Aula de nutrição e crescimento 2013

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14/6/2013
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Nutrição, cultivo laboratorial, 
reprodução e crescimento dos 
micro-organismos
Microbiologia I
Josilene Matos
Universidade Federal da Bahia
Instituto de Ciências da Saúde
Departamento de Biointeração
UFBA
Condições necessárias para o cultivo
 Fatores físicos: temperatura, pH e pressão osmótica.
 Fatores químicos: água, fontes de carbono,
nitrogênio, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo e
fatores orgânicos.
 Fatores metabólicos: enzimas e processos
associados aos fatores físicos e químicos.
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Nutrição microbiana
“ Nutrientes: todos os materiais utilizados pela célula
para a construção e manutenção da sua estrutura e
organização, inclusive como fonte de energia,
quando esta é de natureza química.”
Bier, O., Microbiologia e Imunologia, 24a. Ed.,
1985.
Nutrição bacteriana
 Degradação de macromoléculas por bactérias através da 
secreção de enzimas hidrolíticas (hidrolases), proteases, 
lipases, etc.
Nutrição microbiana
Mecanismo que fornece às células as ferramentas
químicas (nutrientes) necessárias à síntese de
moléculas celulares e produção de energia.
 Importância da nutrição:
• Torna possível a reprodução e crescimento bacteriano.
 Ex: Protéinas estruturais, enzimas, mureína, LPS,
polissacarídeos, ácido teicóico, ácidos nucléicos.
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Nutrição microbiana - principais 
elementos
Macronutrientes – Carbono
• Forma o esqueleto dos carboidratos, lipídeos e
proteínas.
• Principais fontes
Autotróficos: utilizam o CO2 como principal ou única
fonte de carbono.
Heterotróficos: utilizam compostos orgânicos como
principal fonte de carbono (proteínas, carboidratos,
lipídeos).
Macronutrientes
Nitrogênio
• Proteínas, ácidos nucléicos, mureína, ácido teicóico.
• Principais fontes (diversidade dependente da espécie
bacteriana)
Nitrogênio atmosférico (N2  NH4+) – fixação do
nitrogênio
Obtenção a partir de nitrato ou amônia
Nitrogênio orgânico (aminoácidos ou peptídeos –
fatores de crescimento).
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Macronutrientes
Enxofre
• Síntese de aminoácidos (cisteína e metionina) e
vitaminas (tiamina e biotina).
• Principais fontes: 
 Íon sulfato (SO42-) H2S
 Sulfito de hidrogênio (H2S)
Aminoácidos que contêm enxofre na estrutura
Macronutrientes
Fósforo
• Compostos orgânicos celulares - ATP, NADP, LPS,
fosfolipídeos da membrana celular e ácidos
nucléicos.
• Principais fontes:
Micro-organismo somente obtém na forma de fosfato
inorgânico (PO4-3)
 Potássio, magnésio e cálcio são necessários como
co-fatores para as reações enzimáticas.
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Classificação dos micro-organismos quanto às fontes de 
energia e carbono
Nutrição microbiana
Oligo-elementos ou elementos-traços
Elementos exigidos em quantidades muito
pequenas:
• Ferro, cobre, zinco, cobalto, manganês.
• Essenciais para a atividade de algumas enzimas.
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Fatores de crescimento
Compostos orgânicos que alguns micro-
organismos necessitam:
• Vitaminas, aminoácidos, purinas e pirimidinas
Micro-organismos fastidiosos
• Bactérias láticas: Lactobacillus, Leuconostoc,
Streptococcus, etc.
Cultivo Laboratorial
Meios de cultura
• Material nutriente preparado no laboratório para
o crescimento de micro-organismos (cultura).
Aplicação
• Isolamento e identificação de micro-organismos
Meios quimicamente definidos
Meios complexos (indefinidos)
• Composição química não definida
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Meio quimicamente definido
Meio complexo
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Quando se utiliza meios quimicamente 
definidos?
 Para determinar as necessidades nutricionais de um 
determinado micro-organismo.
 Cepa prototrófica
• Não requer qualquer suplemento orgânico para crescer
 Cepa auxotrófica
• Necessita de suplementos orgânicos em um meio mínimo 
para se desenvolver.
• Desenvolveu determinada necessidade nutricional em 
decorrência de uma mutação.
Cultivo de micro-organismos
 Cultivo de bactérias: meios de cultura
bacteriológicos.
 Cultivo de fungos: meios de cultura para fungos.
 Cultivo de vírus: ovo embrionado ou cultura de
células.
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Cultivo de bactérias
Meios de cultura bacteriológicos
• Caldo nutriente (líquido)
Extrato de carne
Peptona
Cloreto de sódio
Água
• Para solidificar, acrescentar ágar
Semi-sólido (0,3-05%)
Sólido (1,5-2%)
Meio líquido - caldo BHI
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Meio sólido em tubo - inclinado
Meio sólido em placa de Petri
Qual seria a vantagem dos 
meios sólidos?
