001). 
O grande diferencial dessa estratégia de PCR-QTR é a 
incorporação à PCR de um oligonucleotídeo contendo duas substâncias 
fluorófilas (dyes doador e quencher). Essas substâncias fluorófilas exploraram 
o efeito “quencher”, i.e., uma vez que a sonda intacta seja luminosamente 
excitada, ocorre transferência de energia do fluorófilo de alta energia (dye 
doador) para o de baixa energia (dye quencher). Como conseqüência, ocorre a 
emissão de luz fluorescente, o que acontece no sistema TaqMan® ou emissão 
de calor (collisional quenching), como ocorre em sondas molecular beacon® 
(Didenko, 2001). 
Durante os ciclos que compreendem a fase de crescimento 
exponencial há relativo excesso e uniformidade quanto à disposição de 
reagentes no volume de reação e ausência de inibidores da PCR, que permitem 
que hhaja duplicação da quantidade de amplicon de um ciclo para o outro da 
PCR-QTR, o que é descrito pela equação Tn = To(E). As quantidades de 
seqüência-alvo de DNA no início da reação em um dado ciclo da reação são 
representados por Tn e To, com eficiência da amplificação (E), podendo variar 
de zero, nos casos onde ocorre falha completa da reação, até dois, com a 
ocorrência de máxima eficiência de amplificação, resultando a duplicação da 
quantidade do amplicon de um ciclo para o outro (Wittwer et al., 1998; 
Walker, 2001; Leutenegger, 2001, Wiseman, 2002). 
As estratégias PCR-QTR baseadas na síntese de sondas 
fluorogênicas do tipo TaqMan® (Heid et al., 1996) e de molecular beacons 
(Tyagi & Kramer, 1996) já foram citadas por mais de 1400 e 550 publicações 
científicas, respectivamente (http//www.webofscience.com). Esses métodos 
vêm sendo empregados na quantificação bacteriológica de alimentos (Nogva 
& Lillehaug, 1999; Hein et al., 2001), ambiental (Becker et al., 2000; 
Grüntzig et al., 2001), humana (Oberst et al., 1998; Lyons et al., 2000) e 
veterinária (Creelan & McCullough, 2000; Pusterla et al., 2000). 
Cumpre salientar que outros sistemas PCR-QTR, ainda baseados 
em agentes intercalantes, tais como o SYBR® Green I (PE, Applied 
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Biosystems), apoiam-se em outras propriedades químicas, processadas em 
determinados cicladores térmicos em tempo real, e também contornam o 
problema da intercalação inespecífica de agentes intercalantes a produtos da 
PCR não-específicos. As variantes dessas duas principais estratégias químicas 
de PCR-QTR, intercalação ou hibridização de dyes, encontram-se detalhadas a 
seguir. 
 
 
ESTRATÉGIAS PCR-QTR VIA INTERCALAÇÃO 
DE DYE 
 
O princípio dessa estratégia baseia-se na detecção e quantificação 
de amplicons de no mínimo 300 nucleotídeos, por intermédio da intercalação 
de uma substância fluorogênica - (dye) (Ginzinger, 2002). Essas substâncias se 
encaixam no sulco menor de moléculas de dupla fita de DNA (DNA-fd) de 
amplicons gerados durante as fases de extensão de cada ciclo da PCR, o que 
resulta no aumento da emissão de fluorescência do dye quando luminosamente 
excitado nessa fase da PCR (Wittwer et al., 1997) (figura 1). Dessa forma, 
obtém-se uma equivalência entre as quantidades do sinal fluorescente emitido 
pelo agente intercalante e de amplicon gerado durante a PCR. Durante a fase 
de desnaturação do DNA, em cada um dos ciclos da PCR, ocorre a liberação 
do dye da estrutura DNA-fd, que retorna para a solução, caindo o sinal de 
fluorescência emitido pelos mesmos (Ginzinger, 2002). O agente intercalante 
mais utilizado atualmente em estratégias PCR-QTR é o SYBR® Green I 
(Molecular Probes®). Quando intercalado a DNA-fd, o SYBR® Green I 
aumenta sua fluorescência em até 100 vezes quando luminosamente excitado, 
quando comparado ao dye excitado em solução, não intercalado em DNA-fd 
(Ginzinger, 2002). 
Essa estratégia PCR-QTR apresenta a vantagem de ser sensível. O 
desenho de oligonucleotídeos e os procedimentos de otimização dos mesmos 
para a quantificação do amplicon desejado não são requeridos, já que esse dye 
se liga, de forma inespecífica, a qualquer molécula de DNA-fd 
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Anelamento Extensão
s
s
s
5‟ ? 3‟(P) 5‟_______________ 3‟
3‟ _____________ 5‟ 3‟_______________ 5‟S
S S
 
 
 
