AULA 6 Métodos de coloração coloração de Gram e Ziehl Neelsen

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Universidade Estadual de Feira de Santana – UEFS
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina: Microbiologia e Imunologia
Docente:
Monitora: Erika Anny Cerqueira
AULA VI –MÉTODOS DE COLORAÇÃO COLORAÇÃO DE GRAM E ZIEHL – NEELSEN
COLORAÇÃO DE GRAM
A coloração de Gram é o método de coloração diferencial mais utilizado. Ela foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram e divide as bactérias em dois grandes grupos: as Gram positivas e as Gram negativas.
A coloração de Gram refere-se à composição da parede celular. As bactérias apresentam uma parede celular externa à membrana e ela é constituída de peptidioglicano (dissacarídeos associados a polipeptídeos) que pode estar associado a outras substâncias. As Gram positivas são aquelas que apresentam várias camadas de peptidioglicano, o que torna a parede celular espessa e rígida, enquanto as Gram negativas possuem somente uma ou poucas camadas de peptidioglicano e portanto sua parede celular é delgada. Além disso, as Gram negativas apresentam uma membrana externa à camada de peptidioglicano composta por lipopolissacarídeos (LPS), lipoproteínas e fosfolipídeos e as Gram negativas apresentam ácido teicóico associado ao peptidioglicano.
Para realizar a coloração de Gram utiliza-se as seguintes substâncias: os corantes cristal violeta, lugol e fucsina, água destilada e álcool 95%. O cristal violeta irá penetrar através da parede e membrana celulares e irá corar a célula com uma cor púrpura. O lugol, que também é denominado mordente, tem a função de aumentar a afinidade do cristal violeta às estruturas das células a fim de corá-las com maior intensidade, formando um complexo cristal violeta-lugol. O fucsina, também chamado contra corante, é utilizado para corar as bactérias que perderão a coloração púrpura após a lavagem com álcool 95%. O álcool 95% age como descolorante pois extrai os lipídeos da membrana externa das bactérias Gram negativas, o que resulta em aumento da porosidade e da permeabilidade. A água destilada é utilizada para retirar o excesso de corante e álcool a cada etapa do procedimento.
PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO DE GRAM
1 – Adicione uma gota de solução salina em uma lâmina de vidro
2 – Dissolva na salina 1 (uma) colônia isolada do microrganismo que deseja corar.
3 – Deixe secar à temperatura ambiente ou próxima à chama.
4 – Assim que secar, inicie o processo de coloração seguindo os passos da figura abaixo:
Figura 01 - Procedimento para coloração de Gram (Adaptado de Cappuccino & Sheman, 1987).
RESULTADO
Ao final do processo de coloração, as bactérias que estiverem coradas de púrpura serão classificadas como Gram positivas, enquanto aquelas que estirem avermelhadas/rosadas serão ditas Gram negativas. As bactérias Gram positivas, após a lavagem com álcool 95%, não irão descolorir-se. Isso ocorre porque o álcool não irá alterar a estrutura da parede celular e por isso não permitirá que o complexo cristal violeta-lugol seja extraído da célula. Ao contrário, as bactérias Gram negativas irão perder a coloração púrpura pois o álcool irá formar poros na membrana externa da parede, o que associado à pequena espessura da camada de peptidioglicano, irá permitir a saída do complexo cristal violeta-lugol.
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
Há alguns tipos de bactérias que não se coram pela coloração de Gram ou por colorações mais simples. Por isso utiliza-se um outro tipo de coloração diferencial chamada coloração de Ziehl-Neelsen. Ela recebe esse nome pois foram o bacteriologista Franz Ziehl e o patologista alemão Friedrich Carl Adolf Neelsen que a desenvolveram. 