Imobilizam as células e 
permitem a formação 
de colônias
• Características 
coloniais
• Pureza de uma cultura
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
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Como cultivar bactérias intracelulares? 
Culturas de células
• Cultivos homogêneos que podem ser
propagados e manipulados da mesma forma
que as bactérias.
• Clamídias, riquétsias e algumas espiroquetas
são cultivadas em culturas de células.
Meios de cultura - conservantes
 Finalidade bacteriológica:
1. Conservantes
• Contém substâncias que inibem as enzimas
autolíticas e previnem os efeitos da oxidação
• Transporte - Stuart / Amies
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Meios de cultura - seletivos
 Finalidade bacteriológica:
2. Seletivos
• Permitem o crescimento de um tipo particular de
micro-organismo e suprimem o crescimento de
outros.
• Mac Conkey/EMB
Microbelibrary.org (American Society of 
Microbiology)
Meios de cultura
 Finalidade bacteriológica:
3. Não-seletivos
• Permitem o crescimento de ampla variedade de
micro-organismos
• Ágar sangue
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Meios de cultura
 Finalidade bacteriológica:
4. De enriquecimento
• Aumentar o número de micro-organismos de
interesse até níveis detectáveis em uma população
mista.
• Caldo de tetrationato (Salmonella)
Meios de cultura - diferenciais
 Finalidade bacteriológica:
5. Diferenciais
• Estabelecem diferenças entre micro-organismos de
características parecidas
• Ágar sangue/SS
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Meios de cultura - indicadores
 Finalidade bacteriológica:
6. Indicadores
• Possuem substâncias que evidenciam a utilização de
determinados substratos
• Urease
Meios de cultura - redutores
 Finalidade bacteriológica:
7. Redutores
• Agente redutor presente no meio remove o oxigênio
para produzir o meio reduzido
• Tioglicolato de sódio – combina quimicamente com o
oxigênio dissolvido em um meio e torna-o não
disponível para os micro-organismos
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Crescimento e reprodução
microbianos
Crescimento e 
reprodução
 Crescimento
• Aumento no número de 
células
 Reprodução
• Fissão binária (maioria)
• Brotamento (micoplasmas, 
leveduras)
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Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
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Proteínas importantes no processo de 
divisão celular em bactérias
Proteínas homólogas às do citoesqueleto de
células eucarióticas:
• MreB (homóloga à actina) – forma celular,
segregação dos cromossomos e localização de
proteínas.
• FtsZ (homóloga à tubulina) – forma celular
regulação da divisão celular e segregação
cromossômica.
Proteínas Fts
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Tempo de geração
 Tempo necessário para uma célula se dividir, ou para
que a população duplique em número.
 Fatores que podem influenciar o tempo de geração:
• Composição nutricional e as condições físicas de
incubação.
Tempo de geração – são variados
• Escherichia coli 20 - 30 min
• Lactobacillus spp 70 - 85 min
• Mycobacterium tuberculosis 18 - 20 horas
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Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
CRESCIMENTO BACTERIANO 
 N= 2n 
O aumento do número de células de
uma cultura bacteriana em crescimentoexponencial ocorre em progressão
geométrica de quociente 2.
NF=No2n
logNF=logNo +nlog2
Representação gráfica logarítmica x aritmética 
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
N (n. de gerações)= logNF-logN0
log2
Exemplo: população final de 10.000.000.000
população inicial de 10
tempo de 20 horas
N= log1010-log101
0,3
N= 10-1 = 30 gerações
0,3
TG= tempo
N
TG= 20 horas x 60 (min)
30
TG= 1200
30
TG= 40 minutos
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Curva de crescimento
 É um gráfico que mostra a variação do número de
células viáveis (capazes de se reproduzir) em função
do tempo.
 Esta curva é traçada para uma população em um
sistema fechado (tubo contendo meio de cultura).
• Nenhum novo nutriente é adicionado ao sistema e
nenhum produto de excreção metabólico é removido.
Quais são as fases do 
crescimento microbiano?
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
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Métodos para quantificar diretamente o 
crescimento microbiano
 Contagem de colônias em placa
• Método Pour-Plate (semeadura em profundidade)
• Método de semeadura por espalhamento
 Filtração
 Contagem direta ao microscópio
• Câmara Petroff-Hausser
Método do número mais provável (NMP)
Diluição seriada– 30 A 
300 colônias
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
2010
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Madigan et al, 
Microbiologia de Brock,
2010
Contagem de colônias em placa
Contagem de colônias em placa
 É a técnica mais utilizada na determinação do
tamanho de uma população bacteriana.
 Vantagem:
• As células viáveis são quantificadas.
Desvantagem:
• Necessita tempo de incubação, em geral 24h.