Figura 1. Sistema de detecção fluorescente do tipo SYBER GREEN I. 
Legenda: s = moléculas de SYBER GREEN I em suspensão no 
volume de reação; 3‟?5‟: fita de DNA sendo replicada pela DNA 
polimerase (P); S = moléculas de SYBER GREEN I, intercaladas 
em DNA-fd, emitindo fluorescência. 
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(Ginzinger, 2002). Contudo, esse aspecto da técnica também se constitui em 
sua principal desvantagem, já que o SYBR® Green I pode se ligar, 
indistintamente, a qualquer tipo de amplicon, tais como dímeros de primers e 
produtos PCR não-específicos, presentes na PCR-QTR. Assim, há risco de 
superestimar a quantificação da seqüência-alvo de DNA de interesse presente 
em uma amostra. 
A inespecificidade do SYBR® Green I vem sendo contornada, 
basicamente, através de duas estratégias. A primeira delas consiste em impedir 
a formação de dímeros de primers e de qualquer produto inespecífico da PCR. 
Desse modo, a fluorescência emitida na PCR-QTR decorre de moléculas 
SYBR® Green I encaixadas somente no amplicon gerado a partir da 
seqüência-alvo de DNA de interesse. Isso pode ser alcançado por meio do 
desenho de novos pares de primers (Ginzinger, 2002) e cuidadosa otimizaçãoda reação, com a adoção de ciclagens térmicas como a da PCR Hot Star 
(Wiseman, 2002; Klein, 2002). 
A lógica da segunda estratégia é a de se „conviver‟ com a presença 
de dímeros de primers e produtos não-específicos da PCR no volume da PCR-
QTR. Isso se dá com a determinação de curvas de desnaturação, que é feita 
mediante a adição de uma etapa de ciclagem térmica especial, após a PCR-
QTR. A presença de um único pico de desnaturação, que corresponda ao 
amplicon que se está sendo quantificado, atesta que não houve a ligação de 
SYBR® Green I a outras moléculas DNA-fd, permitindo atribuir toda a 
fluorescência emitida às moléculas de SYBR® Green I ligadas à molécula do 
amplicon de interesse. Por sua vez, a detecção de dois ou mais picos de 
desnaturação, além daquele esperado, referente ao amplicon estudado, sinaliza 
a presença de outras moléculas DNA-fd que apresentam moléculas de 
SYBR® Green I ligadas a elas. Nesse caso, cicladores térmicos em tempo 
real, que executam curvas de desnaturação, contabilizam a fluorescência 
emitida somente por aquelas moléculas de SYBR® Green I efetivamente 
ligadas ao amplicon de interesse, desconsiderado o sinal fluorescente emitido 
pelo dye doador intercalado a moléculas DNA-fd inespecíficas. Desse modo, 
PCR-QTR, baseada em SYBR® Green I, seguida de análise de curva de 
desnaturação, quantifica melhor o amplicon de interesse (Klein, 2002). 
 
 
ESTRATÉGIAS DE PCR-QTR VIA HIBRIDIZAÇÃO DE 
OLIGONUCLEOTÍDEOS FLUOROGÊNICOS 
 
Esta é uma estratégia química de PCR-QTR que apresenta 
diferentes variações metodológicas, cada qual anulando, a seu modo, o efeito 
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quencher entre dyes fluorescentes. Contudo, todos os tipos de PCR-QTR 
baseados em hibridização de oligonucleotídeos fluorogênicos requerem (i) um 
conjunto de primers para a geração do amplicon; (ii) hibridização a uma 
região específica interna do amplicon gerado; (iii) excitação luminosa do 
volume da reação e (iv) quantificação da fluorescência emitida pelos dyes 
fluorófilos durante a fase exponencial da PCR-QTR (Walker, 2001, 2002; 
Ginzinger, 2002). 
Os principais tipos variantes do método da PCR-QTR, baseado em 
oligonucleotídeos providos de dyes fluorescentes, podem ser distinguidos 
quanto (i) ao tipo de oligonucleotídeo fluorogênico (sonda ou primer-sonda), 
(ii) ao número de oligonucleotídeo fluorogênico que incorporam os dyes 
fluorófilos (um ou dois); (iii) ao mecanismo quencher explorado [efeito FRET 
(do inglês, Förster resonance energy transfer) ou “collisional quenching”]; (iv) 
ao tipo de afastamento físico entre os dyes doador e quencher (hidrólise de 
nucleotídeos da sonda ou hibridização de seqüência nucleotídica intra-loop e 
conseqüente afastamento dos dyes fluorófilos); (v) ao estado em que ocorre o 
efeito quencher (em suspensão ou hibridizado) e (vi) ao tipo de fluorescência 
emitida que monitora a geração de amplicons na PCR-QTR (dye doador ou 
quencher). 
Estratégias PCR-QTR via oligonucleotídeos fluorogênicos, 
diferentemente de dyes intercalantes, permitem que duas ou mais seqüências-
alvo de DNA ou cDNA, em se tratando de fitopatógenos virais, sejam 
simultaneamente quantificadas em uma mesma reação, sob a forma de ensaio 
PCR-QTR multiplex. A quantificação de dois ou mais amplicons durante a 
reação é monitorada pela emissão de fluorescência correspondente aos dyes 
doador das sondas específicas de cada uma das seqüências-alvo de DNA 
(Leutenegger, 2001). 
Os principais tipos dessas estratégias PCR-QTR são discriminados 
detalhadamente a seguir. 
 
