Exercícios de Revisão BioTec Ana Carolina

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Exercícios de Revisão 
1. O que é sequenciamento de DNA? 
O sequenciamento do DNA é uma série de processos bioquímicos tem por finalidade determinar a ordem dos nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) em uma amostra de DNA.
2. No que se baseia o método de sequenciamento enzimático de Sanger? 
A caracterização completa de um fragmento de DNA clonado implica a determinação da sua sequência de nucleotídeos. Para este fim usa-se normalmente o método de Sanger, o qual permite determinar a sequência exata de uma cadeia de DNA com até 500 nucleotídeos.
O método consiste na síntese de cadeias a partir do fragmento de DNA a ser sequenciado - cadeias essas que são marcadas radioativamente numa extremidade e diferem entre si por um nucleotídeo. Por separação das cadeias truncadas através de eletroforese, pode estabelecer-se a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA original.
A síntese das cadeias truncadas é conseguida pelo uso de ddNTPs (didesoxirribonucleosídeos trifosfatados), os quais, e ao contrário dos dNTPs (desoxirribonucleosídeos trifosfatados), não possuem o grupo 3’-OH. Assim, embora possam ser usados pela DNA polimerase na síntese de cadeias de DNA, não permitem a formação duma ligação fosfodiéster com outro nucleotídeo trifosfato, pelo que a sua incorporação na cadeia resulta numa cadeia truncada, nesse ponto.
 
Assim, inicialmente procede-se à desnaturação do fragmento de DNA de dupla cadeia, originando cadeias molde para a síntese in vitro de DNA. São necessários primers para que se inicie a reacção pela DNA polimerase. É também o primer que define qual a cadeia que é usada como molde. Usam-se ainda baixas concentrações de ddNTPs e altas concentrações de dNTPs. Em cada reacção, um ddNTP é incorporado aleatoriamente na posição do dNTP correspondente, provocando a terminação da polimerização (Figura F7.1a).
A inclusão de marcadores fluorescentes com diferentes cores para cada tipo de ddNTP permite a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência (Figura F7.1b). Por exemplo, todas as sequências truncadas que terminem com um ddGTP podem ter fluorescência de cor amarela, as terminadas com ddATP com cor vermelha, etc., independentemente dos seus tamanhos. Por electroforese das sequências truncadas em gel de poliacrilamida, separam-se as diferentes cadeias simples de DNA (as quais diferem entre si apenas por um nucleotídeo). Existem máquinas que fazem detecção da fluorescência e que podem distinguir os 4 marcadores fluorescentes dos outros tantos ddNTPs. A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde, ou seja, a sequência obtida não é a da cadeia molde, mas sim a da sua cadeia complementar. (Figura F7.1c).
3. Os métodos de nova geração de sequenciamento de DNA (next generation sequencing) permitem realizar sequenciamento de alto desempenho, sendo um desses métodos o pirosequenciamento. A leitura da sequência de DNA por esse método é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas, iniciada com a liberação de uma molécula de pirofosfato, quando um desoxinucleotídeo é incorporado à cadeia de DNA. Esta informação está correta ou incorreta? 
O pirosequenciamento é uma nova técnica da Biologia Molecular, na qual a síntese de DNA ocorre através de um complexo de reações que inclui enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e substratos (adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato, liberado durante a adição de um nucleotídeo, resulta na produção de luz detectável. Portanto, quando um novo nucleotídeo é incorporado em uma cadeia crescente de DNA através da DNA polimerase, pirofosfato é gerado de maneira estequiométrica, resultando na produção de ATP. O ATP produzido leva à conversão enzimática da luciferase com emissão de fótons. À medida que os componentes da reação diminuem, um novo ciclo de reagentes é introduzido e então a incorporação de nucleotídeos específicos é avaliada de maneira sequencial.
4. Apenas o sequenciamento do genoma de uma espécie não é suficiente para gerar muitas informações relevantes acerca da mesma. O projeto transcriptoma ou genoma funcional se faz necessário para gerar maiores conhecimentos da biologia das espécies. Com base no que você estudou na matéria, descreva do que se trata o projeto transcriptoma e discorra sobre as possíveis complicações que podem atrapalhar a sua análise. 
