Aula microscopia Farmacia 2013 2

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FUNDAMENTOS DE MICROSCOPIA
MICROSCOPIA
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
MICROSCOPIA ÓPTICA LUZ VISÍVEL
ELÉTRONS
Fundamentos da Microscopia
Microscópio eletrônico ≠ Microscópio elétrico!
Limite de resolução
Definição: É a menor distância entre dois pontos em que eles 
podem ser vistos como objetos distintos.
Limite de resolução do olho humano: ~ 0,2 mm
Limite de resolução (d)
d = 0,61  
NA
0,61  Constante determinada experimentalmente
  Comprimento de onda da radiação utilizada na observação
NA  Número de abertura (é considerada como sendo a quantidade 
de luz que efetivamente penetra na objetiva) 
Obs. Luz visível  ~ 550 nm. 
Limite de resolução do microscópio óptico: 200 nm (0,2m)
d = 0,61  
NA
d(1) = 0,61  550 nm = 450 nm (ou 0,45 µm)
0,75
d(2) = 0,61  550 nm = 240 nm (ou 0,24 µm)
1,4
Aumento (ou magnificação) não é tudo:
Qual a melhor objetiva de 100×? 
Uma com NA de 0,75 ou outra com NA de 1,4?
MICROSCOPIA ÓPTICA
Radiação empregada para obtenção da imagem: Luz visível
Espectro eletromagnético próximo da faixa da luz visível
Microscopia óptica 
Luz visível
Lentes !
Imagem direita 
e virtual
Imagem 
invertida real 
(projetada)
MICROSCOPIA ÓPTICA
MICROSCÓPIO COMPOSTO
Microscópio simples Microscópio composto
Microscopia óptica
Partes básicas de um microscópio
O caminho da luz em um microscópio
Lentes Objetivas &
Lentes Condensadoras
Lentes objetivas
Fabricante
Correção 
de aberração
Número 
de aberturaMagnificação
Lentes oculares
Número de abertura
d = 0,61  
NA = n sen



n = índice de refração do meio 
entre o espécime e a objetiva
Óleo de imersão: Quando e porque usar!
Só utilizamos óleo de 
imersão quando a objetiva 
tiver NA > 1,0
(o que ocorre normalmente 
com a objetiva de 100 )
Magnification N.A.
Theorectical 
Resolution 
(micrometers)
Practical 
Resolution 
(micrometers)
4X 0.10 3.05 3.40
10X 0.25 1.22 1.30
40X 0.65 0.47 0.52
100X 1.30 0.24 0.26
Expressão do aumento ou Magnificação em um 
microscópio.
Aumento fornecido pela lente objetiva  Aumento fornecido 
pela lente ocular
Ex. Aumento da objetiva 4
Aumento da ocular 10 
Aumento total = 4  10 = 40 
Microscopia óptica de campo claro
Problemas básicos:
-As células, em geral, são transparentes;
-São muito hidratadas e frágeis;
-Estão presentes em tecidos e órgãos que precisam 
ser cortados em lâminas finas o suficiente para 
permitir a passagem da luz.
Portanto temos pouco contraste em preparações simples:
Esfregaço não corado de 
epitélio da mucosa bucal 
observado em microscópio 
óptico de campo claro
Etapas da preparação de amostras para observação 
em microscópio óptico de campo claro:
-Fixação – visa a preservação da amostra, matando-a sem 
danificar muito sua estrutura. O formaldeido é um fixador 
bastante comum;
-Desidratação – Substituição da água por um solvente como 
metanol ou etanol. Evita que a deterioração e facilita a inclusão 
em resina;
-Inclusão em resina e microtomia – Resinas como a parafina 
enrijecem a amostra e permitem que sejam cortadas em fatias 
finas (microtomia);
-Coloração - Imprime contraste a diferentes constituintes da 
amostra (dependendo do corante utilizado). Existem dezenas de 
corantes, como azul de metileno, hematoxilina, eosina, etc.
Amostras não corada observada em microscopia 
óptica de campo claro
Esfregaço não corado de 
epitélio da mucosa bucal 
observado em microscópio 
óptico de campo claro
Microscopia óptica de campo claro
Amostras coradas
Túbulos seminíferos e espermatozóides. 
Giensa
Schistosoma mansoni. Giensa
Observação de células vivas. Obtenção de contraste na 
amostra. 
Utilização de filtros, lentes especiais e prismas em 
diferentes sistemas que produzem contraste pela forma 
como a luz interage com a amostra!
 Contraste de fase
 Contraste interferencial diferencial de Normanski
Configuração de um microscópio óptico de contraste de fase
Campo claro vs. Contraste de fase
Contraste interferencial-diferencial
Contraste interferencial diferencial
Campo claro Contraste de fase Contraste interferencial
Campo claro Contraste de fase
Contraste interferencial
Contraste interferencial diferencial
vs. 