PCR-QTR HIBRIDIZAÇÃO DE SONDAS COM DYES 
FLUOROGÊNICOS 
 
Sondas TaqMan®. 
Atualmente, a sonda TaqMan® (Roche Molecular Systems) é a 
técnica PCR-QTR mais empregada (Heid et al., 1996). A sonda é um oligo de 
DNA com 25-30 nucleotídeos, não-extensível, devido à presença do grupo 
fosfato 3´ e marcada com dois dyes fluorófilos. São eles, o FAM (6-
carboxyfluorescein), o TET (6-carboxy-4,7,2´,7´-tetrachlorofluorescein) e o 
JOE (2‟,7‟-dimethoxy-4‟,5‟-dichloro-6-carboxy-fluorescein), na posição 5´, 
como dye doador, e o TAMRA (N,N,N,N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine), 
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na posição 3´, como dye quencher. 
Na ausência da seqüência-alvo de DNA na PCR-QTR, a sonda 
TaqMan® permanece intacta na reação. Uma vez excitado luminosamente, o 
dye doador emite energia fluorescente que é transferida para a dye quencher, 
em virtude da proximidade entre os dyes. Ocorre, assim, o efeito quencher, 
resultando na emissão de fluorescência de comprimento de onda 
correspondente ao dye quencher (Didenko, 2001) (figura 2). 
Na presença da seqüência-alvo de DNA, a sonda TaqMan® 
hibridiza especificamente, durante a fase de pareamento, em uma região 
interna da seqüência-alvo de DNA, geralmente com 75-150 nucleotídeos, 
entre os sítios de pareamento dos primers forward e reverse (Heid et al., 
1996). A hibridização da sonda ocorre antes do pareamento dos primers, já 
que apresenta temperatura de desnaturação de 10 
o
C maior que a desses oligos 
(Leutenegger, 2001). 
A anulação do efeito quencher entre os dyes fluorófilos é obtida 
por meio da hidrólise da sonda hibridizada à seqüência-alvo, através da 
atividade exonucleolítica 5´  3´ da Taq DNA polimerase, que remove esse 
obstáculo físico à replicação, permitindo a extensão do primer upstream até o 
final da seqüência-alvo de DNA (Heid et al., 1996). Excitação luminosa do 
dye doador, agora fisicamente separado do dye quencher e livre em 
suspensão, resulta na emissão de energia fluorescente pelo dye doador (figura 
2). Já as moléculas de dye quencher diminuem a intensidade de fluorescência 
emitida. 
Durante os sucessivos ciclos da PCR-QTR, ocorre crescimento 
exponencial da geração de amplicons e de hidrólise de sondas, o que é 
monitorado, em tempo real, pelo aumento da quantidade de fluorescência 
emitida pelo dye doador (Heid et al., 1996). 
A principal vantagem do sistema TaqMan de PCR-QTR é a 
facilidade no desenho dos oligos (primers e sonda) e sua elevada 
especificidade de hibridização. Sua principal desvantagem é a ocorrência de 
eventual background de fluorescência (www.biosci.ohio-state.edu/~pmgf). 
Existem, contudo, alternativas que minoram o efeito de background dessa 
estratégia PCR-QTR. Uma delas diz respeito ao emprego de sondas 
TaqMan dotadas de dye quencher especiais, como o dye BHQ (do inglês, 
´black hole quencher´) (Biosearch Technologies). Diferentemente do dye 
TAMRA, comumente empregado em sistemas TaqMan, esse dye quencher 
não emite fluorescência naturalmente, já que converte a energia transferida do 
dye doador, luminosamente excitado quando presente em uma sonda 
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Anelamento Extensão
D
q
5‟____?(P) 5‟(d)_____ 3‟(Q) 5‟___________________(P) ?3‟
3‟______________________________ 5‟ 3‟_________________________ 5‟
PF
 
 
 
 
 
Figura 2. Sistema de detecção fluorescente do tipo TAQMAN. 
Legenda: 3‟?5‟ = fita de DNA onde o primer forward (PF) 
encontra-se anelado à sua seqüência nucleotídica complementar e a 
DNA polimerase (P) já se ligou para estender o primer; 5‟(d)?3‟(Q) 
= sonda TAQMAN hibridizada à sua seqüência nucleotídica 
complementar. A proximidade entre os dyes doador (d) e quencher 
(Q) não permite que haja emissão de fluorescência; D e q = dyes 
doador (D) e quencher (q) encontram afastados entresi, suspensas 
no volume de reação, após a hidrólise da sonda TAQMAN via ação 
exonucleolítica da DNA polimerase, resultando na emissão de 
fluorescência pelo dye doador (D). 
 
 
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intacta, em calor (Ginzinger, 2002). 
 