As espécies bacterianas Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae são exemplos de bactérias patogênicas aos seres humanos que se coram apenas através da coloração de Ziehl-Neelsen. As bactérias que se coram apenas por esse método possuem em sua parede celular lipídios fortemente ligados (ex.: ácido micólico) e essa propriedade confere a elas alta hidrofobicidade, o que dificulta a entrada de corantes aquosos e mordentes, por exemplo. Por isso é necessário a utilização de um corante forte/agressivo (fucsina fenicada) e a exposição da lâmina à temperatura elevada a fim de que o corante utilizado nesse processo possa penetrar através da parede celular. Além disso, elas também são chamadas álcool-ácido resistentes porque não se descolorem ao serem expostas ao álcool-ácido – propriedade também conferida pelos lipídios fortemente ligados –.
PROCEDIMENTO PARA COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
1 – Preparar o esfregaço para ser corado;
2 – Cobrir o esfregaço com o corante fucsina fenicada e deixar agir por 5 minutos a 10 minutos aquecendo simultaneamente a lâmina até a emissão de vapor e sem deixar que ocorra fervura;
3 – Lave bem a lâmina com água;
4 – Irrigue o esfregaço com o álcool-ácido adicionando o reagente gota a gota sobre a lâmina inclinada, para lavagem do primeiro corante;
5 – Lave a lâmina com água e retire o excesso com papel absorvente;
6 – Irrigue a lâmina com contracorante azul de metileno e deixe agir por 1 minuto;
7 – Lave a lâmina, sempre inclinada, com água e seque-a com um papel filtro sem esfregar;
8 – Examine o esfregaço com objetiva de 100x com óleo de imersão.
RESULTADO
As bactérias que estiverem coradas de vermelho após o procedimento serão chamadas álcool-ácido resistentes (B.A.A.R) pois elas não foram descoradas após o uso do álcool-ácido. As coradas de azul serão denominadas não álcool-resistentes pois o corante primário (fucsina fenicada) foi retirado da célula após a adição do álcool-ácido e o contracorante azul de metileno as corou de azul.
REFERÊNCIAS
BACTERIOLOGIA. NOGUEIRA, J. M. R; MIGUEL, L. F. S. Disponível em: < http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/cap3.pdf>. Acesso em: 16 mai 2015.
KONEMAN, Elmer W. Diagnostico Microbiológico texto e atlas colorido. 6. ed. São Paulo: MEDSI, 2008, 1465p.
TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2012.
UFF. Coloração de Gram. Disponível em: <http://www.uff.br/bacteriologia/aulaspraticas/coloracaodegram.htm>. Acesso em: 14 mai 2015.
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	Universidade Estadual de Feira de Santana – UEFS
Departamento de Ciências Biológicas
Disciplina: Microbiologia e Imunologia
Docente:
Monitora: Erika Anny Cerqueira
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Atividade de fixação
Dúvida com relação à ação do álcool nas paredes celulares.
Quais as diferenças entre as paredes celulares das bactérias Gram + e Gram -?
Qual a função do álcool 95% e do contra corante fucsina na coloração de Gram?
Qual característica da parede celular da bactéria Gram negativa permite a saída do complexo cristal violeta-lugol após a utilização do álcool?
Porque as bactérias álcool-ácido resistentes não se coram por meio de colorações simples ou pela coloração de Gram?
Julgue verdadeiro ou falso para a seguinte afirmação:
(	) Ao final da coloração de Ziehl-Neelsen as bactérias álcool ácido resistentes estarão coradas de azul.
_1458970326.doc
1 - Core o esfregaço com
cristal violeta por 1 min.
2 - Lave a coloração com
água destilada.
3 - Cubra com a solução
de Lugol por 1 min.
4 - Lave o excesso de
Lugol com água. 
5 - Lave a preparação com 
 etanol 95% (rapidamente)
6 - Lave o excesso de 
álcool com água.
7 - Cubra o esfregaço 
com solução de Fucsina
por 30 segundos.
8 - Lave o excesso de
Fucsina com água.
9 - Deixe a preparação
secar ao ar ou entre folhas
de papel de filtro.