Contraste de fase
Hemácias 
observadas em 
Microscopia 
óptica de 
contraste de 
fase
Hemácias 
observadas em 
Microscopia 
óptica de 
contraste 
interferencial
diferencial
Fibroblastos 
observados em 
Microscopia 
óptica de 
contraste de fase
Fibroblastos 
observados em 
Microscopia 
óptica de 
contraste 
interferencial
diferencial
Microscopia óptica de fluorescência
Fluorescência e corantes 
fluorescentes (fluoróforos)
Microscopia de fluorescência
Imunofluorescência para o 
citoesqueleto de Giardia intestinalis
Fluorescência para proteína 
citoplasmática
Vermelho – Retículo endoplasmático
Amarelo - Peroxissomos
Microscopia de fluorescência
Vermelho – Mitocôndrias
Azul - DNA
Verde – Filamentos de actina
Lilás – Filamentos intermediários (vimentinas)
Amarelo - Peroxissomos
Microscopia de fluorescência
Microscopia Óptica Confocal 
de Varredura a Laser
Cortes ópticos
Embrião de mosca
Fluorescência 
convencional
Microscopia 
confocal
Microscopia Óptica de Fluorescência Convencional 
Vs
Microscopia Óptica Confocal de Varredura a Laser
Microscopia Óptica de Fluorescência Convencional 
Vs
Microscopia Óptica Confocal de Varredura a Laser
Fluorescência 
Convencional
Confocal de 
Varredura a 
Laser
Fibras musculares Grão de Pólem
Reconstrução tridimensional de estruturas utilizando a
Microscopia óptica confocal de varredura a laser
Um sistema ideal de observação e registro em 
microscopia óptica pode combinar os vários 
recursos disponíveis em um único aparelho.
Microscópio óptico invertido
Pode ser equipado com recursos como contraste de fase, DIC ou fluorescência
Lente Condensadora
Lentes Oculares
Lentes Objetivas
Células humanas HeLa vivas mantidas em cultura
Combinação de técnicas de microscopia óptica
Contraste de fase Fluorescência
Microscopia Eletrônica
Microscopia eletrônica 
de Transmissão
Microscopia eletrônica 
de Varredura
Século XX 
Revolução nas ciências físicas:
Relatividade &
Mecânica quântica
Dualidade onda partícula: Toda partícula ou objeto em 
movimento possui uma “onda” associada! (De Broglie)
Elétrons são ondas e partículas simultaneamente!
Quanto maior a velocidade de um elétron, menor o seu 
comprimento de onda ().
d = 0,61  
NA
d = 0,2 A (0,02 nm)
Prêmio Nobel 
1986
1931- Construção do primeiro 
microscópio eletrônico.
Em microscopia eletrônica as “lentes” que focalizam o 
feixe de elétrons são bobinas eletromagnéticas: 
O microscópio eletrônico de transmissão
Filamento de tungstênio
Microscópio óptico e microscópio eletrônico
Na MET a imagem é visualizada em uma tela 
fluorescente, que acende ao impacto dos elétrons 
transmitidos!
Como é formada a 
imagem no 
microscópio 
eletrônico?
Amostra
Resolução
MO vs. MET
Preparação amostras 
para microscopia 
eletrônica de 
transmissão
3 mm
Número de identificação amostra
Amostra é incluída em resina para utramicrotomia
Bloco com 
amostraLâmina de 
diamante
Espelho
d’ água
Ultramicrótomo
Ultramicrotomia: preparando cortes ultrafinos
Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)no espelho d’água
Microscópio eletrônico de 
transmissão: imagens 
diversas
Glândula, MET
Epitélio intestinal, MET
Microscópio eletrônico de 
transmissão: imagens diversas
Cuidado na Interpretação das Imagens de Microscopia 
Eletrônica de Transmissão
M.O. campo claro, corado
Microscopía Eletrônica de Transmissão
O microscópio eletrônico de varredura
Imagens de superfície: sensação de profundidade!
O microscópio eletrônico de varredura (MEV)
Geração de elétrons secundários pela amostra
MET
MEV
Preparo de amostras 
para microscopia 
eletrônica de 
varredura
Metalização da superfície é necessária para que 
amostras biológicas gerem elétrons secundários
Inseto metalizado para ser observado 
em M. E. de Varredura
Microscópio Eletrônico de varredura (MEV)
Microscopia eletrônica 
de varredura vs. 
Microscopia óptica 
(Lupa estereoscópica)
Microscopia eletrônica 
de varredura vs. 
Microscopia óptica 
(campo claro, amostra 
corada)
Schistosoma mansoni , M. O. de campo claro.
Amostra corada com Giensa
Esmalte dentário, MEV
Microscópio eletrônico de varredura: imagens diversas
Ascaris, MEV
Microscópio eletrônico de 
varredura: imagens diversas
Microscópio eletrônico de 
varredura: imagens diversas
Fio de cabelo
Hemácias
Microscópio eletrônico de varredura: imagens diversas
Toxoplasma gondii penetrando 
em célula hospedeira
Bactérias (Streptococus)
sobre uma célula animal em cultura
Microscópio eletrônico de varredura de alta definição: 
Emissão de Campo (field emission) 
Citoesqueleto do tripanossomatídeo
Herpetomonas megaseliae
Sant’Anna et al., 2005. Improvement on the visualization of 
cytoskeletal structures of protozoan parasites using high-
resolution field emission scanning electron microscopy (FESEM). 
Histochem Cell Biol. v. 124, p. 87–95
Microscópio eletrônica: Não há cores!!!!
Trichomonas vaginalis interagindo com epitélio 
intestinal, MEV, colorido artificialmente
Comparação múltipla: MEV vs MET vs MO:
Estereocílios em células sensitivas no ouvido interno.
MEV
MET
MO-CID