Sondas molecular beacon® (Stratagene) 
Molecular beacon® (Tyagi & Kramer, 1996) é um tipo de sonda 
fluorogênica em forma de „grampo de cabelo‟ constituída de duas regiões: (i) 
região do loop da sonda; seqüência ss-DNA interna da sonda, onde se 
encontra a seqüência nucleotídica complementar à seqüência-alvo de DNA e a 
(ii) região auto-complementar da sonda; seqüência DNA-fd externa da sonda, 
que se segue à região do loop, constituída geralmente de cinco ou seis 
nucleotídeos, rica em conteúdo GC e palindrômica, o que favorece o auto-
pareamento (Tyagi & Kramer, 1996). Nas extremidades 5´ e 3´ da sonda são 
adicionados os dyes doador (FAM) e o quencher (DABCYL), 
respectivamente. 
Na ausência de seqüência-alvo, a molecular beacon permanece 
intacta na reação. Quando submetida à irradiação luminosa ocorre o efeito 
quencher entre os dyes, acarretando a não emissão de fluorescência do dye 
doador e conseqüente emissão de calor pelo dye quencher (Tyagi & Kramer, 
1996). 
Havendo a presença de seqüência-alvo, ocorre a hibridização da 
seqüência nucleotídica da região do loop da molecular beacon em uma região 
interna de sua seqüência-alvo, antes do pareamento dos primers (Tyagi & 
Kramer, 1996) (figura 3). 
A anulação do efeito quencher entre os dyes fluorófilos não resulta 
da hidrólise da molecular beacon®, como ocorre no sistema TaqMan®, mas 
da abertura da região auto-complementar da sonda, em decorrência da 
complementação da seqüência interna do loop à sua seqüência-alvo de DNA. 
Desse modo, ocorre o afastamento físico entre os dyes doador e quencher 
(Figura 3). Quando o volume de reação é irradiado, ocorre a emissão de 
fluorescência de comprimento de onda correspondente ao dye doador (Tyagi 
& Kramer, 1996). 
Diferentemente do sistema PCR-QTR TaqMan®, onde o 
monitoramento da emissão de fluorescência ocorre durante a fase de extensão, 
PCR-QTR molecular beacon® se dá durante a fase de pareamento de cada 
ciclo da PCR. Ao término de cada fase de pareamento, as sondas molecular 
beacon® retornam intactas à sua forma nativa, pareando-se à seqüência-alvo 
de DNA a cada novo ciclo da PCR (Tyagi & Kramer, 1996). 
A principal vantagem dessa estratégia química PCR-QTR é a sua 
elevada especificidade de anelamento, em virtude de sua condição altamente 
termoestável, decorrente do formato hairpin da sonda, e reduzido background 
de fluorescência. Contudo, o emprego de molecular beacon® 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 299 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
 
 
 
 
 
 
 
 
_________________________________________________________________________
Anelamento Extensão
5‟____?(P) _________ 5‟___________________ 3‟
3‟ _________________________ 5‟ 3‟___________________ 5‟
_________________________________________________________________________
PF
3‟(q)5‟(D) 3‟(Q)5‟(d)
 
 
 
Figura 3. Sistema de detecção fluorescente do tipo Molecular Beacon. 
Legenda: 3‟? 5‟ = fita de DNA onde o primer forward (PF) 
encontra-se anelado à sua seqüência nucleotídica complementar e a 
DNA polimerase (P) já se ligou para estender o primer; 5‟(D)?3‟(q) 
= molecular beacon hibridizado à sua seqüência nucleotídica 
complementar. O afastamento entre os dyes doador (D) e quencher 
(q) permite que haja emissão de fluorescência; 5‟(d)?3‟(Q) = 
molecular beacon inativa, sob a forma de “grampo de cabelo”. A 
proximidade entre os dyes doador (d) e quencher (Q) não permite 
que haja emissão de fluorescência. 
 
 
300 – Antonio Carlos de Oliveira et al. 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
apresenta dificuldades relativas ao desenho da sonda e otimização da reação 
(www.biosci.ohio-state.edu/~pmgf) podendo ocorrer a sobreposição de 
espectro do dye doador com o do quencher DABCYL (Bustin, 2002). 
 
Sonda molecular beacon hidrolisável 
Variações dos sistemas PCR-QTR baseados em molecular 
beacon® e TaqMan® vêm sendo descritas. Aumento do grau de sensibilidade 
e confiabilidade e diminuição de problemas relativos ao background de 
fluorescência vêm sendo alcançados com a descrição de novas estratégias que 
reúnem características de ambos os sistemas, como é o caso de molecular 
beacon hidrolisável (Kong et al., 2002). Diferentemente das sondas TaqMan 
convencionais, que são lineares, essas sondas têm o formato de grampo de 
cabelo, como molecular beacon®. A hidrólise dessas sondas tipo molecular 
beacon® ocorrem durante a fase de extensão, a partir do nucleotídeo 5´ da 
região de auto-anelamento da sonda, que é complementar à seqüência-alvo de 
DNA, o que distancia o dye doador do quencher, anulando a ocorrência do 
efeito quencher (www.biosci.ohio-state.edu/~pmgf) (figura 4). 
Outra variação importante da técnica é a incorporação à sonda de 
um dos primers da reação, tal como com os primers Scorpions
Tm
 (Whitcombe 
et al., 1999) (ver item 7.2. para maiores detalhes), o que reduz a duração de 
ciclagem da PCR-QTR. 
 
Sondas HybProbes® (LightCycler - Roche™) 
As estratégias PCR-QTR apresentadas anteriormente exploram a 
anulação do efeito quencher entre os dyes fluorófilos presentes em uma 
mesma sonda, com a emissão de fluorescência do dye doador para o 
monitoramento da geração de amplicon durante a PCR-QTR. Em 1997, foi 
descrito um tipo de sonda fluorogênica denominada hybprobe (Wittwer et 
al., 1997), que quantifica a polimerização do amplicon por meio da 
fluorescência emitida pelo dye quencher, decorrente do efeito quencher, entre 
os dyes doador e quencher presentes, cada qual, em uma sonda diferente 
(sondas upstream ou downstream). A sonda upstream contém o dye doador, 
geralmente Fluoresceina ou Cy5 à sua extremidade 3´ e a sonda downstream 
tem ligada o dye quencher, geralmente representada pelos fluorófilos 
LightCycler Red 640 ou 705 à sua extremidade 5´. 
Na ausência de seqüência-alvo de DNA no volume da PCR-QTR, 
as duas sondas permanecem em suspensão, em seu estado nativo, a uma 
distância maior do que a permitida para que ocorra o efeito quencher. Quando 
o volume de reação é irradiado com luz azul (470 nm), há emissão 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 301 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
 
 
 
 
 