Este projeto situa-se no campo da genômica funcional ou seja, a interpretação da função das sequências de DNA numa escala genômica. Para dar continuidade lógica à vasta quantidade de informações de seqüenciamento de DNA genômico e de cDNAs que estão sendo obtidas pelos projetos genoma humano e de outras espécies, precisamos começar já a coletar dados de natureza funcional. Medidas de expressão gênica em larga escala constituem um primeiro passo nesta direção. Com a disponibilidade de bibliotecas de cDNA humanas e de camundongos, além de outros organismos, e da robótica aplicada à biologia molecular, foi possível recentemente o estabelecimento da tecnologia dos DNA-arrays. Grande conjunto de clones, insertos e oligonucleotídeos são hibridados com sondas complexas preparadas de RNA total ou de RNAm de linhagens celulares ou de órgãos. Sob condições apropriadas, a aquisição quantitativa de sinais permite a medida da relativa abaundância de cada espécie de sequência de RNAm e portanto, da expressão gênica. Neste projeto, utilizaremos lâminas de vidro com alta densidade de clones de cDNA (micro-arrays) para serem hibridadas com sondas complexas fluorescentes preparadas a partir de RNA total (sondas de cDNA fluorescentes). Selecionamos três questões biológicas, que por sua complexidade só serão melhor compreendidas por meio de estudos de expressão gênica em larga escala. A primeira questão é relativa à expressão gênica durante a ontogenia do timo, pois este é um órgão chave no sistema imune, sede da maturação dos linfócitos T quando estes passam pela recombinação V(D)J dos receptores TCR, nosso objetivo é descrever um conjunto de genes expressos no timo na fase de gestação quando ocorre a recombinação V(D)J dos TCRs. A segunda questão é relativa à patogenia das doenças auto-imunes, pois em tais doenças o sistema imunológico passa a reagir contra componentes próprios do organismo. Estudaremos a expressão gênica no lúpus eritematoso sistêmico e na diabetes mellitus tipo 1 pois a etiologia genética das doenças auto-imunes ainda está em aberto. A terceira questão é relativa à instabilidade do genoma humano causada pela radiação ionizante. Pretendemos apontar um conjunto de genes são ativados e/ou reprimidos durante a indução de lesões no material genético pela radiação. (AU)
5. O que são animais Knockouts? Qual a importância desses animais? 
Ratos knockout são ratos (camundongos) geneticamente modificados aos quais os investigadores desactivaram ("knocked out") umgene existente, substituindo-o ou quebrando-o com um componente artificial de ADN. A perda da actividade desse gene leva frequentemente a alterações no fenótipo do rato, como a aparência, comportamento e outras características físicas e bioquímicas observáveis.
Os ratos knockout são modelos animais importantes no estudo do papel dos genes que tenham sido sequenciados, mas cujas funções ainda não tenham sido determinadas. Ao fazer com que um gene em específico seja inactivado, e observando as diferenças relativamente ao comportamento ou fisiologia regulares, os investigadores pode assumir a sua função provável.
Os ratos são actualmente a espécie de laboratório mais próxima dos humanos para a qual a técnica de knockout pode ser facilmente aplicada. São amplamente usados em experiências knockout, sobretudo as que investigam questões genéticas relacionadas com afisiologia humana.
6. Diferencie células tronco embrionárias das células tronco adultas. 
QUAL A DIFERENÇA ENTRE CT ADULTA E EMBRIONÁRIA?
As células-tronco adultas estão em diversos locais do corpocomo medula óssea, sangue, fígado e no cordão umbilical. Sua desvantagem é que só podem formar sangue, ossos, cartilagens e músculos. A célula-tronco embrionária vêm do embrião e é a única capaz de gerar todos os 216 tipos celulares existentes em um organismo, inclusive o nervoso.