Deve-se utilizar a diluição seriada.
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Contagem de bactérias pelo 
método de filtração
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Quando 
devemos 
filtrar?
Contagem direta ao microscópio
 Câmara de Petroff-Hausser
 Vantagem:
• Não necessita de período de incubação – resultado rápido.
 Desvantagens:
• Existe dificuldade para a contagem de bactérias móveis
• São quantificadas células viáveis e mortas.
• Limite de resolução do microscópio
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Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Câmara de contagem Petroff-Hausser
Método do número mais provável
 Utilizado para micro-organismos que não crescem bem em 
meio sólido.
A) diluição a partir de um alto volume de inóculo (ex. 10 mL)
B) diluição a partir de um médio volume de inóculo (ex. 1 mL)
c) diluição a partir de um baixo volume de inóculo (ex. 0,1 mL)
d) contagem do nº de tubos positivos
e) estimativa do nº de células/mL de bactérias
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Método do número mais provável
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Métodos indiretos na determinação do 
número de bactérias
 Turbidimetria
 Peso seco
 principalmente para fungos filamentosos
a) fungo é removido do 
meio por filtração
b) seco em dessecador
c) posterior pesagem
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Cultura contínua
 Manter uma população
microbiana crescendo
continuamente em uma taxa
particular, na fase logarítmica
 Quimiostato
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Efeitos ambientais no crescimento 
microbiano
Fatores físicos
• Temperatura
• pH
• Pressão osmótica
• Atmosfera gasosa (reposta ao oxigênio)
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Efeitos ambientais - Temperatura
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Por que logo 
acima da 
temperatura 
ótima, o 
crescimento cai 
dramaticamente?
Curva de crescimento x variação na 
temperatura 
Curva de crescimento característica de diferentes micro-organimos
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Madigan et al, 
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Crescimento de 
hipertermófilos
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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pH – acidez ou alcalinidade?
Maioria dos micro-organismos cresce melhor perto da 
neutralidade (pH 6,5 – 7,5);
Maioria das Bactérias: faixa entre pH 7,0 (neutrofílicos).
Exceções: 
• Bactérias acidófilas: alto grau de tolerância à acidez 
(Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5).
• Bactérias alcalifílicas: (Bacillus e Archaea) (pH 10 – 11).
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Efeitos ambientais – pressão osmótica
 Pressão osmótica
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
Madigan et al, Microbiologia 
de Brock, 2010
Concentração 
de sal
Halotolerantes: não 
necessitam de sal mas toleram 
a presença no meio.
Halófilos: necessitam de sal em 
uma concentração moderada.
Halófilos extremos: necessitam 
de sal em altas concentrações.
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Madigan et al, Microbiologia 
de Brock, 2010
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Halofílicos extremos
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Classificação de acordo com a atmosfera 
de cultivo
Aeróbios obrigatórios: 21% de oxigênio.
Anaeróbios obrigatórios: não podem crescer em presença do 
oxigênio. 
 Anaeróbios Facultativos: podem crescer na presença do oxigênio 
ou em anaerobiose.
Microaerófilos: oxigênio de 1 a 15%.
Anaeróbios aerotolerantes: anaeróbios que não morrem com a 
exposição ao oxigênio.
Utilização de oxigênio
AERÓBIO
ESTRITOS
alta [O2]
catalase
SOD
ANAERÓBIO 
ESTRITO
sem O2
ausência: 
catalase
SOD
MICRO
AERÓFILO
baixa [O2]
AERÓBIO 
FACULTATIVO
alta e baixa [O2]
catalase
SOD
alta e baixa [O2]
SOD
ANAERÓBIO 
AEROTOLERANTES
Catalase e a
superóxido
dismutase
reduzem para
H2O os
compostos
tóxicos.
Efeito do oxigênio sobre o crescimento de vários tipos de bactérias.
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Influência do oxigênio
Anaeróbios
• Não utilizam Oxigênio para as reações de
produção de energia, podendo ser mortos por ele.
Methanobacterium – anaeróbio estrito
Anaeróbio aerotolerante – Lactobacillus
Anaeróbio facultativo – Escherichia coli
Microaerófilo – Campylobacter jejuni
Aeróbio – Micococcus luteus
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Por que o O2 é tóxico para os 
anaeróbios?
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Enzimas que inativam o O2 tóxico
Superóxido dismutase
• Elimina os radicais 
superóxido, convertendo-os 
em peróxido de hidrogênio
Madigan et al, 
Microbiologia de Brock, 
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Incubação de anaeróbios
Métodos de produção de ambiente anaeróbio 
Tortora et al, 
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Incubação
Métodos de produção de ambiente anaeróbio 
Injeção de N2, H2 e CO2
Tortora et al, 
Microbiologia, 2012
LABEM
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Em posse dos conhecimentos adequados, é possível 
manipular micro-organismos das mais diversas formas