 
_________________________________________________________________________
Anelamento Extensão
D
q
5‟____?(P) _________ 5‟_______________(P)?3‟
_________________________ 5‟ 3‟___________________ 5‟
_________________________________________________________________________
PF
3‟(q)5‟(D)
 
 
Figura 4. Sistema de detecção fluorescente do tipo Molecular Beacon 
hidrolisável. 
Legenda: 3‟?5‟ = fita de DNA onde o primer forward (PF) 
encontra-se anelado à sua seqüência nucleotídica complementar e a 
DNA polimerase (P) já se ligou para estender o primer; 5‟(D)?3‟(q) 
= molecular beacon hibridizado à sua seqüência nucleotídica 
complementar. O afastamento entre os dyes doador (D) e quencher 
(q) permite que haja emissão de fluorescência; 5‟(d)?3‟(Q) = dyes 
doador (D) e quencher (q) encontram afastados, definitivamente, 
entre si, suspensas no volume de reação, após a hidrólise da 
molecular beacon via ação exonucleolítica da DNA polimerase, 
resultando na emissão de fluorescência pelo dye doador (D). 
302 – Antonio Carlos de Oliveira et al. 
 
RAPP– Volume 12, 2004 
de fluorescência somente do dye doador (luz fluorescente verde, 530 nm), ou 
seja, não ocorre o fenômeno FRET entre os dyes doador e o quencher 
(Didenko, 2001; Cockerill & Smith 2002). 
Havendo a presença de seqüência-alvo de DNA na PCR-QTR, 
ocorre a hibridização das duas sondas hybprobe no DNA, orientadas em 
sentido contrário, uma em relação à outra e separadas somente por um a cinco 
nucleotídeos, o que permite a ocorrência do efeito quencher (Didenko, 2001; 
Cockerill & Smith 2002) (figura 5). Assim, quando o volume de reação é 
irradiado com luz azul (470 nm) durante a fase de anelamento de cada ciclo da 
PCR-QTR, ocorre a transferência de energia do dye doador para o dye 
quencher, que passa a emitir luz fluorescente vermelha de comprimento de 
onda de 640 ou 705 nm, dependendo do dye quencher empregado na reação. 
É essa emissão de luz fluorescente que é quantificada para monitorar a 
polimerização de amplicons durante a PCR-QTR. Com o início da fase de 
extensão de cada ciclo da PCR-QTR, as sondas Hybprobe retornam intactas 
à suspensão em solução, devido à sua remoção de seus sítios de anelamento, 
devido ao aumento de temperatura do volume de reação. 
A principal vantagem do sistema PCR-QTR, baseado em 
Hybprobe, é a sua elevada especificidade, que decorre da hibridização de 
quatro oligos à seqüência-alvo de DNA envolvidos na geração (dois primers) 
e quantificação (duas sondas) do amplicon. Contudo, a construção desses 
quatro oligos requer que a seqüência-alvo de DNA seja maior do que a 
empregada para a síntese de oligos para as outras estratégias PCR-QTR 
(Klein, 2002; Wiseman, 2002). 
 
PCR-QTR VIA HIBRIDIZAÇÃO DE PRIMER-SONDA COM DYE 
FLUOROGÊNICO 
 
Diferentemente das estratégias PCR-QTR discutidas previamente, 
que exploram o efeito quencher por meio de sonda fluorogênica, fisicamente 
separadas dos primers, esse sistema PCR-QTR monitora a geração de 
amplicons por meio da hibridização de primer-sonda fluorogênico. Os 
principais tipos de PCR-QTR dessa categoria são o primers Sunset, 
Amplifluor Uniprimer, Scorpions
Tm
 (Whitcombe et al., 1999), que são oligos 
fluorogênicos combinados, constituído pelo primer e uma sonda, que contêm 
dyes doador e quencher (Bustin, 2002; Klein, 2002). 
Os primers Scorpions
Tm
, principal sistema PCR-QTR baseado em 
oligos fluorogênicos combinados, são constituídos pelo primer, requerido para 
iniciação da polimerização do amplicon e, ligado covalentemente em 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 303 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
_________________________________________________________________________
Anelamento Extensão
 5‟ ______ 3‟(D)
(q) 3‟ ____ 5‟
5‟____?(P) 5‟___3‟(d) (Q)5‟____3‟ 5‟_________________________ 3‟
3‟ ________________________________ 5‟ 3‟ _________________________ 5‟
_________________________________________________________________________
PF
 
 
Figura 5. Sistema de detecção fluorescente do tipo Hybprobe. 
Legenda: 3‟?5‟ = fita de DNA onde o primer forward (PF) encontra-se 
anelado à sua seqüência nucleotídica complementar e a DNA polimerase (P) 
já se ligou para estender o primer; 5‟?3‟(d) e (Q)5‟?3‟ = sondas HybProbes 
anelam-se próximos (1-5 nucleotídeos) entre si. A proximidade entre os dyes 
doador (d) e quencher (Q) não permite que haja emissão de fluorescência; 
5‟?3‟(D) e (q)5‟?3‟ = sondas HybProbes suspensas no volume da reação. A 
distância física entre os dyes doador (D) e quencher (q) permite que haja 
emissão de fluorescência pelo dye doador (D). 
304 – Antonio Carlos de Oliveira et al. 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
sua extremidade 5´, de uma sonda em formato de grampo de cabelo, que 
carreia os dyes doador e quencher em suas extremidades 5´ e 3´ da região 
auto-complementar (Whitcombe et al., 1999; Bustin, 2002; Klein, 2002). A 
sonda não é amplificada durante a fase de extensão da PCR-QTR devido à 
presença do "PCR stopper", geralmente o glicol hexetileno, molécula que 
impede com que a seqüência nucleotídica da estrutura em grampo de cabelo 
da sonda se abra. 
Na ausência de seqüência-alvo de DNA, os primers Scorpions
Tm
 