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7. Diferencie a clonagem reprodutiva da clonagem terapêutica. Qual a implicância ética que a última traz? 
A Clonagem Reprodutiva é pretendida para produzir uma duplicata de um indivíduo existente. É utilizada a técnica chamada de Transferência Nuclear (TN): Baseia-se na remoção do núcleo de um óvulo e substituição por um outro núcleo de outra célula somática. Após a fusão, vai havendo a diferenciação das células Após cinco dias de fecundação, o embrião agora com 200 a 250 células, forma um cisto chamado blastocisto. É nesta fase que ocorre a implantação do embrião na cavidade uterina. O blastocisto apresenta as células divididas em dois grupos: camada externa (trofoectoderma), que vai formar a placenta e o saco amniótico; e camada interna que dará origem aos tecidos do feto. Após o período de gestação surge um indivíduo com patrimônio genético idêntico ao do doador da célula somática.
A Clonagem "Terapêutica" é um procedimento cujos estágios iniciais são idênticos a clonagem para fins reprodutivo, difere somente no fato do blastocisto não ser introduzido em um útero. Ele é utizado em laboratório para a produção de células-tronco (totipotentes) a fim de produzir tecidos ou órgão para transplante. Esta técnica tem como objetivo produzir uma cópia saudável do tecido ou do órgão de uma pessoa doente para transplante.
Concordamos que o embrião, mesmo com algumas horas de existência, já é um ser humano. A partir desse fundamento, as pesquisas que envolvam o sacrifício de embriões humanos, eufemisticamente denominadas de clonagem "terapêutica", são inaceitáveis pois desvirtuam o próprio sentido da investigação científica.
Aceitamos que existe limites éticos para a pesquisa científica e admitimos que é legítimo se buscar as soluções para os males que comprometem a humanidade - paraplegia, diabetes, Parkinson, etc - e os cientistas devem se empenhar nessa busca, mas não admitimos, como Jeramy Bentham, que TUDO se justifica para se atingir a maior felicidade do maior número de pessoas. Justaponho à esta idéia de sacrifício de alguns para a felicidade de todos a outra posição do materialista Sartre: é impossível se fazer o BEM à todos, como ele procura demonstrar em sua peça "O Diabo e o Bom Deus".
Reafirmamos que para reparar tecidos lesados é possível utilizar outras fontes de células-tronco que não as embrionárias humanas
8. O que é terapia gênica? 
Terapia gênica é a forma de tratamento que consiste na transferência de material genético exógeno para dentro de células de um indivíduo, objetivando conferir um benefício, melhorar alguma função defeituosa ou sanar alguma deficiência causada por um gene anormal.
10. O desenvolvimento de metodologias de DNA recombinante baseia-se na descoberta de: 
X 	a) reação de polimerase em cadeia (PCR). 
b) endonucleases de restrição. 2 
c) plasmídeos. 
d) DNA complementar (cDNA). 
e) cromossomos artificiais de leveduras. 
11. A técnica de PCR (reação em cadeia de polimerase), a mais utilizada para amplificação (clonagem) do DNA in vitro, revolucionou o acesso a informações genéticas. Com relação a essa técnica, assinale a opção correta. 
a) Na PCR, os primers (iniciadores) se hibridam com moléculas de DNA fita dupla. 
b) Com a PCR, a enzima Taq polimerase é capaz de manter sua atividade mesmo nas altas temperaturas necessárias para desnaturar a molécula de DNA. 
c) A PCR também pode ser aplicada na análise de proteínas. 
d) Com a PCR, a clonagem molecular necessita de 48 a 72 horas para ser executada. 
e) A PCR necessita ser acompanhada de um método de purificação para separar o fragmento amplificado do restante do genoma 
12. A transferência de embriões e a fecundação in vitro são técnicas de reprodução assistida utilizadas na aceleração do melhoramento genético. Esta informação está correta ou incorreta
Reprodução Assistida é um conjunto de técnicas, utilizadas por médicos especializados, que tem como principal objetivo tentar viabilizar a gestação em mulheres com dificuldades de engravidar.