permanecem em solução em seu estado nativo, com os dyes fluorófilos 
próximos entre si na região auto-complementar da sonda acoplada ao primer. 
A submissão do dye doador à irradiação não resulta na emissão de luz 
fluorescente, em decorrência do efeito quencher, i.e., não há emissão de 
fluorescência que corresponda ao dye doador, já que ocorre da transferência 
de energia do dye doador para o quencher, seguida de sua conversão em calor 
(Whitcombe et al., 1999). 
Havendo seqüência-alvo na PCR-QTR, os primers Scorpions
Tm
 
anelam-se em seus sítios específicos no DNA e são extendidos pela Taq DNA 
polimerase durante a geração de amplicons. À medida que ocorre a 
polimerização do amplicon, surge a seqüência-alvo da sonda, que tem início 
nos três primeiros nucleotídeos localizados após a extremidade 3´ do primer 
Scorpion
Tm
. A sonda hibridiza com a sua seqüência complementar, recém-
sintetizada, o que resulta na abertura da estrutura de grampo de cabelo da 
sonda, afastando os dyes doador e quencher, o que anula o efeito quencher 
entre os fluorófilos (figura 6). Desse modo, o dye doador emite luz 
fluorescente quando irradiado (Bustin, 2002; Walker, 2001). 
As principais vantagens dos sistemas PCR-QTR, que combinam 
primer e sonda fluorogênica em um mesmo oligo, incluem facilidade na 
construção e otimização de oligos combinados, ciclagens térmicas mais 
rápidas, maior intensidade da fluorescência emitida pelo dye doador e baixo 
background (Whitcombe et al., 1999; Thelwell et al., 2000). As principais 
desvantagens são a baixa sensibilidade e a possibilidade de não ser útil em 
PCR-QTR multiplex (www.biosci.ohio-state.edu/~pmgf). 
 
PCR-QTR VIA HIBRIDIZAÇÃO DE PRIMER COM DYE 
FLUOROGÊNICO SELF-QUENCHING 
 
Há ainda um outro mecanismo de detecção de fluorescência em 
análises PCR-QTR operado por meio de primers LUX (Light Upon 
eXtension) (Invitrogen). Os primers LUX possuem uma estrutura tipo 
hairpin, que possui um fluorófilo ligado ao nucleotídeo da extremidade 3´ de 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 305 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
_________________________________________________________________________
Anelamento Extensão Novo Anelamento
3´ _____ ___? (P) 3´______3‟ _____3‟(D)
3‟______ 5‟ 3‟____ 5‟ (Q, B)3‟_______ 5‟
_________________________________________________________________________
PF
3‟ (Q, B)5‟(d)3´3‟ (Q, B)5‟(d)
 
 
Figura 6. Sistema de detecção fluorescente do tipo primer Scorpion. 
Legenda: 3‟?5‟ = fita de DNA onde o primer „Scorpion‟ encontra-
se anelado à sua seqüência nucleotídica complementar e a DNA 
polimerase (P) já se ligou para estender o primer „Scorpion‟; 5‟(d) 
?3‟(Q, B) = primer-sonda Scorpion. A proximidade entre os dyes 
doador (d) e quencher (Q) não permite que haja emissão de 
fluorescência; 5‟(D)?3‟(q, B) = primer-sonda Scorpions, 
distendida. O afastamento entre os dyes doador (D) e quencher (q) 
permite que haja emissão de fluorescência pelo dye doador (D). 
306 – Antonio Carlos de Oliveira et al. 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
sua estrutura, que apresenta um mecanismo de self-quenching. Quando o 
primer LUX é incorporado em um produto PCR DNA-fd, o efeito self-
quenching do fluorófilo se extingue, ocorrendo aumento substancial do sinal 
de fluorescência (figura7). A grande vantagem desse sistema é o fato que 
nenhuma sonda ou dye quencher são necessários nessa plataforma PCR-QTR, 
além de apresentar performance comparável com as sondas TaqMan®. 
 
 
CONSTRUÇÃO DE OLIGOS PARA PCR-QTR 
 
À semelhança da detecção de bactérias por PCR, o ensaio PCR-
QTR requer que parte da seqüência nucleotídica específica da bactéria seja 
conhecida para a construção dos primers e da(s) sonda(s) fluorogênica(s). 
Essas seqüências podem ser inicialmente obtidas a partir da (i) detecção de 
polimorfismo de DNA entre estirpes de bactérias, como descrito para a 
Xylella fastidiosa, responsável pela clorose variegada dos citros (Pooler & 
Hartung, 1995; Ferreira et al., 2000); (ii) emprego de seqüência plasmidial 
patógeno-específica, como é o caso da Ralstonia amylovora (Bereswill et al., 
1992); (iii) hibridização subtrativa, técnica que enriquece de seqüências 
específicas de DNA, como em Pseudomonas solanacearum (Seal et al., 
1992) e (iv) por seqüenciamento de ITS (internal transcribed spacer), regiões 
genômicas curtas entre os genes rDNA 16S e 23S, cuja seqüência geralmente 
é específica de um patovar, como é o caso de Xanthomonas spp. em cereais 
(Toth et al., 2001). 
Após obtenção de seqüência nucleotídica de DNA específica de 
uma determinada bactéria, é necessário validar a sua especificidade ao 
genoma do microorganismo em que ela foi detectada, atestando-se ausência de 
homologia com seqüências de patovares da mesma espécie ou de outras 
espécies, depositadas em banco de dados, como o GenBank 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e o EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/), antes 
de dar início à construção de oligos para ensaios com PCR-QTR. 
Existem diferentes programas que auxiliam na construção de oligos 
para PCR-QTR (Bustin, 2002). O ´Primer Express´ (Applied Biosystems) é, 
possivelmente, o mais empregado. Uma relação básica de programas inclui o 
JaMBW e o Primer3 para a construção de primers e de sondas, 
respectivamente. Oligos fluorogênicos que requeiram conformação espacial, 
como é o caso de molecular beacon e primers Scorpion
Tm
, podem ser 
construídos via software DNA mfold 
(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/dna). Os principais 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 307 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
_________________________________________________________________________
Pré-desnaturação Anelamento/Extensão
+ 5‟_______________ 3‟ 5‟ ________ 3‟(sq)
3‟ ______________ 5‟ 3‟__________________ 5‟
_________________________________________________________________________
 5‟ 3‟(SQ)
 
 
Figura 7. Sistema de detecção fluorescente do tipo primer LUX. 
Legenda: 3‟?5‟ = fita de DNA onde o primer LUX (5´?3´SQ), sob a 
forma de “grampo de cabelo”, se hibridiza durante a fase de 
anelamento, juntamente com a DNA polimerase (P), que estenderá 
o primer LUX. O primer LUX na fase de pré-desnaturação 
apresenta fluorófilo self-quenching (SQ), não havendo, nessa fase 
da PCR-QTR, emissão de fluorescência; 5‟?3‟(sq) = primer LUX 
pareado com a seqüência de DNA complementar. O efeito self-
quenching do fluorófilo se extingue (sq), ocorrendo aumento 
substancial do sinal de fluorescência. 
308 – Antonio Carlos de Oliveira et al. 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
fatores para os quais se devem atentar durante a construção de sondas incluem 
o número total de nucleotídeos, percentagem ou conteúdo G/C, composição 
ideal de nucleotídeos nas extremidades 5´ e 3´ e faixa de temperatura 
de melting para a hibridização (Bustin, 2002). 
 
 
CINÉTICA DA PCR-QTR E O CYCLE THRESHOLD (CT) 
 
Como ocorre na cinética da PCR, o perfil da PCR-QTR apresenta 
três fases distintas: (i) background ou inicial, (ii) log ou crescimento 
exponencial e (iii) “plateau” ou final. A interface entre as duas primeiras 
fases, denominada cycle threshold (CT) (Higuchi et al., 1993), ocorre em um 
determinado ciclo da PCR-QTR, em que a intensidade de fluorescência 
emitida pelo dye doador, decorrente da geração de amplicons, é calculada 
como sendo, geralmente, 10 vezes o desvio-padrão acima do background 
médio de fluorescência emitida pelo dye doador durante o 3
o
 ao 15
o
 ciclo da 
PCR-QTR (Walker, 2002). 
Já a interface entre as fases log e de platô se caracteriza por uma 
redução da eficiência da PCR-QTR, determinada pelo aumento da 
concentração dos amplicons e redução da concentração dos reagentes, 
notadamente primers, no volume de reação da PCR-QTR (Wittwer et al., 
1997). Isso acarreta diferentes valores de mensuração do amplicon gerado 
durante a fase de platô, mesmo a partir de repetições de mesma concentração 
de seqüência-alvo (Higuchi et al., 1993). 
O valor CT de uma PCR-QTR determina o exato momento em que a 
geração de amplicons passa a ser polimerizada exponencialmente e é 
inversamente proporcional à quantidade de seqüência-alvo de DNA presente 
no início da reação. Portanto, considerando-se um ensaio PCR-QTR 
constituído das amostras A e B, tendo a primeira a metade da concentração de 
seqüência-alvo de DNA que a segunda, o CT-amostra A será maior que o CT-
amostra B em uma unidade. Contudo, se as duas amostras possuem a mesma 
concentração de seqüência-alvo, ambas devem aumentar significativamente a 
intensidade do sinal de fluorescência ao mesmo tempo, em relação ao 
background de fluorescência da fase inicial da PCR-QTR, ou seja, devem 
apresentar valores CTs idênticos ou muito próximos entre si. 
 
 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 309 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
MÉTODO DE QUANTIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIAS-
ALVO DE DNA VIA PCR-QTR 
 
A concentração inicial da seqüência-alvo de DNA pode ser inferida 
por meio de quantificação absoluta. Nesse procedimento, o número de 
moléculas de seqüência-alvo na amostra é estimado interpolando-se o valor CT 
obtido com a equação da regressão linear resultante da curva-padrão de 
valores médios de CT, obtida pela relação inversa de dependência entre as 
concentrações crescentes de um padrão de referência da seqüência-alvo (eixo 
x) e o sinal de fluorescência da geração de amplicons (eixo y) (Ginzinger, 
2002). A curva-padrão é construída por intermédio de diluições seriais, 
geralmente decimais. Contém, geralmente, 10
4
 ou 10
5
 cópias da seqüência-
alvo de DNA entre as duas concentrações extremas, sendo que cada 
concentração é representada em duplicata ou triplicata (www.biosci.ohio-
state.edu/~pmgf ). 
Os padrões de referência com seqüência-alvo de DNA são 
geralmente obtidos de (i) amplicons gerados via PCR, (ii) plasmídeos 
contendo a inserção da seqüência-alvo ou (iii) da própria célula ou 
microrganismo, desde que se saiba o número de cópias da seqüência-alvo em 
seu genoma (Ginzinger, 2002). A concentração da solução inicial pode ser 
determinada por fluorômetro ou espectrofotômetro (Abs-260nm) e é 
geralmente apresentada como sendo número de cópias por célula, por grama 
de tecido, etc. Durante a sua montagem, a dispensa de volumes de padrões de 
referência contendo DNA na placa de reação requer técnica e instrumentação 
especiais para se evitar eventos de contaminação entre as reações (Ginzinger, 
2002). 
Ginzinger (2002) sugere denominar quantificação absoluta por 
„arbitrária‟ ou de „curva-padrão‟, já que não há como precisar com exatidão, 
independentemente do método de determinação de concentração de DNA 
empregada, o número de cópias da seqüência-alvo presente no padrão de 
referência. Tem-se, quando muito, uma estimativa muito precisa do número de 
cópiasde DNA presentes. Uma vez que a concentração do número de cópias 
da seqüência-alvo empregada na construção da curva-padrão não é 
determinada a rigor, a quantidade do número de cópias da seqüência-alvo na 
amostra não é absoluta (Ginzinger, 2002). 
 
 
310 – Antonio Carlos de Oliveira et al. 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS 
FITOPATOGÊNICAS VIA PCR-QTR 
 
Desde a mensuração do primeiro fitopatógeno via PCR-QTR em 
1996 (Schoen et al., 1996), há crescente interesse fitopatológico pela técnica, 
considerando o aumento do número de publicações de ensaios PCR-QTR de 
agentes causais de doenças causadas por bactérias, vírus, fungos e nematóides. 
Até o momento, seis sistemas PCR-QTR foram descritos para fitobactérias 
saprófitas e/ou patogênicas: Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus 
(podridão anelar da batata) (Schaad et al., 1999; van Beckhoven et al., 2002); 
Erwinia herbicola (Belgrader et al., 1999); Ralstonia solanacearum biovar 
2A (murcha bacteriana da batata) (Weller et al., 2000) ; Agrobacterium 
radiobacter biovar 1 (raiz em cabeleira de pepino e tomate) (Weller & Stead, 
2002) e Xylella fastidiosa (Doença de Pierce da Videira) (Schaad et al., 
2002), X. fastidiosa (clorose variegada dos citros) (Oliveira et al., 2002) e 
Xanthomonas citrii (cnacro cítrico) (Mavrodieva et al., 2004). 
 
 
PERSPECTIVAS 
 
A tecnologia de PCR-QTR já foi utilizada em diferentes 
patossistemas que envolvem bactérias fitopatogênicas. Seu emprego como 
uma ferramenta analítica poderá contribuir em estudos de diferentes aspectos 
fitopatológicos, tais como: (i) determinação de qual estágio da patogênese é 
inibida em variedades hospedeiras resistentes, (ii) estudos filogenéticos de 
bactérias patogênicas de plantas, (iii) estudos epidemiológicos da 
disseminação de bacterioses e na (iv) caracterização de formas mutantes 
dessas bactérias, com relação a sua capacidade de multiplicação e 
deslocamento no interior das plantas hospedeiras. Cumpre também salientar 
que, em decorrência da elevada comercialização de plantas entre as nações, a 
ágil quantificação de bactérias fitopatogênicas é requerida em nas modernas 
legislações quarentenárias, o que pode ser alcançada com o emprego de PCR-
QTR. 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Os autores são gratos aos revisores ad hoc por suas sugestões e 
comentários. 
Detecção e quantificação de bactérias fitopatogênicas por PCR quantitativo em tempo real - 311 
 
RAPP – Volume 12, 2004 
LITERATURA CITADA 
 
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BELGRADER, P.; BENETT, W.; HADLEY, D.; RICHARDS, J.; 
STRATTON, P.; MARIELLA Jr., R. & MILANOVICH, F. 1999. PCR 
detection of bacteria in seven minutes. Science 284:449-50. 
BERESWILL, S.; PAHL, A.; BELLEMANN, P.; ZELLER, W. & GEIDER, 
K. 1992. Sensitive and species specific detection of Erwinia amylovora by 
polymerase chain reaction analysis. Appl. Envir. Microbiol. 58:3522-6. 
BUSTIN, S.A. 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse 
transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J. Mol. Endocrinol. 
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COCKERILL, F.R. & SMITH, T.F. 2002. Rapid-cycle real-time PCR: a 
revolution for clinical microbiology. Am. Soc. Microbiol. News 68:77-83. 
COLETTA FILHO, H.D.; BORGES, K.M. & MACHADO, M.A. 2000. 
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laranja-doce, e transmissão por borbulhas contaminadas. Laranja 21:327-
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CREELAN, J.L. & MCCULLOUGH, S.J. 2000. Evaluation of strain-specific 
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CUBERO, J.; GRAHAM, J.H. & GOTTWALD, T.R. 2001. Quantitative PCR 
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FERREIRA, H.; GONÇALVES, E.R.; RODRIGUES NETO, J. & ROSATO, 
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